Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

242

до 5000 белков. Двухмерные электрофоретические пластины (карты) являются

своего рода «отпечатками пальцев», характерными для источника из которого

взят образец для анализа. Это своего рода «анатомия» на молекулярном уровне.

В настоящее время ведется каталогизация таких карт, полученных для различ-

ных тканей человеческого организма. Цель - использование этой информации в

диагностике заболеваний или при изучении развития заболеваний.

В качестве примера рассмотрим результаты эксперимента выполненного

Патриком О’Фарреллом по двухмерному разделению белков E. Coli (см рис.

4.11).

Рис. 4.11

Вид радиоавтограммы, полученной после разделения белков E. coli выращенных на среде с

меченными изотопом

С аминокислотах

Клетки E. Coli выращивали на среде, содержащей аминокислоты мечен-

ные радиоактивным изотоп

С. Затем лизировали клетки ультразвуком. 25 мкл

лизата (≅10мкг белка) наносили на гель в трубочках для проведения ИЭФ. По-

лученные после ИЭФ цилиндрики с гелем без трубочек укладывали вдоль края

размещенного между двумя пластинками геля и проводили электрофорез с

предварительной обработкой ДСН. По завершению электрофореза пластинки

помещались на рентгеновскую пленку для экспонирования радиоактивности,

меченных изотопом

С белков. После проявления пленки была получена соот

243

ветствующая карта белковой смеси (всего 1100 разрешенных пятен) из клеток

E.Coli.

4.5.3.9 Изотахофорез

В этом методе заряженные частицы разделяются вначале по их зарядам и

подвижности, а затем перемещаются в электрическом поле с одинаковыми ско-

ростями.

При проведении эксперимента проба вводится между ведущим и замы-

кающим электролитами. Ведущий электролит содержит ион с большей под-

вижностью, чем у ионов пробы. Замыкающий имеет ион с меньшей подвижно-

стью, чем у ионов пробы. Ионы ведущего, замыкающего электролитов и пробы

должны иметь один и тот же противоион.

Ведущие ионы движутся к аноду быстрее, чем частицы пробы. В резуль-

тате образуется некоторый градиент суммарной концентрации ионов, и, как

следствие, градиент напряженности электрического поля (из-за изменения со-

противления раствора). Это приводит к увеличению скорости движения ионов

пробы. Последние, однако, не могут проникнуть в зону ведущих ионов, по-

скольку напряженность электрического поля в этой области меньше и движе-

ние ионов пробы в ней замедляется. Таким образом формируется самостабили-

зирующаяся граница между ведущими ионами и ионами пробы.

По той же причине замыкающие ионы не могут опередить ионы пробы,

т.к. последние являются фактически ведущими для замыкающих ионов. Кроме

того, поскольку сами ионы пробы имеют различную электрофоретическую

подвижность, они распределяются между собой таким же образом на ведущие и

замыкающие. В результате этого компоненты анализируемой смеси разобьются

на отдельные зоны, которые в конечном итоге будут двигаться друг за другом с

одной и той же скоростью.

Если к пробе добавить амфолиты, то они, располагаясь между отдельны-

ми компонентами (зонами) смеси, обеспечат более отчетливое обособление зон.

244

Такие добавки называют «спейсерными» (разделяющими, раздвигающими).

Они фактически выполняют роль «прокладок» между отдельными компонен-

тами смеси.

Изотахофорез проводят, как правило, в ПААГ. По разрешающей способ-

ности изотахофорез приближается к ИЭФ.

4.5.3.10 Иммуноэлектрофорез

Это двухстадийный вариант электрофореза, предложенный в 1953г Пье-

ром Грабаром. Вначале смесь веществ разделяют методом гель-электрофореза,

а затем выявляют компоненты смеси посредством иммунодиффузии. Методом

иммуноэлектрофореза можно анализировать только те компоненты, которые

дают реакцию преципитации с антителами, т.е. в основном белки.

Исходная смесь

белков-антигенов

Канаквка с антисывороткой

(аннтителами)

Дужки, образованные осадками

преципитата

Проводят иммуноэлектрофорез на горизонтальных пластинках с исполь-

зованием агарового или агарозного гелей. Наносят однородный слой геля на

пластинку и в этом слое делают два углубления: одно в форме ямки, второе -

желобка (см.рис.). В ямку помещают смесь белков-антигенов и проводят обыч-

ный электрофорез. Белки смеси в ходе ЭФ движутся в соответствии с зарядами

их молекул и распределяются по пластинке. По завершению электрофореза в

245

желобок вносят антисыворотку с антителами. Антитела из сыворотки и распре-

делившиеся по пластине антигены начинают диффундировать навстречу друг

другу. При встрече антиген и антитело образуют нерастворимый комплекс ан-

тиген-антитело (преципитат), который выпадает в осадок. При этом образуются

видимые искривленные преципитатные линии (дужки) элипсоидной формы.

Положение этих дужек на пластине определяется коэффициентом диффузии

антигена, т.к. антитела имеют очень близкие массу и форму, а следовательно и

почти одинаковые коэффициенты диффузии. Количество образовавшихся ду-

жек соответствует числу различных антигенов, находящихся в смеси. Этот ме-

тод позволяет выявлять и разделять белки смеси с одинаковой электрофорети-

ческой подвижностью, но различными коэффициентами диффузии.

Пример практического использования ЭФ для определение pI белков

Как известно, pI аминокислот можно рассчитать, зная рК

их ионогенных

групп. Определить рI полипептида так нельзя. Поэтому, для нахождения рI

пептидов можно поступить следующим образом.

¾ Измерить подвижность пептида при нескольких различающихся величи-

нах рН.

¾ Построить график зависимости подвижности от рН (см. рис.).

-0,5

-0,3

-0,1

0,1

0,3

0,5

Электрофоретическая

подвижность,

246

¾ Определить из графика значение рН, при котором электрофоретическая

подвижность равна нулю.

Знание положения изоэлектрической точки для белка имеет важное зна-

чение при его выделении из смеси, поскольку при рН = рI растворимость белка

минимальна.

4.6 Хроматография

Метод хроматографии впервые был предложен в 19 веке для изучения

растительных пигментов (хрома). Отсюда и его название. В настоящее время

этот метод реализован в нескольких вариантах (газовая, газо-жидкостная, жид-

костная и т.д. хроматография).

В основе всех методов хроматографии лежит один принцип: непрерывный

поток подвижной фазы с растворенным в ней анализируемым образцом про-

ходит через стационарную (неподвижную) фазу. Последняя, в зависимости от

своей природы, по разному взаимодействует с отдельными компонентами

смеси образца. В результате, компоненты вымываются и движутся относи-

тельно неподвижной фазы с различными скоростями.

Таким образом, хроматография - это процесс разделения смесей компонентов, к

основе которого лежат различия в величинах констант распределения компо-

нентов между подвижной и неподвижной фазами. Универсальность метода

хроматографии, независимо от типа, связана со следующими основными фак-

торами:

наличием двух фаз (подвижной и неподвижной);

течение подвижной фазы относительно неподвижной обеспечивает очень

эффективный массообмен между ними и быстрое установление локальных рав-

новесий;

компоненты анализируемой смеси всегда должны быть растворимы в под-

вижной фазе и иметь некоторое сродство к неподвижной фазе, что обеспечива

247

ет специфичное распределение компонентов как между фазами, так и относи-

тельно неподвижной фазы;

условием успешного разделения смеси на отдельные компоненты есть

различие в их константах равновесия распределения.

Отдельные хроматографические методы различаются типом взаимодействий

между компонентами образца и неподвижной фазы. Это: ионный обмен, рас-

творимость, адсорбция или фильтрация, а иногда и их комбинация.

4.6.1 Метод бумажной хроматографии

Один из первых методов хроматографии примененной на практике - ме-

тод бумажной хроматографии (БХ). В нем неподвижной фазой служит лист

фильтровальной или хроматографической бумаги. Вначале бумага увлажняется

парами растворителя, что превращает ее в пригодную для хроматографирова-

ния стационарную фазу.

В биохимических исследованиях растворителем служит, как правило, вода.

Элюэнт - водно-органическая смесь совмещающихся между собой жидко-

стей (например, н-бутанол-вода; этилацетат-вода; бутанол-укс.к-та-вода; пи-

ридин-укс.к-та-бутанол-вода; фенол-вода и др. в различных объемных соот-

ношениях). Элюэнт перемещается по бумаге под действием капиллярных

сил.

На практике применяют восходящую, нисходящую и радиальную БХ.

Восходящая и нисходящая БХ. Опыты проводят так. На небольшом рас-

стоянии от конца (место старта) подготовленного для БХ листа бумаги наносят

каплю или узкую полоску (капиляром) анализируемого образца. Этот лист по-

мещают в герметически закрытый сосуд (стакан) с насыщенными парами элю-

энта так, чтобы точка старта была над поверхностью растворителя. Элюэнт,

двигаясь по бумаге увлекает за собой компоненты анализируемого образца.

Неподвижной фазой в БХ является фактически вода (полярное вещество). Под-

вижная фаза менее полярна из-за наличия в ней органического растворителя.

248

Это приводит к тому, что компоненты смеси образца по разному распределяют-

ся между неподвижной и подвижной фазами и, как результат, движутся по бу-

маге с различной скоростью вслед за фронтом элюэнта. Соединения, имеющие

большую растворимость в воде движутся медленнее, т.е. удерживаются непод-

вижной фазой сильнее тех, которые имеют большее сродство к водно-

органическому растворителю. Подвижность соединения в бумажной хромато-

графии принято выражать величиной R

расстояние, пройденное веществом

расстояние, пройденное фронтом элюэнта

Оба расстояния при вычислении R

отсчитываются от точки старта.

При анализе многокомпонентных смесей часто прибегают к двухмерной

БХ. Образец наносят в угол бумаги и пропускают элюэнт вначале в одном на-

правлении. Высушивают хроматограмму. Затем проводят хроматографирова-

ние этим же или другим элюэнтом в направлении перпендикулярном первому.

Подача элюэнта

Раиальное продвижение

компонентоов смеси

Радиальная БХ

Кроме нисходящей и восходящей используется еще и вариант радиальной БХ.

Смысл радиальной БХ ясен из приведенного рисунка.

4.6.2 Метод тонкослойной хроматографии

В методе тонкослойной хроматографии (ТСХ) используют твердую ста-

ционарную фазу нанесенную (и часто закрепленную) на пластине-подложке

249

(стеклянной, пластмассовой, алюминиевой). В качестве твердой фазы исполь-

зуют силикагели, окислы алюминия, ионообменные смолы (чаще всего моди-

фицированные целлюлозы) или носитель для гель-фильтрации (пористый гель,

например полиакриламид). Методически ТСХ выполняется так же как и БХ.

Методы бумажной и ТСХ применимы для анализа практически любых

смесей. Их достоинства: простота, высокие разрешающая способность и вос-

производимость, малое время анализа (20 мин. - 3 часа), высокая чувствитель-

ность (очень малый расход анализируемого образца).

Методы детектирования аминокислот

Методы детектирования и количественного определения аминокислот

после разделения методами БХ и ТСХ одинаковы. Хроматограммы опрыски-

вают 0.5% раствором нингидрина в ацетоне, просушивают и прогревают 30

мин. при Т=75

С. Аминокислоты проявляются в виде синих пятен. Эти пятна

вырезают. Окрашенный комплекс аминокислот с нингидрином экстрагируют

спиртовым раствором сернокислой меди и измеряют оптическую плотность

полученного раствора при 575 нм. По калибровочным кривым для соответст-

вующих аминокислот определяют их количества.

Некоторые аминокислоты можно анализировать (идентифицировать)

после хроматографирования использую специфические для них реакции (см.

разд. 1.1.7; 1.1.8). Так, например, гистидин и тирозин можно обнаружить, об-

работав хроматограмму диазотированной сульфаниловой кислотой в щелоч-

ной среде. Пятна гистидина и тирозина окрашиваются в красный и бурый цве-

та соответственно. Пролин и оксипролин дают интенсивную синюю окраску

при дополнительной обработке хроматограмм после нингидрина перекисью

водорода. Пятна для всех остальных аминокислот при этом обесцвечиваются.

250

4.6.3 Метод газо-жидкостной хроматографии

Метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) - это один из наиболее раз-

витых, доступных и эффективных методов хроматографии. Неподвижная фаза

в ГЖХ - твердый гранулированный пористый носитель, пропитанный жидким

сорбентом. Поэтому, для реализации газожидкостной хроматографии необхо-

димы три компонента: твердый носитель, жидкая неподвижная фаза, и газовая

подвижная фаза - элюэнт.

Твердый носитель

В качестве носителей для насадочных колонок в методе ГЖХ используют

специально приготовленные диатомитовые земли. Поверхность этих материа-

лов можно модифицировать различными способами. Наилучший результат дает

промывка сильными минеральными кислотами для удаления ионов металлов, и

последующая дезактивация поверхности силанизирующими реагентами. После

такой обработки поверхность носителя химически более инертна, чем у исход-

ного материала. В настоящее время ассортимент выпускаемых промышленно-

стью твердых носителей для ГЖХ достаточно велик и обеспечивает практиче-

ски любые запросы исследовательских лабораторий. Для анализа биологиче-

ских материалов используют чаще всего различные хромособры (хромосорб W,

например).

Неподвижная фаза

В принципе, неподвижной фазой в методе ГЖХ может служить практи-

чески любое вещество, которое можно закрепить на носителе, и которое имеет

низкую упругость паров при температуре проведения анализа. Ассортимент

выпускаемых промышленностью веществ для неподвижных фаз просто огро-

мен. В серийных биологических исследованиях находят применение чаще всего

силиконы (серии ХЕ - ХЕ-30, ХЕ-60, например) - относительно неполярные

251

жидкие фазы. Полиэфиры (например БДС - бутандиол-1,4-сукцинат, НПГГ -

неопентилгликольглутарат, ЭГА - этиленгликольадипинат, ПЭГА - полиэти-

ленгликольадипинат и многие др.) По полярности полиэфиры располагаются

между силиконами и полигликолями. Последние представляют собой доста-

точно полярные неподвижные фазы. Кроме того можно использовать различ-

ные поверхностно-активные, металлоорганические и другие соединения.

В качестве неподвижной жидкой фазы в ГЖХ нередко используют и сме-

си различных веществ.

Подвижная фаза

Подвижная фаза в ГЖХ - это, как правило, инертный газ (азот, гелий, во-

дород, аргон). В специальных целях могут использоваться и другие газы или

пары веществ (вода, аммиак и др.).

Основные понятия

Хроматографическая кривая (хроматографический пик) - кривая зависи-

мости концентрации (или какого-либо пропорционального концентрации пара-

метра) на выходе из колонки от времени с момента ввода пробы, или объема

прошедшего через колонку элюэнта. Идеальный хроматографический пик дол-

жен иметь форму правильной гауссовой кривой (равнобедренный треугольник).

На практике, однако, форма пика часто искажена либо по его фронту, либо по

тылу (так называемое размывание пика). Причины размывания пика весьма

разнообразны. Мы на них останавливаться не будем.

Время удерживания (t

) - время между вводом пробы и выходом макси-

мума концентрации компонента из колонки.

Время задержки газа (t

)- время удерживания абсолютно инертного (не

удерживаемого неподвижной фазой) вещества. Подобрать такое вещество ино-

гда очень трудно. Чаще всего таким веществом служит воздух (если детектор -

катарометр) или метан (если детектор по ионизации в пламени).

Ширина хроматографического пика (ω) - длина сегмента, измеренная ме-

жду точками пересечения нулевой линии с касательными, проведенных к точ