Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

302

Рис. 4.23

Маска, моделирующая одну (А) и две (Б) и четыре молекулы гексаметилбензола (левая

часть рисунка). Те же маски с одним дополнительным отверстием в центре (правая часть

рисунка)

303

Расположение дырочек соответствует расположению атомов в изучаемой

молекуле. Например, на рис.4.23 изображена маска, передающая строение гек-

саметилбензола (напоминаем, что атомы водорода в РСА могут не приниматься

во внимание). После второй линзы лучи фокусируются в плоскости F, в кото-

рой и образуется дифракционная картина. Она рассматривается через микро-

скоп малого увеличения. Вот и весь прибор для визуального наблюдения ди-

фракции света.

На рис. 4.23 (левая часть) изображены дифракционные картины, полу-

ченная от масок моделирующих одну, две и четыре правильно расположенные

на плоскости молекулы гексаметилбензола. Видно, что уже одна молекула дает

систему дифракционных пятен, общее расположение которых сохраняется и

для решетки из нескольких молекул. Но каждое пятно дробится на несколько и

получается в конечном счете сложная картина, в которой межмолекулярные и

внутримолекулярные интерференции перемешаны.

Спрашивается, можно ли, зная дифракционную картину, получить расче-

том или измерением породившую ее картину дырочек или освещенных точек.

Оказывается, это было бы возможно и легко, если бы мы знали не только ам-

плитуды (их квадрат - интенсивность пятна), но и фазы колебаний в дифракци-

онных пятнах. В данном случае мы имеем дело с картиной в прямом простран-

стве гораздо более элементарной, чем белковый кристалл. Эта картина плоская,

с центром симметрии. При этом все фазы интерференции имеют только два

значения: 0 и π. Иначе говоря, неопределенность фазы пятен сводится к неоп-

ределенности знаков амплитудных коэффициентов, т.е "+" или "-". Если бы мы

знали знаки, соответствующие каждому из пятен, т. е. каждой точке в обратном

пространстве, не представляло бы труда реконструировать (рассчитать через

ряды Фурье) структуру «кристаллической ячейки гексаметилбензола», исходя

из дифракционной картины. Поскольку знаки амплитудных коэффициентов

неизвестны - вычислить ряды Фурье нельзя. Существенно, однако, то, что

можно обойтись без расчетов, а пойти путем аналогового решения задачи, т.е.

304

применить тот же прием дифракции видимого света для преобразования карти-

ны пятен из обратного пространства в прямое. Для этого нужно изготовить

маску с дырочками, соответствующими дифракционной картине (рис. 4.23 ле-

вая часть). Но этого недостаточно. Часть дырочек должна давать пучок света с

обратной фазой колебаний по отношению к остальным и расположение этих

дырочек надо знать. Зная эти отверстия, мы заклеиваем их прозрачной слюдя-

ной пластинкой, дающей запаздывание по фазе точно на π (толщина пластинки

подбирается равной половине длины волны света в данной среде). Тогда мы

получаем в фокусной плоскости нашей оптической системы картину располо-

жения атомов в «молекулах» гексаметилбензола.

Таким образом, обратная задача перехода от дифракционной картины к

«структуре решетки» решается аналоговым путем только в том случае, если из-

вестны фазы (в данном случае знаки) интерференционных максимумов. Фазы

заранее неизвестны (мы видим и измеряем на практике только интенсивность

пятен), поэтому необходимо прибегнуть к методу изоморфного замещения. Для

этого вводим в структуру «молекулы» лишнюю освещенную точку в опреде-

ленном месте. Для простоты в нашем примере лишняя дырочка в маске сделана

в самом центре (рис. 4.23, правая часть). Получаем дифракционные картины от

измененных «молекул» и сравниваем их с дифракционными картинами от пер-

воначальных «молекул». Поскольку здесь дело гораздо проще и необходимо

выбрать только между двумя фазами - 0 и π, качественное сравнение двух кар-

тин вполне достаточно и дает сразу же полный ответ на поставленный вопрос.

Действительно, дополнительная дырочка находится в центре симметрии «моле-

кулы». Анализ показывает, что все амплитудные коэффициенты, создаваемые

этими центральными дырочками, будут иметь знак плюс. Значит, если дифрак-

ционное пятно увеличило свою интенсивность после добавления центрального

«атома» в «молекуле» гексаметилбензола, то его амплитудный коэффициент

положителен, если же уменьшило, то отрицателен.

305

Сравнивая левые и правые стороны рис. 4.23, мы легко находим пятна с

положительными и отрицательными знаками амплитудных коэффициентов. В

этом и заключена, правда с большими упрощениями, основная физическая идея

метода изоморфного замещения. При анализе белковых кристаллов дело обсто-

ит несравненно сложнее и вот по каким причинам.

Во-первых, решетка пространственная; во-вторых, центр симметрии от-

сутствует (в белках не может быть центра симметрии хотя бы уже потому, что

они содержат асимметрические атомы углерода). Но в принципе брэгговская

иллюстрация помогает понять саму идею метода.

Возвращаясь к рентгеноструктурному анализу белков, рассмотрим,

имеющий теперь уже только исторический интерес, путь пройденный при РСА

исследовании миоглобина. Характерными являются несколько последователь-

ных этапов, проделанных в этой работе. Разрешающая способность метода

рентгеноструктурного анализа находится в известной мере во власти исследо-

вателя. В начале было решено ограничиться более грубой картиной, пренебре-

гая мелкими деталями. Было принято, что анализ ведется с разрешением в 6 Å.

Это означало, что интерференции, соответствующие расстояниям в прямой ре-

шетке меньше 6 Å, во внимание не принимались. В этом случае, в обратном

пространстве выбрасываются все пятна, расстояния которых от центра больше

определенного. Иначе говоря, выбор разрешающей силы приводит к тому, что

мы отбираем дифракционные максимумы, достаточно близкие к центральному

пятну, и тем ограничиваем используемый экспериментальный материал. Так,

для получения пространственной модели миоглобина с разрешением в 6 Å ока-

залось необходимым использовать 400 дифракционных пятен. При переходе к

разрешению в 2 Å объем обратного пространства, который приходится исполь-

зовать для анализа, возрастает в 3

= 27 раз. Отсюда число дифракционных пя-

тен, использованных для расчетов, составило 10 000. При повышении разреше-

ния до 1,5 Å объем обратного пространства и, соответственно, число дифрак

306

ционных максимумов возросло еще вдвое, т. е. для анализа служили 20000 ин-

терференционных пятен.

Картина, полученная при разрешении в 6 Å, не позволила выявить поло-

жение отдельных атомов, но положение спиралей Полинга - Кори, образован-

ных полипептидной цепью, было установлено четко, так как диаметр спирали

10,1 Å. Боковые цепи аминокислотных звеньев здесь получились как бесструк-

турная аморфная масса, заполняющая промежутки между стержнеобразной

спиралью. По причине того, что отдельные белковые группы идентифициро-

вать не удалось, о чередовании аминокислот в цепи ничего сказать было нельзя.

Следующим шагом было повышение разрешающей способности до 2 Å путем

анализа 9600 интерференций. Такую титаническую работу можно было осуще-

ствить только путем значительной механизации, в особенности всех численных

расчетов. Кристаллики миоглобина (из мышц кашалота) снимались для получе-

ния так называемых диаграмм колебаний из 22 различных положений. Затем

после фотометрирования всех пятен проводилась нормировка интенсивностей

всех отдельных рентгенограмм c тем, чтобы получить вполне сравнимую серию

из 9600 коэффициентов. Затем вся та же измерительная работа была проделана

нa четырех изоморфных дериватах белка, содержащих тяжелые атомы метал-

лов.

К счастью, оказалось, что подобные дериваты образуются довольно легко

и в значительном разнообразии. В состав белковой молекулы входят многие ак-

тивные функциональные группы, способные связывать атомы или ионы метал-

лов как ковалентно, так и путем комплексообразования. Для надежности следу-

ет выбирать такие соединения, для которых число связанных атомов металлов

на одну молекулу белка невелико (лучше всего 1 - 2). Необходимо, чтобы по-

ложение тяжелых атомов было строго фиксировано в определенных точках

макромолекулы, но знать заранее координаты этих точек нет необходимости.

Наконец, обязательным является изоморфизм белкового деривата с исходным

белком. Это требование, как правило, нетрудно выполнить: введение одной или

307

двух групп с тяжелым металлом в макромолекулу белка зачастую почти не из-

меняет упаковку макромолекул в элементарной ячейке (решетке). Во всяком

случае, возникающие деформации решетки оказываются пренебрежимо малы.

Все эти обстоятельства помогают решить химическую часть задачи - получение

дериватов белков с атомами тяжелых элементов, причем критерием образова-

ния нужных соединений служат обычно сами рентгенограммы соответствую-

щих кристаллов.

Применительно к миоглобину лучшими реагентами оказались следую-

щие. Первый - это парахлормеркурибензосульфонат.

Это вещество присоединяется в одном единственном месте, даже если задать

его в кристаллизационную жидкость в 20-кратном ибытке.

Второй реагент - комплексные ртутно-аммиачные ионы, образующиеся

при нагревании окиси ртути с водным аммонийсульфатом. Эти ионы присоеди-

няются к молекуле миоглобина также в одном единственном месте и притом в

совершенно другом, чем первое, ртутно-органическое соединение. Третий, при-

годный для рентгеноструктурного анализа, дериват содержал комплексный ион

золота AuCl

(добавлялась при кристаллизации миоглобина соль KAuCl

). Зо-

лото прикрепляется также в одной определенной точке макромолекулы миог-

лобина. Реакция идет очень медленно и требует нескольких месяцев. Четвертое

соединение содержало в комбинации ртуть в виде хлормеркурибензосульфона-

та и ртутно-аммиачного комплекса.

Для всех четырех дериватов были получены рентгенограммы также из 22

положений и точно измерены около 10000 дифракционных максимумов. Затем

были получены разностные картины, относящиеся к атому тяжелого металла,

вычислены координаты атома металла, получены для него амплитудные коэф

фициенты как по величине, так и по фазе. Наконец, решением векторных урав

308

нений получены фазы всех 9600 интерференции миоглобина, и в итоге прове-

дено суммирование рядов Фурье для 96 слоев, на основании чего построены

поверхности равной электронной плотности. Степень выразительности этой

картины такова, что вторичная и третичная структура белка получилась во всех

деталях, структура спиральных участков Полинга - Кори подтвердилась в пол-

ной мере. Степень спиральности миоглобина оказалась близкой к 77%, что хо-

рошо совпадало с оценкой, сделанной Бенсоном и Линдерштрём - Лангом на

основании изотопного обмена водорода пептидных связей. Природа боковых

радикалов аминокислот в этом приближении установлена в большинстве слу-

чаев, но не во всех. Только в следующем окончательном расчете с разрешением

в 1,5 Å, когда приходится иметь дело с 20000 дифракционных пятен, степень

детальности анализа оказалась такой, что удалось идентифицировать все ами-

нокислотные остатки.

309

ГЛАВА 5

СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ

В настоящей главе изложены основы пептидного синтеза, которые на се-

годняшний день можно отнести к хрестоматийным. Реальной практической

значимости они уже не имеют в силу появление и стремительного развития в

последние 10-15 лет способов получения пептидов и белков методами генной

инженерии.

Пептидный синтез сводится к образованию амидной связи между α-

карбоксильной и α-аминогруппами двух аминокислот. В реакции отщепляется

молекула воды и для ее осуществления необходимо активировать карбоксиль-

ную или аминогруппу. К настоящему моменту предложено много различных

способов активации, однако лишь немногие из них нашли широкое практиче-

ское применение.

Для однозначного проведения пептидного синтеза в смеси аминоксилот

одного активирования их функциональных групп недостаточно. Причина в том,

что активированная молекула ааминокислоты может реагировать как с себе по-

добной, так и с отличной по строению молекулой иной аминокислот:

CHR COOH

CHR' COOH

CHRCONHCHRCOOH

CHRCONHCHR'COOH

Или

В силу этого, синтез пептидов требует защиты всех функциональных групп,

участие которых в реакции нежелательно. Применяемые в пептидном синтезе

310

защитные группы подразделяются на амино-(или N)-защитные (Х) и карбоксил-

(или С)-защитные (Y).

Помимо α-амино- и α-карбоксильных групп блокируют также и функ-

циональные группы в R-остатке (все они объединены общим названием - ω-

группы), если последние могут привести к побочным реакциям.

Защитные группы в пептидном синтезе, независимо от того блокируют ли

они Х-, Y- или ω-группы, должны удовлетворять таким требованиям.

¾ Они должны быть доступными или легко синтезироваться с хорошими

количественными выходами.

¾ Они должны быть применимы для возможно большего числа методов

синтеза пептидов.

¾ Они не должны вступать в побочные реакции или способствовать проте-

канию таковых.

¾ Они должны легко и селективно удаляться.

На практике все эти условия одновременно почти никогда не выполняют-

ся. Поэтому приходится останавливаться на некотором компромиссном реше-

нии.

В самом общем виде процесс пептидного синтеза можно выразить сле-

дующей схемой:

В целом, пептидный синтез включает следующие стадии:

¾ защита карбоксигруппы аминокомпоненты;

HCHRC

CHR' COX

HCHRC

CHR' COX

X - защита аминогруппы

Y - защита карбоксильной группы

Z* - ативированная карбоксигруппа

311

¾ защита аминогруппы карбоксикомпоненты;

¾ защита карбокси- и аминогрупп боковых цепей;

¾ активация карбоксигрупппы карбоксикомпоненты;

¾ синтез, образование пептидной связи;

¾ удаление (снятие) защитных групп;

¾ выделение пептида.

5.1 Методы защиты аминогруппы

Ацильные защитные группы

Простые ацильные группы малопригодны для защиты аминогруппы. Они

образуют новую амидную связь, которую трудно расщепить селективно в при-

сутствии других пептидных связей. Поэтому, в качестве ацильных защитных

групп применяют: формильный остаток; трифторацетильную, фталильную

группу; остаток сульфокислот. Эти группы можно селективно удалить соответ-

ственно: гидролизом в кислой среде; обработкой щелочью; гидразинолизом;

восстановлением с образованием меркаптанов.

Формильная группа

Формиламинокислоты впервые были получены Фишером и Вабургом в

1905г. И только спустя 50 лет Хильман обнаружил, что они очень легко гидро-

лизуются кислотами. Это открыло путь к использованию формиламинокислот в

пептидном синтезе. Удалить формильную группу можно не только кислотным

гидролизом, но и окислением трехкратным избытком 15% Н

HCNHCH

COOH NH

COOH CO