Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

272

установить места встраивания крупных пептидных фрагментов в белковую

цепь.

Методология исключительно масс-спектрометрического исследования

белка на его аминокислотную последовательность включает такие этапы.

¾ Белок расщепляют неспецифически эластазой или субтилизином на отно-

сительно мелкие фрагменты.

¾ Короткие пептиды отделяют от негидролизованного белка и крупных

фрагментов методом гель-фильтрации.

¾ Смесь коротких пептидов разделяют колоночной хроматографией на ка-

тионитах (например ДАУЭКС) или методом высокоэффективной жидкостной

хроматографии. При использовании катионитов лучшим элюэнтом является

смесь пиридина с уксусной кислотой, а ВЭЖХ - смесь уксусной кислоты с про-

панолом.

¾ Отбирают в процессе хроматографироования фракции, содержащие до 5-

ти пептидов, и высушиваются.

¾ В полученных фракциях проводят химическую модификацию пептидов и

определяют последовательность аминокислот методом масс-спектрометрии.

4.7.4 Фрагментации первичных молекулярных ионов пептидов

Фрагментация полученных электронным ударом первичных молекуляр-

ных ионов перметилированных ацетилпептидов обусловлена, в основном, раз-

рывом амидных связей - С-N с фиксацией заряда на карбонилсодержащем ионе

(фрагменте или осколке). Это ион b (см.схему). Этот тип распада идет часто

двухступенчато с выбросом СО и образованием альдиминных фрагментов (ио-

нов с).

Образовавшиеся в результате фрагментации осколочные ионы как раз и

характеризуют аминокислотную последовательность пептида. Разности масс

осколочных ионов отвечают величинам масс аминокислотных остатков.

273

Схема процесса фрагментации первичного молекулярного иона выглядит

так:

RCO(NHCHCO)nNHCH CO

NHCH

CO NHCHCOOAlk

(b)

(c)

Для расшифровки масс спектра пептида находят вначале в нем пик, отве-

чающий иону N-концевой аминокислоты. Его массовое число лежит в интерва-

ле m/z = 114-257. Затем находят разность массовых чисел следующих друг за

другом (стояших рядом) пиков осколочных ионов и пользуясь таблицей масс

модифицированных аминокислотных остатков (см ниже) определяют какая

именно аминокислота отщепилась от осколочного иона в процессе фрагмента-

ции. Рассмотрим это на конкретном примере. Пусть мы имеем пептид A-B-C-D,

где A,B,C,D - остатки модифицированных аминокислот. При ЭУ и в результате

фрагментации образуются следующие ионы: A

, AB

, ABC

, ABCD

. Пользуясь

данными приведенной ниже таблицы массовых чисел комбинируем аминокис-

лотную последовательность исходя из реального масс-спектра.

Аминокислоты с R-остаками общей формулы CH

X, в которых Х содер-

жит двойные связи, склонны при ЭУ к разрыву связей C-N с миграцией атома

водорода:

HHX

CH C

Такой распад характерен для пептидов с остатками аспарагиновой кислоты, ас-

парагина, фенилаланина, гистидина, тирозина и триптофана. При фрагментации

образуются новые пептиды.

274

Таблица

Массы ионов N-концевых и прочих аминокислотных (а/к) остатков в масс-

спектрах ЭУ ацетилированных перметилпептидов

А/к Масса N-

конц. а/к

Масса а/к

остатка

А/к Масса N-

конц. а/к

Масса а/к

остатка

Гли 114 71 Мет 188 145

Ала 128 85 Асн 199 156

Про 140 97 Глу 200 157

Вал 156 113 Фен 204 161

Сер 158 115 Гис 208 165

Лей 170 127 Глн 213 170

Треонин

Thr,Тре

172 129 Орнитин 227 184

Цис 174 131 Тир 234 191

Асп 186 143 Лиз 241 198

Триптоф

Три,Trp

257 214

Остатки лейцина и изолейцина в масс-спектре неразличимы.

Аминокислотная последовательность начинается в них с остатка той ки-

слоты, в которой произошел разрыв связи С-N. Массы N-концевых ионов пеп-

тидов, образующихся при разрыве непептидных связей С-N приведены ниже в

таблице.

Массы N-концевых ионов, образующихся в результате разрыва

непептидных C-N связей в пептидах

Ион а/к Масса Ион а/к Масса

Асп, Asp 113 Гис, His 135

Асн, Asn 126 Тир, Tyr 161

Фен, Phe 131 Три, Trp 184

Остатки глутаминовой кислоты и глутамина, независимо от положения в

пептидной цепи, часто циклизуются, образуя ионы N-концевой пирролидон-

карбоновой кислоты. Эта циклизация приводит к появлению в спектре иона (I)

275

с массовым числом - 98. Соответствующий ему N-концевой ион (II) с m/z = 126

либо вообще отсутствует в спектре, либо проявляется пиком малой интенсив-

ности:

CHN

CCH

CHN

CCH

(I)

(II)

Распад боковых цепей некоторых аминокислотных остатков протекает

специфично. Это облегчает интерпретацию масс-спектров пептидов. Так, на-

пример, боковые цепи серина и треонина склонны к элиминированию молеку-

лы этанола. Для треонина характерен отрыв всей боковой цепи (разрыв по С-С

связи с миграцией Н-атома или без). Метионин склонен к выбросу молекулы

СН

SH (m/z = 48) или всей боковой цепи.

4.7.5 Введение в пептид дейтериевой метки

Для повышения надежности определения аминокислотной последова-

тельности пептида в него вводят дейтериевые метки. Для получения дейтеро-

производных пептидов используют D

-уксусный ангидрид или D

-метилиодид

вместо обычных реагентов ацетилирования и метилирования. Рассмотрим

практические последствия такой модификации. Например, ион с m/z=126 в

спектре обычного перметилированного ацетилпептида может принадлежать ос-

татку N-концевой пирролидонкарбоновой кислоты, остатку аспарагина (в ре-

зультате разрыва N-C связи) или N-концевому остатку серина, который выбро-

сил молекулу этанола. Анализ D-меченного аналога пептида позволяет одно-

значно решить эту задачу. Если модифицировать пептид немеченным метилио-

дидом и D

-уксусным ангидридом, то в первых двух случаях масса иона оста-

нется прежней, а в третьем - масса иона с m/z=126 увеличится до 129. Если же

276

использовать D

-метилиодид и немеченный уксусный ангидрид, то в первых

двух случаях образуются ионы с m/z = 129, а в третьем с m/z=132.

4.8 Электронная микроскопия

В настоящее время есть два метода непосредственного исследования

структуры белков в твердом состоянии - это методы электронной микроскопии

и рентгеноструктурного анализа. Остановимся вкратце на них.

Невооруженный глаз человека способен в норме различить две точки, ес-

ли расстояние между ними составляет около 0.1 мм (100 мкм). При меньших

расстояниях разделенные в пространстве объекты воспринимаются глазом как

непрерывные, слитые в один.

Оптические микроскопы имеют теоретический предел разрешения около

2000Å. Этот предел обусловлен тем, что микроскоп любой конструкции (в

идеале, при идеальных линзах) способен различить две точки расстояние между

которыми не менее 1/2 длины волны используемого для освещения объекта

света. Таковы законы оптики. Если, например, мы используем видимую область

оптического спектра (≅ 5000Å, 0.5мкм), то теоретическая граница разрешающей

способности оптического микроскопа не может быть меньше 2500Å (0.25мкм).

Использование УФ света и специальных кварцевых линз позволяет повысить

разрешение до 0.17мкм. Оптические микроскопы позволяют наблюдать ин-

тактные клетки диаметром 1-20 мкм, однако они явно непригодны для того,

чтобы увидеть отдельные молекулы белка. Значительно большие разрешающие

возможности достигнуты в электронных микроскопах.

По принципу действия электронный микроскоп ничем не отличается от

оптического. В нем только в качестве источника облучения использован поток

электронов высокой энергии, а вместо вещественных (стеклянных) линз - элек-

тромагнитные катушки фокусировки (электромагнитные линзы).

277

Оценим теоретический предел разрешающей способности электронного

микроскопа. Согласно де’Бройлю энергия движущейся вещественной частицы

и ее длинна волны связаны соотношением:

= h/m

где m

и V - масса и скорость движения электрона соответственно. Если элек-

трон ускоряется в поле с разностью потенциалов, равной U, то его кинетиче-

ская энергия определяется как:

/2 = eU

где е- элементарный заряд электрона.

Заменив фундаментальные константы их числовыми значениями, получим для

длинны волны ускоренного электрона следующее простое соотношение:

= 12.3/U

1/2

(В)

При U ≅ 50000В (50кВ)

= 0.05Å, т.е. разрешающая способность составит

около 0.025Å (0.0000025мкм). Это очень высокое разрешение, которое доста-

точно для того, чтобы наблюдать отдельные атомы водорода. На практике из-за

неоднородности фокусирующих полей и ряда других причин ее достичь не уда-

ется. Лучшие современные электронные микроскопы обеспечивают разрешение

около 2Å (0.0002мкм), что позволяет исследовать, не только строение клеток,

но и наблюдать отдельные крупные макромолекулы. Принцип действия совре-

менного электронного микроскопа и его внешний вид приведены на рисунке

4.13.

278

Рис. 4.13

Внешний вид и схема, иллюстрирующая принцип действия, электронного микроскопа

Электроны, прошедшие через образец, формируют его изображение, ко-

торое регистрируют на специальной фотопленке и получают электронную мик-

рофотографию образца (объекта). В электронной микроскопии контрастность

изображения определяется распределением плотности массы в образце. Моле-

кулы белка не обладают достаточной контрастностью, поэтому образцы «ок-

рашивают» обработкой электронноплотными веществами - солями вольфрама,

осмия или платины.

279

Исследуемый образец в электронном микроскопе помещают на тонкую

угольную пленку, нанесенную на круглую мелкоячеистую медную сеточку

диаметром около 3 мм: (см. фрагмент на рис. 4.14).

Рис. 4.14

Держатель образца электронного микроскопа (сетка): фрагмент, вид сверху (А) и сбоку (Б).

1 - углеродная пленка - подложка; 2 - образец; 3 - металлическая сетка

4.8.1 Подготовка и «окрашивание» образцов

Подготовка образца для анализа методом электронной микроскопии

весьма ответственная часть эксперимента и включает несколько стадий. Биоло-

гические препараты готовятся в следующей последовательности.

¾ На первой стадии проводят операцию фиксации - вымачивания в раство-

ре, например, глутарового альдегида.

¾ Высушивание.

¾ Заливка в пластмассовый блок.

¾ Нарезка тонких слоев залитого в блок образца с помощью стеклянного

или алмазного ножа, либо ультрамикротома.

«Окрашивание». В электронной микроскопии биологических образцов

применяют, в основном, два типа «окрашивания» - позитивное и негативное.

При позитивном, молекулы красителя присоединяются к различным участкам

макромолекулы. При негативном (негативное контрастирование) макромолеку-

лы заключают в тонкую пленку красителя. В качестве красителя используют

соли тяжелых металлов.

При окрашивании образуются области с различной электронной плотно-

стью, что и позволяет выявлять особенности рельефа образца (см.рис.ниже)

280

Контрастирующее

вещество

Образец

Углеродная

пленка

Полоски переплета

медной сеточки

При позитивном контрастировании образец окрашивают в растворе и по-

мещают на сеточку. При негативном - каплю раствора с образцом наносят на

покрытую углеродной пленкой медную сеточку. Молекулы образца быстро ад-

сорбируются пленкой (1-2 мин), после чего жидкость аккуратно удаляют и на-

носят каплю раствора «красителя». Через 15-20 с раствор с контрастом удаляют

и сушат образец на воздухе.

4.8.1.1 Оттенение

Другой прием увеличения контрастности изображения сводится к покры-

тию поверхности образца слоем атомов тяжелого металла. Суть его состоит в

том, что на поверхность образца под небольшим углом напыляется в вакууме

тонкий слой металла. Производят напыление в вакуумной камере (см. рис. 4.15)

нагреванием спирали достаточно удаленной от образца. Контрастность дости-

гается тем, что атомы конденсируются на поверхности в соответствии с ее

рельефом. В затененных областях толщина слоя металла меньше, на открытых

участках - больше (см. рис. 4.16). Высота объекта связана с длинной отбрасы-

ваемой им тени соотношением: h = dtgα, что позволяет получать на микрофо-

тографиях объемные очертания исследуемых образцов и оценивать их геомет-

рические размеры.

281

Рис.4.15

Вакуумная камера для напыления металлической пленки на образец по методу оттенения

1 - спираль; 2 - пары металла, 3 - камера; 4 - образец; 5 - платформа; 6 - основание;

7 - электроды

Нагретая

спираль

Напыленный слой металла

Тень. В области тени

толщина пленки

напыления атомов металла

много меньше

Высота объекта (h)

Поток атомов

металла

Рис. 4.16

Схема напыления пленки металла на образец и образования области тени при контрастиро-

вании по методу оттенения