Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

222

Для получения более надежных значений величины s и D измеряют в рас-

творах с различной концентрацией белка и экстраполируют на бесконечное

разбавление. Определенные так коэффициенты седиментации называются кон-

стантами седиментации - s

Метод измерения скорости седиментации приводит к ошибочным резуль-

татам, если форма частиц сильно отклоняется от сферической. Особенно, если

это длинные, тонкие, палочковидные молекулы. Кроме того, при вычислении

молекулярной массы по уравнению Сведберга возникают довольно значитель-

ные погрешности из-за неточностей в определении величин v. Точное измере-

ние v на небольших образцах белков почти невозможно.

4.4.7.3 Метод седиментационного равновесия

В методе седиментиационного равновесия подбирается такая скорость

вращения ротора центрифуги, при которой противодействующие друг другу

силы седиметации и диффузии уравновешены. В состоянии устоявшегося рав-

новесия в зоне мениска отсутствует зона чистого растворителя. Вдоль центри-

фужной пробирки устанавливается градиент концентрации белка. В нижнем

слое концентрация белка может быть примерно в 2 раза больше, чем в верхнем.

Измеряя концентрацию белка на различных расстояниях от оси вращения мож-

но рассчитать его ММ по уравнению:

М = 2RTln(с

/с

)/ω

(1 - vρ)(r

- r

)

где с

и с

- концентрации белка в пробирке на расстояниях r

и r

соответст-

венно от оси вращения.

В данном случае расчет ММ не требует знания величины коэффициента диф-

фузии. Кроме того, в методе седиментационного равновесия не вводятся ника-

кие поправки на форму частиц. Все это обеспечивает рассмотренному методу

наиболее высокую точность среди седиментационных. Основной недостаток -

это очень большие затраты времени. Иногда для установления равновесия рас

223

твор приходится непрерывно центрифугировать на протяжении нескольких су-

ток. Этот процесс можно ускорить, используя кюветы с очень небольшой высо-

той столба жидкости. Кроме того, метод седиментационного равновесия очень

критичен к чистоте белка и его гомогенности.

4.4.7.4 Метод приближения к седиментационному равновесию

Этот метод - есть компромисс между двумя вышерассмотренными мето-

дами. В нем нет присущей методу седиментационного равновесия точности, но

достигнут существенный выигрыш во времени проведения измерений. В мето-

де седиментационного равновесия требуются прецизионные измерение и под-

держание скорости вращения ротора. В методе приближения к седиментацион-

ному равновесию скорость вращения ротора доводится до равновесной на про-

тяжении 1 - 2 часов путем ряда последовательных подгонок (приближений).

Каждый раз при этом измеряют концентрацию белка у дна кюветы. Из этих

данных экстраполяцией определят ММ белка.

Метод центрифугирования в градиенте плотности. Этот метод полу-

чил широкое распространение не только для определения констант седимента-

ции, но и для разделения смесей макромолекул, органелл и вирусов. Есть два

варианта центрифугирования в градиенте плотности. В одном из них в центри-

фужной пробирке создается градиент плотности сахарозы. Достигают этого

смешением автоматическими насосами концентрированного раствора сахарозы

с водой в постепенно уменьшающихся соотношениях. Поверх раствора с гради-

ентом наслаивают смесь макромолекул, растворенных в легком растворителе.

При центрифугировании в качающемся горизонтальном роторе («бакет-

роторе») макромолекулы каждого типа осаждаются вдоль градиента плотности

с характерной для них скоростью. Она определяется в основном массой частиц.

В результате осаждения образуются полосы или зоны. Хорошее разделение

достигается быстро. Константу седиментации белка определяют исходя из по

224

ложения его полосы в градиенте по отношению к положениям полос «белков-

маркеров», константы седиментации для которых известны.

Вторая модификация метода для определения молекулярной массы не

применяется. Однако она весьма эффективна как способ разделения макромо-

лекул с различными плотностями. В этом случае градиент концентрации зара-

нее не создают. В качестве среды используют 6М раствор CsCl. Он обладает

большой растворимостью, а его высококонцентрированные растворы малой

вязкостью. В мощном гравитационном поле CsCl сам подвержен слабой седи-

ментации, что и приводит к появлению градиента концентрации CsCl. Для ус-

тановления этого градиента требуется обычно довольно продолжительное вре-

мя: от нескольких часов до нескольких суток. Распределение плотности вдоль

пробирки можно определить с высокой точностью. После центрифугирования

со смесью белков они распределяются вдоль градиента плотности на полосы.

При этом, каждая из полос оказывается в той части пробирки, в которой плот-

ность раствора CsCl совпадает с плотностью белка. Такое центрифугирование

обладает очень высокой разрешающей способностью и особенно успешно при-

меняется при разделении смесей нуклеиновых кислот.

4.4.7.5 Диффузия и коэффициент диффузии

При смешении двух газов или жидкостей их молекулы стремятся распре-

делиться по всему объему сосуда. Если разделить сосуд на две части непрони-

цаемой перегородкой и одну половину сосуда заполнить одним веществом, а

вторую другим, то после удаления перегородки молекулы обоих веществ нач-

нут распространяться по всему сосуду. Процесс это носит названия диффузии.

Направление диффузии всегда одно и то же: со стороны с большей концентра-

цией компонента в сторону с его меньшей концентрацией, т.е. вдоль градиента

концентрации. В простейшем случае скорость линейной диффузии описывается

первым законом Фика:

225

ds/dt = -Da(dc/dx)

Этот закон гласит, что количество растворенного вещества (ds), диффунди-

рующего за время dt через площадку А, расположенную перпендикулярно на-

правлению диффузии, пропорциональна градиенту концентрации (dc/dx) в этом

направлении. Коэффициент пропорциональности - D, называется коэффициен-

том диффузии. Он определяется как количество вещества, диффундирующего

через поверхность площадью [1 ед.длины]

при градиенте концентрации рав-

ном единице. Поскольку диффузия протекает в направлении меньшей концен-

трации в уравнении закона Фика стоит знак минус.

Коэффициенты диффузии белков определяют в диффузионных кюветах,

путем измерения скорости перемещения границы раздела белок-растворитель.

Такая граница создается в диффузионной кювете посредством осторожного на-

слоения растворителя на раствор белка. За движением границы следят оптиче-

ски. В случае очень больших белковых молекул имеется некоторая зависимость

скорости диффузии от ММ. Однако эта зависимость выражена слабо. Так, на-

пример, ММ сывороточного альбумина в 2 раза больше ММ β-лактоглобулина.

В то же время различие в их коэффициентах диффузии составляет всего 16%.

По этой причине непосредственное определение D, строго говоря, не позволяет

определять ММ с достаточной точностью. Но знание его необходимо для опре-

деления ММ по скорости седиментации (см.выше).

4.5 Методы разделения белков

4.5.1 Электрофорез

В 1809 г. проф. Московского университета О.Ю.Рейс впервые описал за-

кономерности движения заряженных частиц коллоидных растворов в электри-

ческом поле, заложив тем самым основы современного электрофореза (ЭФ). В

настоящее время электрофорез (более раннее название катафорез) широко при-

меняют для изучения коллоидных систем и белковых растворов. Перемещение

226

ионов низкомолекулярных электролитов в электрическом поле называют ионо-

форезом.

Электрофорез подразделяют на преперативный и аналитический. Препа-

ративный ЭФ используют для выделения относительно больших количеств ма-

териала. Аналитический - в исследовательских целях: контроль чистоты; анализ

состава смесей и т.д.

Кроме того ЭФ подразделяют на макроэлектрофорез (разделение более

100 мг вещества); микроэлектрофорез (разделение менее 1мг вещества); полу-

микроэлектрофорез (разделение 1-10мг вещества); низковольтный (до 1000В);

высоковольтный (более 1000В).

Методом ЭФ можно разделять белки, нуклеиновые кислоты, полисахари-

ды, ферменты, токсины, фосфорные эфиры, бактериальные антигены, вирусы,

витамины, антибиотики, алкалоиды и ряд других веществ.

В современных практических методах анализа, основанных на электро-

форезе, движение вещества происходит в жидкой буферной среде, которая

удерживается инертным твердым носителем. В качестве таковых используют-

бумагу или гели. Жидкая среда выполняет роль проводника в наложенном на

нее из вне электрическом поле.

4.5.2 Физические основы электрофореза белков

Электрические заряда на молекулах белков в растворе возникают либо в

результате диссоциации ионогенных групп, либо при адсорбции ионов из рас-

твора на поверхности больших молекул. В результате этого образуется двойной

электрический слой. Этот слой состоит из заряженной поверхности коллоидной

или белковой частицы и тонкой ионной пленки (ионной атмосферы), образо-

ванной средой вокруг частицы. Заряды на поверхности частицы и в ионной ат-

мосфере имеют различную полярность. Смотри рис. ниже.

227

Двойной электрический

слой

В отсутствии электрического

поля

В электрическом поле

Во внешнем электрическом поле частица и окружающая ее ионная атмо-

сфера движутся в противоположных направлениях, поскольку имеют разные

заряды. Это создает электрофоретическое трение, которое тормозит движение

частицы.

Подвижность заряженной частицы (иона) в электрическом поле называется

электрофоретической подвижностью. Для сферической частицы в предельно

разбавленном растворе (идеальный случай, отсутствие межмолекулярных

электростатических взаимодействий между ионами) электрофоретическая

подвижность (µ) выражается формулой:

πη

где Q - суммарный заряд частицы, r - радиус частицы, η - вязкость среды, в ко-

торой движется ион, U - разность потенциалов (приложенное напряжение).

Из уравнения видно, что в одной и той же среде (η=const) при одинако-

вом напряжении (U=const) подвижности ионов пропорциональны отношению

заряда к их радиусу:

µ∝

Это соотношение лежит в основе метода электрофоретического разделе-

ния смесей заряженных частиц, имеющих различные подвижности.

228

4.5.3 Экспериментальные методы электрофореза

Существует три основных разновидности ЭФ:

¾ фронтальный;

¾ зональный ;

¾ стационарный.

При фронтальном ЭФ электрическое поле прикладывается к системе, ко-

гда в ней имеется сформировавшаяся отчетливая граница между раствором за-

ряженных частиц и средой (растворитель, буферная смесь). В процессе ЭФ гра-

ница перемещается.

Зональный ЭФ основан на применении пористой стабилизированной сре-

ды (бумага, гель, блоки гранулированного материала). При электрофорезе мо-

лекулы одного типа группируются по зонам.

Стационарный (или вытесняющий) ЭФ характеризуется тем, что через

некоторое время после начала разделения устанавливается состояние равнове-

сия.

Рассмотрим детальнее перечисленные выше типы электрофоретического

разделения на примерах белковых смесей.

В 20-30 годах прошлого столетия были выполнены интенсивные иссле-

дования электрохимических свойств белков. Они позволили установить, что

молекулы белка представляют собой амфотерные полиэлектролиты, т.е. они не-

сут на себе одновременно положительный и отрицательный заряд. В приложе-

нии к белкам термин «амфотерный» означает, что они титруются как кислота-

ми, так и щелочами. Иными словами, молекула белка в довольно больших ин-

тервалах рН несет на себе одновременно положительные и отрицательные за-

ряды. А в очень кислых средах (рН ≅ 1) практически все белки имеют макси-

мальный положительный заряд. В сильно щелочных (рН ≅ 13) - максимальный

отрицательный. Есть, правда, исключения. Гистоны, например, имеют положи-

тельный заряд даже при рН = 11.

229

Различие в зарядах белковых молекул впервые было использовано для

разделения их смесей шведским исследователем Арне Тизелиусом в 1937г. Он

сконструировал первый прибор для проведения электрофореза. За достижения в

области электрофореза Тизелиус в 1948г был награжден Нобелевской премией.

Долгое время электрофорез оставался практически единственным коли-

чественным методом анализа белков. Он и сейчас весьма широко используется,

хотя и уступает современным физико-химическим методам. В частности, хро-

матографии, гель-фильтрации, ультрацентрифугированию, центрифугированию

в градиенте плотности.

В молекулах белков содержатся как основные, так и кислотные ионизи-

рующиеся группы: карбоксильные, спиртовые, аминогруппы, гуанидиновые,

фенольные, имидазольные, тиольные. Это ионогенные группы. Для каждого

белка существует совершенно определенное значение рН среды, при котором

суммарный заряд белковой молекулы равен нулю. Это изоэлектрическая точка

(ИЭТ). В этой точке в молекуле белка содержится равное количество положи-

тельных и отрицательных зарядов. Это важно четко понимать. Нулевой заряд

означает в данном случае не отсутствие зарядов, а равенство положительно и

отрицательно заряженных групп в одной и той же молекуле. При значениях рН

выше ИЭТ белок несет суммарный отрицательный заряд, а ниже ИЭТ - сум-

марный положительный. Белки сыворотки крови, в большинстве своем, имеют

ИЭТ в области рН = 4-6. В электрическом поле положительно заряженные час-

тицы движутся к катоду, а отрицательные к аноду.

4.5.3.1 Фронтальный электрофорез

Метод фронтального ЭФ (его называют еще методом движущейся грани-

цы) создал Тизелиус, разработав специальную кювету. Суть метода в следую-

щем. В U-образную прозрачную ячейку помещают раствор белка. Поверх рас-

твора осторожно наслаивают чистый буфер. Затем при постоянной температуре

230

и в условиях, исключающих вибрацию, на систему накладывают электрическое

поле.

При перемещении белка под действием поля из раствора в зону чистого

буфера создается граница, которая движется в направлении одного из электро-

дов (в зависимости от заряда белковой молекулы). На этой границе наблюдает-

ся резкое изменение показателя преломления. Оно обусловлено тем, что пока-

затели преломления чистого буфера и раствора белка в буфере различны. На

основании данных измерений градиента показателя преломления вдоль ячейки

при помощи специального оптического метода, называемого шлирен-методом

строят электрофореграмму (см. рис.)

Восходящая

граница

Нисходящая

граница

Растворенный в быфере

белок

1 - Чистый буфер

2 - Первоначальная

граница

Электрофореграмма

смеси трех белков

231

Каждый пик на электрофореграмме соответствует положению движущейся

границы определенного белка. С максимумом концентрации белка он не

совпадает.

В последнее время вариант электрофореза по Тизелиусу практически не

используется. Его заменили более совершенные и более удобные методики.

4.5.3.2 Электрофорез на бумаге

Аминокислоты, пептиды и белки можно анализировать методом электро-

фореза на бумаге. Наилучшие результаты получаются при использовании на-

пряжений до 1 кВ.

Методика электрофореза проста. Полоску или лист хроматографической

бумаги равномерно увлажняют токопроводящим буферным раствором. Закреп-

ляют в специальной ванночке между двумя электродными отделениями, кото-

рые заполнены токопроводящим раствором (см. рис.4.4).

Рис. 4.4

Принципиальная схема установки для низковольтного (А) и высоковольтного (Б) электро-

фореза на бумаге.

1 - крышка; 2- полоска бумаги; 3 - вода для поддержания постоянной величины насыщенных

паров; 4,5 - кюветы с буферным раствором; 6 - токопроводящий фитиль; 7 - охлаждающие

пластины; 8 - заполненный воздухом мешок.