Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования
Подождите немного. Документ загружается.
332
5.3.5 Активированные соединения ряда гетероциклических амидов
5.3.5.1 Имидазолидный метод
Андерсон и Пол в 1958г. предложили использовать N,N’-
карбонилдиимидазол в пептидном синтезе. Реакция образования пептидной
связи с участием этого соединения протекает быстро и с высокими выходами.
Стандартная методика сводится к смешиванию N-защищенных амино-
кислот или пептидов в среде тетрагидрофурана, диметилформамида или хлори-
стого метилена с эквивалентным количеством N,N’-карбонилдиимидазола при
комнатной или более низкой температуре:
RC
O
OH
N
N
C
N
N
O
N
NH
C
N
N
O
O
C
O
R
CO
2
-
-
+
N
NCR
O
Активи
р
ованная по ка
р
боксильной
Г
ру
ппе N-за
щ
и
щ
енная аминокислота
Сразу по окончанию выделения СО
2
в реакционную смесь вводят амино-
компонент и проводят реакцию образования пептидной связи:
N
NCR
O
H
2
NR'
CR
O
NH R
N
NH
+
+
N,N’-карбонилдиимидазол чувствителен к наличию воды в реакционной
среде. Более устойчивыми к действию воды являются пиразолиды.
Пиразолиды N-защищенных аминокислот были получены Ридом и
Шлеймером в 1958г из гидразидов этих аминокислот по схеме:
333
R'' C
O
NH
NH
2
HO C CH
R'
C
R
O
H
2
O
+
-
NC
CHC
N
R'
R
CR
O
Пиразолид N-защ. А/к
Аминолиз пиразолидов с образованием пептидной связи протекает в бо-
лее жестких условиях, чем в случае имидазолидов. Требуется, в частности, ки-
пячение в среде этанола или тетрагидрофурана.
5.3.6 Активация путем образования производных оксазола
При одновременном действии ряда реагентов на амино- и карбоксигруп-
пы аминокислот могут образовываться различные производные оксазола:
O
CHC
N
C
R
O
R'
O
CHC
C
R
O
R'
H
HN
O
CHC
C
R
O
HN
O
Оксазолон
(азлактон)
Оксазолидинон-5
Оксазолидиндион-2,5
Оксазолоны, в частности, можно получить отщеплением воды от ацила-
минокислот:
R'CO NH CH COOH
R
(Ac
2
O)
H
2
O
-
O
CHC
N
C
R
O
R'
Аминолиз оксазолов приводит к образованию пептидной связи:
O
CHC
N
C
R
O
R'
H
2
NR''
R' CO NH CH C NH
O
R''
R
334
Оксазолидиноны-5 получают взаимодействием между ациламино- или
карбобензоксиаминокислотами и формальдегидом в присутствии п-
толуолсульфокислоты:
R''CONHCHCOOH
R
HC
O
H
+
O
CHC
C
R
O
H
N
H
R''CO
H
2
O
-
Расщепление оксазолидинонов под действием эфиров аминокислот приводит к
образованию пептидной связи:
O
CHC
C
R
O
H
N
H
R''CO
H
2
N R'''
R''CO N CH C NH R'''
CH
OR
OH
R'
+
5.3.7 Синтез пептидов путем активирования аминогруппы
Аминогруппа, в отличие от карбоксильной, способна к образованию пеп-
тидной связи без дополнительной активации. Это обусловлено наличием сво-
бодной электронной пары на атоме азота. Предполагается, поэтому, что синтез
пептидов путем активирования аминогруппы протекает в действительности че-
рез стадию образования промежуточного интермедиата с активированной кар-
боксильной группой. Этот интермедиат может быть продуктом присоединения
активированного аминокомпонента к карбоксильной группе и представлять со-
бой смешанный ангидрид.
К методам пептидного синтеза путем активирования аминогруппы отно-
сят изоцианатный метод, фосфоразо-метод, метод с применением эфиров фос-
фористой и мышьяковистой кислот, фосфорного ангидрида.
Всем этим методам, как и методу смешанных ангидридов, присущ один
существенный недостаток - высокая вероятность рацемизации.
335
5.3.8 Получение пептидов с помощью ферментов
Некоторые протеолитические ферменты, такие например как пепсин, хи-
мотрипсин, папаин и др. способны синтезировать пептидную цепь. Фермента-
тивный пептидный синтез протекает в исключительно мягких условиях. Хими-
ческие методы синтеза пептидной связи в этом отношении не могут конкуриро-
вать с ферментативными. Метод ферментативной полимеризации не позволяет
пока получать полипептиды большой молекулярной массы, однако результаты
исследований в этом направлении являются интересными и обнадеживающими
.
5.4 Рацемизация аминокислот в пептидном синтезе
Вероятность рацемизации аминокислот в ходе пептидного синтеза в раз-
личных методах существенно варьирует. До настоящего времени не было обна-
ружено рацемизации при использовании азидного метода.
Метод п-нитрофениловых эфиров в оптимальных условиях проведения
пептидного синтеза также не обнаруживает рацемизации. В менее благоприят-
ных условиях степень рацемизации может достигать 20% и более. Особенно
легко рацемизуются п-нитрофениловые эфиры N-защищенных аминокислот в
щелочных средах.
N,N’-дициклогексилкарбодиимидный метод - в оптимальных условиях
(температура - 5
0
С; свободные аминоэфиры; неполярные среды) практически не
приводит к рацемизации. В общем случае на степень рацемизации очень боль-
шое влияние оказывает природа растворителя. Одним из наиболее неблагопри-
ятных в этом отношении растворителей является диметилформамид. В нем при
комнатной температуре наблюдались случаи рацемизации более, чем на 50%.
Метод смешанных эфиров с моноэфирами угольной кислоты приводит к
рацемизации даже в оптимальных условиях проведения процесса. Большое
влияние на степень рацемизации оказывает растворитель.
336
Фосфоразо-метод характеризуется очень высокой степенью рацемиза-
ции, уменьшить которую не удается даже понижением температуры проведе-
ния реакции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Химия белка./ И.П.Ашмарин, А.А.Мюльберг, Н.В.Садикова,
И.А.Светинский/ Л., изд-во ЛГУ., ч.1- 1968г (196с.); ч.2 - 1971г (111с.)
2. Методы практической биохимии. Под ред. Б.Уильямса, К.Уилсона. М.,
Мир.- 1978.- с.268
3. Г.Шульц, Р.Ширмер. Принципы структурной организации белков. М.,
Мир.- 1982.- с.354
4. Е.М.Попов. Естествознание и проблема белка. М., Высшая школа.
1989.- с.416
5. А.Н.Шамин. История химии белка. М., Наука. 1977.- с.350
6. В.Т.Иванов, А.Н.Шамин. Путь к синтезу белка. Л., Химия. 1982.- с.176
7. Дж.Гринштейн, М.Виниц. Химия аминокислот и пептидов. М., Мир.
1965.-
8. Э.Шредер, К.Любке. Пептиды. М., Мир. 1967.- т.1.- с.496
9. Э. Гросс, И.Майенхофер. Пептиды. Основные методы образования
пептидных связей. М., Мир. 1983.- с.421
10. А.А.Гершкович, А.А.Кибирев. Синтез пептидов. Реагенты и методы.
Киев, Наукова думка. 1987
11. Практическая химия белка. Под ред. А.Дарбре. М.: Мир. 1989.- 621с.
12. А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит, и др. Основы биохимии, в трех томах. М.:
Мир. 1981
13. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. Пер с англ.
под ред. акад. Ю.А.Овчинникова. М.: Мир, 1974.- 462с.
14. С.Е.Бреслер. Введение в молекулярную биологию. М.-Л.: изд.АН
СССР, 1963.- 401с.
15. Дж.Бейли. Методы химии белков. Пер.с англ. под.ред.акад.
А.Е.Браунштейна. М.: Мир, 1965.
16. В.М.Степанов. Молекулярная биология, структура и функции белков.
М.: Высшая школа, 1996.- 335с.
17. Г.Липсон, Г.Стипл. Интерпретация порошковых рентгенограмм. М.
Мир.1972.- 384с.
18. М.А.Порай-Кошиц. Основы структурного анализа химических
соединений. М. Высшая школа. 1982.- 151с.
19. Р.Бохински. Современные воззрения в биохимии. М.: Мир, 1987.- 543с.
20. А.Ленинджер. Биохимия. М.: Мир, 1976.- 957с.
21. Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин. Биологическая химия. М.: Медицина,
1990.- 543с.
22. М.В.Волькенштейн. Молекулярная биофизика. М.: 1975.- 616 с.
23. Э.Доис. Количественные проблемы биохимии. М.: Мир. 1983.- 373с.
24. Р.Досон, Д.Эллиот, У.Эллиот, К.Джонс. Справочник биохимика. М.:
Мир. 1991.- 544с.
25. Я.Мусил, О.Новакова, К.Кунц. Современная биохимия в схемах. м.:
Мир. 1984.- 216с.
26. Ю.А.Владимиров. Фотохимия и люминесценция белков. М.: Наука.
1965.- 232с.
27. В.С.Данилов, Н.С.Егоров. Бактериальная биолюминесценция. М.:
МГУ. 1990.- 152с.
28. Д.Фрайфелдер. Физическая биохимия. М.: Мир, 1980.-- 582 с.
29. Р.Давид. Введение в биофизику. М.: Мир. 1982.- 207 с.
30. Биохимия человека /Р.Марри, Д.Греннер, П.Мейес, В.Родуэл//.
М.:Мир.- 1993.- тт.1,2.
31. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высш. шк., 2000.-
479 с.
32. Молекулярные структуры: Прецизионные методы исследования. Пер. с
англ. Под ред. А.Доменикано, И.Харгиттаи. М.: Мир, 1997.- 671 с.
СОДЕРЖАНИЕ
(Так как в первоисточнике с нумерацией страниц до третьей главы был
некоторый бардак, сохранившийся и здесь, в содержании указаны номера
страниц данного pdf-документа)
ПРЕДИСЛОВИЕ………………………………………….…………………………2
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………….4
ГЛАВА 1………………………………………………………………………….…17
1.1 Аминокислоты……………………………………………………………….…17
1.1.1 Распространение, структура и свойства аминокислот…………………….17
1.1.2 Номенклатура аминокислот…………………………………………………18
1.1.3 Классификация аминокислот…………………………………………….….18
1.1.4 Стереоизомерия аминокислот ………………………………………………26
1.1.5 Электронные спектры поглощения и кислотно-основные свойства
аминокислот в растворах…………………………………………………………..30
1.1.5.1 Буферные системы. Уравнение Гендерсона-Хассельбальха…...……….30
1.1.5.2 Кислотно-основные свойства аминокислот…………………………...…37
1.1.5.3 Буферные системы крови………………………………………………….44
1.1.6 Физические и химические свойства аминокислот……………....…………46
1.1.6.1Реакции по a-карбоксильной группе………………………………………47
1.1.6.2 Реакции по a-аминогруппе………………………………………………...49
1.1.7 Групповые реагенты на аминокислоты…………………………………….54
1.1.8 Специфические реагенты на аминокислоты…………………………….....60
ГЛАВА 2……………………………………………………………………...…….67
2.1 Структура белков………………………………………………………………67
2.1.1 Установление аминокислотного состава белков.…………………...……..67
2.1.2 Установление структуры С-концевых остатков пептидных цепей……....72
2.1.3 Установление структуры N-концевых остатков пептидных цепей……....75
2.1.4 Фрагментация белковых цепей………………………………………...……77
2.1.4.1 Ферментативная фрагментация………………………………………...…78
2.1.4.2 Характеристика протеаз с высокой специфичностью………………...…81
2.1.4.3 Характеристика протеаз с широкой специфичностью…………………..84
2.1.5 Химическая фрагментация…………………………………………………..86
2.1.5.1 Механизмы реакций химической фрагментации…………...……………87
2.1.5.2 Установление аминокислотной последовательности фрагментов
белковых молекул…………………………………………………………...…….96
2.1.5.3 Секвенирование пептидных цепей на твердофазных носителях……….102
2.1.5.4 Предварительные исследования белков перед секвенированием……...106
2.2 Постранственная структура белков…………………………………………..111
2.2.1 Структурная роль пептидной связи………………………………………...111
2.2.1.1 Геометрические параметры пептидной связи……………………………112
2.2.2 Вторичная структура белков…………………………….……..……………115
2.2.2.1 Спиральные структуры……………………………………………......…..115
2.2.2.2 Структура складчатого листа……………………………………………..122
2.2.3 Третичная структура белков……………………………………...…………124
2.2.4 Четвертичная структура белков……………………...……………………..130
2.2.4.1 Функциональное значение четвертичной структуры белка…………….133
2.2.4.2 Гибридные олигомерные белки……………………………………..……134
2.2.5 Домены в белках……………………………………………………………..135
2.3 Поведение белков в растворах……………………………………………..…137
2.3.1 Кислотно-основные свойства белков……………………………………....137
2.3.2 Осаждение белков из растворов в виде солей………………..……………140
2.3.3 Растворимость белков и факторы ее определяющие……...………………140
2.3.3.1 Зависимость растворимости белков от рН среды………...……………..140
2.3.3.2 Зависимость растворимости белков от ионной силы раствора……...…142
2.3.3.3 Зависимость растворимости белков от полярности растворителя……..143
2.3.3.4 Зависимость растворимости белков от температуры………………...…144
2.4 Осмос и мембранное равновесие………………………..……………………144
ГЛАВА 3 Белки кровеносной и мышечной тканей...............................................148
3.1 Кровеносная система……………………………………………………....…..148
3.1.1 Химический состав крови…………...………………………………………148
3.1.2 Характеристика основных белковых фракций плазмы……………………151
3.1.2.1 Отдельные белки плазмы………………………………………………….153
3.1.3 Транспорт кислорода кровью……………………………………………….154
3.1.4 Синтез белков плазмы……………………………………………………….155
3.1.5 Система свертывания крови…………………………………...……………155
3.1.5.1 Факторы плазмы……………………………………………………….......156
3.1.5.2 Факторы тромбоцитов…………………………………………....………..158
3.1.5.3 Схема процесса свертывания крови…………………………………....…159
3.1.5.4 Противосвертывающая система крови………………………...…………161
3.1.5.5 Фибринолиз……………………………………………………...…………161
3.2 Белки сократительной системы…………………………………………....….163
3.2.1 Организация скелетных мышц…………………………………………...…164
3.2.2 Функции белков мышечной ткани………………………………………….171
3.2.2.1 Миозин…………………………………………………………………...…171
3.2.2.2 Актин………………………………………………………………………..174
3.2.2.3 Актомиозин……………………………………………………………....…175
3.2.2.4 Тропомиозин А, В………………………………………………………….176
3.2.2.5 Минорные белки мышц……………………………………………………176
3.2.3 Механизм мышечного сокращения…………………………………………177
3.2.3.1 Источники энергии мышечного сокращения………………………….....179
3.2.3.2 Особенности химического состава сердечной мышцы………………….182
ГЛАВА 4 Методы экспериментального исследования структуры белков..........184
4.1 Размер и форма белковых молекул ……………………………………...……184
4.2 Оптические свойства белков…………………………………..………………187
4.2.1 Дисперсия оптической активности………………………………………….190
4.2.2 Поглощение белками света в УФ-, видимой и ИК-областях спектра...…..193
4.3 Методы очистки белков………………………………………………..………194
4.3.1 Частные методы разделения белков……………………………………...…195
4.3.2 Контроль чистоты выделяемого белка……………………………………...198
4.3.3 Оценка полноты очистки и гомогенности белков………………………….201
4.4 Методы определения молекулярной массы белков……………………...…..203
4.4.1 Определение молекулярной массы по осмотическому давлению……...…205
4.4.2 Определение молекулярной массы по давлению насыщенных паров…....206
4.4.3 Определение молекулярной массы методами эбулиоскопии
и криоскопии……………………………………………………………………..…208
4.4.4 Определение молекулярной массы методом светорассеяния……………..208
4.4.5 Определение молекулярной массы методом гель-фильтрации………...…211
4.4.6 Определение молекулярной массы белков методом
ДСН-гельэлектрофореза………………………………………………………....…212
4.4.7 Определение молекулярной массы методом седиментации……………....213
4.4.7.1 Устройство ультрацентрифуги…………………………………………….215
4.4.7.2 Определение молекулярной массы по скорости седиментации……...…218
4.4.7.3 Метод седиментационного равновесия………………………………...…221
4.4.7.4 Метод приближения к седиментационному равновесию………………..222
4.4.7.5 Диффузия и коэффициент диффузии…………………………………..…223
4.5 Методы разделения белков………………………………………………….…224
4.5.1 Электрофорез………………………………………………………………....224
4.5.2 Физические основы электрофореза белков…………………………………225
4.5.3 Экспериментальные методы электрофореза………………………………..227
4.5.3.1 Фронтальный электрофорез…………………………………...…………..228
4.5.3.2 Электрофорез на бумаге…………………………………………………...230
4.5.3.3 Электрофорез на полосках ацетата целлюлозы……………………….....232
4.5.3.4 Электрофорез в полиакриламидном геле………………………...………232
4.5.3.5 Диск-электрофорез…………………………………………………………233
4.5.3.6 ДСН-электрофорез…………………………………………………………235
4.5.3.7 Метод изоэлектрофокусировки………………………………………....…236
4.5.3.8 Двухмерный электрофорез……………………………………………...…240
4.5.3.9 Изотахофорез……………………………………………………………….242
4.5.3.10 Иммуноэлектрофорез……………………………………………………..243
4.6 Хроматография…………………………………………………………………245
4.6.1 Метод бумажной хроматографии…………………………………...………246
4.6.2 Метод тонкослойной хроматографии…………………………………...….247
4.6.3 Метод газо-жидкостной хроматографии………………………………...…249
4.6.4 Ионообменная хроматография………………………………………...……254