Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

252

кам перегиба восходящей и нисходящей ветвей хроматографического пика.

Ширину пика характеризуют нередко длиной отрезка, проведенного парал-

лельно нулевой линии между точками восходящей и нисходящей ветвями пика

на половине его высоты.

¾ Высота пика (h) - расстояние от нулевой линии до т. максимума хромато-

графической кривой.

¾ Площадь пика - площадь заключенная между хроматографической кривой

и нулевой линией. Определяют величину этой площадь различными способа-

ми. Рассчитывают по формуле площади треугольника (если пик правильный),

разбивают на мелкие квадраты или прямоугольники, вырезают нанесенные на

бумагу пики и взвешивают и т.д. Современные хроматографы снабжены, как

правило, электронными интеграторами, которые ведут расчет площадей авто-

матически. Смысл перечисленных параметров проиллюстрирован на рис. ниже:

∆

Момент ввода пробы

Площадь (S)

Параметры удерживания вещества

Приведенное время удерживания (t’

) - время удерживания компонента за

вычетом времени задержки газа (см.рис.):

253

t’

= t

- t

Величины t

и t’

сильно зависят от условий и режима хроматографирования,

поэтому они редко используются для характеристики удерживания вещества

неподвижной фазой. Менее чувствительными к условиям анализа являются

объемы удерживания.

Удельный объем удерживания (V

) - произведение времени удерживания

на объемную скорость (v) потока подвижной фазы (газа-носителя) на выходе из

колонки:

Vtv

¾ Мертвый объем (V

) - объем удерживания не адсорбирующегося на не-

подвижной фазе абсолютно инертного вещества:

Vtv

Приведенный объем удерживания (V’

) - разность объемов V

и V

V’

= V

- V

Исправленный объем удерживания (V

) . Величина V

зависит от скорости

потока подвижной фазы. В ГЖХ это учитывают через коэффициенты Джеймса-

Мартина (j)

= jV

Коэффициент емкости колонки (k’) определяется соотношением:

k’ = (t

- t

)/t

Параметры, характеризующие разделение двух веществ

Относительное удерживание (α) веществ 1 и 2 есть по определению одно

из следующих отношений:

α = (t’

)

/(t’

)

= k

’/k

’ = (V

’)

/(V

’)

Величина α зависит от типа неподвижной фазы и температуры. Мало зависит

от природы, скорости потока и давления газа-носителя.

Индекс удерживания Ковача (I). Один из наиболее важных для практики

параметров удерживания. Введен Ковачем. Из-за наглядности, простоты опре

254

деления и незначительной чувствительности к условиям анализа эти индексы

табулированы для многих веществ и неподвижных фаз. Индекс I определяется

по отношению к двум стандартным нормальным алканам (1 и 2), между пиками

которых расположен пик анализируемого вещества (см. рис.)

)

Момент ввода пробы

)

Стандартные н/алканы 1, 2

Величина I

для вещества (X), пик которого расположен между пиками

двух нормальных алканов (1 и 2) (см. рис.) вычисляется по формуле:

RX R

−

100 100

lg( ' ) lg( ' )

где Z - число атомов углерода в первом алкане.

Помимо индексов Ковача, в практику ГЖХ пытались вводить и более

сложные индексы, рассчитываемые на основе времен удерживания от 3 до 10

реперных соединений. Они более точны, однако требуют больших затрат на их

определение и широкого распространения не получили.

Степень разделения. Степень разделения двух соседних пиков на хрома-

тограмме оценивают уравнением:

∆

1,2

−

() ()tt

ωω

255

При количественном анализе степень разделения должна быть не менее

1.5. Если высоты двух соседних пиков существенно различны, то ∆

1,2

должна

быть еще больше.

4.6.4 Ионообменная хроматография

Основы принципа ионного обмена заложил русский ботаник-физиолог и

биохимик Михаил Семенович Цвет. В 1910 г. им опубликованы теоретические

основы метода ионного обмена. В 1948 г. американские ученые Мур и Стейн

разработали теорию ионообменной хроматографии в приложении к фракцио-

нированию сложных смесей аминокислот и внедрили ее в практику. В этом ме-

тоде использованы ионообменные полимеры (ионообменные смолы). В качест-

ве таковых применяют синтетические полистирольные полимеры, цепи в кото-

рых сшиты дивинилбензолом, или природные полимеры на основе целлюлозы

или сефадекса. Сефадекс - это природный полимер декстран, который является

полисахаридом (полимером глюкозы) с ММ от 12млн до 1 млрд. и вырабатыва-

ется особыми бактериями. Сефадексы получают в виде гранул после сшивания

эпихлоргидрином (ЭХГ) длинных нитей декстрана поперечными связями. В за-

висимости от количества введенного ЭХГ (соответственно числа поперечных

сшивок) получают сефадексы с различными размерами ячеек (пор) молекуляр-

ных сит. В зависимости от величин пор через них могут проникать белки с оп-

ределенными ММ. Например, сефадексы: Г-25 до 400; Г-50 до 10 000; Г-75 до

50 000; Г-100 до 100 000; Г-200 до 200 000.

Все вышеназванные полимеры после модификации содержат на своей

поверхности способные к диссоциации ионогенные группы, которые могут об-

мениваться ионами с соответствующими группами аминокислот или белков.

Ионообменные смолы подразделяются на два больших класса: катиониты (ка-

тионообменники) и аниониты (анионообменники).

Катионообменные смолы содержат на поверхности такие группы:

256

•

-SO

-M

, -РО

2—

-М

, AsO

2—

-M

- сильные катионообменники.

• -СОО

—

-М

- слабый катионообменник.

Анионообменники:

• -N

, -C

- сильные

• -N

, -N

R/A

, -N

- слабые

, А

- участвующие в ионном обмене катион и анион смолы соответст-

венно.

Синтетические ионообменники применяют чаще для анализа смесей ами-

нокислот. Белки разделять с их помощью тяжело по следующим причинам.

Они имеют низкую емкость в отношении белков. Это связано с наличием

в полимерной сетки смолы большого числа сшивок из-за чего молекулы белков

не могут проникать внутрь ионообменника, а взаимодействуют только с его по-

верхностью.

Эти смолы содержат большое число ионогенных групп (примерно через

каждые 10Å). В результате белок прочно удерживается смолой и его трудно вы-

теснить элюэнтом. Значительно лучшими смолами для белков являются при-

родные ионообменники, в которых намного меньше сшивок, а ионогенные

группы расположены с интервалом ≅50Å.

Хорошими ионообменниками для анализа белков являются.

¾ Карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза). Часть гидроксильных групп

целлюлозы замещены в этом катионите на группы -ОСН

СООН, которые после

обработки щелочью переходят в солевую форму -ОСН

СООNa. Слабый катио-

нит, обменивает катион натрия.

¾ Сульфоэтилцеллюлоза (SE-целлюлоза) содержит группу -

OCH

H(Na) - сильный катионообменник.

257

¾ Диэтиламиноцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - один из эффенктивных для

анализа белков анионообменник. Часть гидроксильных групп в ней заменена на

группы -OCH

-N(C

)

. Их переводят в ОН

или Cl

- формы:

[OCH

-N

H(C

)

]•OH

, [OCH

-N

H(C

)

]•Cl

Анионообменники более эффективны для разделения кислых и нейтраль-

ных белков, катионообменники - для разделения основных белков.

4.6.4.1 Процедура хроматографирования белков методом

ионообменной хроматографии

Разделение смесей веществ на компоненты является одной из сложней-

ших задач химии. На данный момент нет способов, которые гарантировали бы

абсолютно полное разделение. Все существующие методы разделения смесей

есть по сути своей методы разделения смеси на фракции, в большей или мень-

шей степени обогащенные каким-либо одним компонентом.

В хроматографии, разделение на фракции достигается пропусканием сме-

си веществ через колонку с неподвижной фазой или сорбентом, который удер-

живает разные вещества с различной эффективностью только в тех случаях, ес-

ли эти вещества обладают достаточно выраженными различиями в химических

или физических свойствах. Если различия невелики приходится увеличивать

длину колонки, уменьшать размеры частиц сорбента (увеличивать площадь со-

прикосновения). Как результат, сопротивление прохождению раствора через

колонку резко возрастает. Это одна из трудных позиций в технике жидкостной

хроматографии. Современные насосы жидкостных хроматографов развивают

давление до 1-10 тыс.атм, что делает сами хроматографы дорогими и малодос-

тупными приборами. Чаще, поэтому, прибегают к более простым приемам

обычной колоночной хроматографии.

Суть этих методов. Ионообменную смолу, обрабатывая кислотой или ще-

лочью, переводят в активную форму и помещают в стеклянную колонку. В

верхнюю ее часть вводят раствор смеси белков в подходящем буферном рас

258

творе. На этой стадии происходит связывание белков со смолой-

ионообменником и уже здесь происходит первичное их распределение (не-

большое размывание) по колонке. Более склонные к связыванию с ионообмен-

ником белки остаются в самой ее верхней части, менее активные - продвигают-

ся вслед за буферной смесью на большее расстояние. Причины различной спо-

собности белков вытеснять подвижные ионы из ионообменной смолы связаны с

неодинаковыми числом и природой заряженных групп в их пептидных цепях,

различиями в размерах белковых молекул и их конформации.

Следующая стадия - элюирование. Это процесс вытеснения закрепленных

на ионообменнике белков солевыми растворами высокой концентрации. На

этой стадии происходит регенарация ионобменника в результате вытеснения

ионами соли связанных со смолой функциональных групп белковых молекул.

При этом, легче вытесняются и быстрее элюируются из колонки белки, которые

обладают меньшим сродством к ионообменнику. На этой стадии первичный

эффект размывания смеси вдоль колонки резко усиливается и смесь постепенно

разделяется на обогащенные каким -либо одним компонентом фракции. Разде-

ляющую способность колонки можно повысить, если по ходу элюирования на-

ращивать концентрацию солей (так называемое градиентное элюирование).

Иногда оказывается полезными вариации рН раствора элюэнта. Короче говоря,

в каждом конкретном случае экспериментатор должен искать и находить наи-

более подходящие условия для достижения наиболее полного и четкого разде-

ления смеси на фракции.

Выходящий из колонки элюат собирают небольшими порциями (1-3 мл.)

и анализируют на содержание в них белков. Для этих целей применяют коллек-

торы фракций.

Эффективность разделения смесей белков на колонках с ионообменника-

ми достаточно высока. Удается разделять, как правило, даже весьма сложные

смеси с незначительными различиями в свойствах компонентов. В качестве

примера можно привести результаты разделения смеси пепсина и пепсиногена

259

на ДЭАЭ-целлюлозе. Оба белка относятся к кислым. Поэтому их хроматогра-

фическое разделение проведено на анионообменнике при рН=5.6 в ацетатном

буфере, т.е. в условиях наличия на молекулах отрицательного заряда. Элюиро-

вание проводили раствором с нарастающей концентрацией хлористого натрия в

ацетатном буфере с рН=5.6. Вид полученной в эксперименте хроматограммы

приведен на рисунке. Как видно, в эксперименте достигнуто достаточно четкое

разделение белков, несмотря на то, что различия между ними как по молеку-

лярной массе, так и по количеству и характеру ионогенных групп и др. свойст-

вам очень незначительны.

0 20 40 60 80 100

Объем элюэнта, мл

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Концентрация белка

в единицах оптической плотности

(

= 280 нм)

пепсиноген

пепсин

Недостатки ионообменной колоночной хроматографии. Основной - это

большие потери белка за счет размывания по колонке и часто неполным вытес-

нением элюэнтом. Второй - за довольно продолжительное время проведения

анализа ряд лабильных белков в результате взаимодействия со смолой-

ионообменником существенно денатурируют или изменяют конформацию пеп-

тидной цепи.

260

Разделяющая способность колонки

Основными характеристиками хроматографической колонки являются ее

селективность и эффективность. Как определяются эти параметры выясним на

простом визуальном примере.

Сорбент-ионообменник

Элюэнт

А+Б+В

WА

WБ WВ

LА

LБ

LВ

Внесем в верхнюю часть колонки смесь трех красителей А, Б, В и начнем

пропускать через колонку элюэнт для вымывания этих красителей. Наблюдаю-

щаяся при этом картина характерна для любого вида колоночной хроматогра-

фии.

На первой стадии сразу после внесения смеси красителей в колонку будет

видна только узкая полоска в верхней ее части. По мере пропускания элюэнта

эта полоска растянется и при хорошем разделении распределится между тремя

более или менее выраженными зонами соответствующего цвета. Обозначим

ширину каждой из зон через W, а расстояние от начала колонки до середины

зоны через L. Тогда, Селективность процесса (колонки) принято характеризо-

вать отношениями LА/LБ, LБ/LВ, а эффективность - как отношения Li/Wi

(LА/WА, LБ/WБ, LВ/WВ).

261

Чем больше величины селективности и эффективности для колонки, тем

более сложную смесь можно на ней, в принципе, анализировать. Важно и по-

лезно помнить следующее.

Селективность определяется в первую очередь химической природой са-

мих разделяемых веществ и активностью их взаимодействия с сорбентом. По-

этому, основанная на большом опыте интуиция экспериментатора в значитель-

ной мере определяют успех в выборе подходящей неподвижной фазы в каждом

конкретном случае. Есть, безусловно, масса эмпирических правил, но они редко

приводят к желаемому результату без соответствующего опыта и навыков.

¾ Эффективность, в отличие от селективности, практически не зависит от

природы разделяемых веществ и является преимущественно характеристикой

самой колонки. Она определяется типом сорбента, размером его частиц, плот-

ностью их упаковки. Качественные выводы таковы: чем меньше размер частиц

и чем плотнее они упакованы, тем эффективнее колонка. В опыте это проявля-

ется уменьшением ширины зоны компонента по колонке. Расстояние между

центрами полос сохраняется практически без изменений

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Значительные успехи хроматографических методов обеспечены тем, что

к настоящему времени найдены и изготовлены весьма эффективные новые ма-

териалы для стационарных фаз. Эти новые материалы характеризуются очень

малыми размерами гранул (5-10 мкм. в диаметре), что позволяет производить

очень плотную набивку колонок (250м х 4мм, например). Высокая плотность

набивки колонок микроскопическими частицами неподвижной твердой фазы

резко повышает их эффективность. Трудность, как мы уже отмечали выше, од-

на - это большое сопротивление колонки. Современные насосы обеспечивают

давление в несколько сотен килопаскалей. В настоящее время этот метод полу-

чил название высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и дает