Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

322

Метиловые и этиловые эфиры N-защищенных аминокислот получают

введением N-защитной группы в эфир, а не наоборот.

По завершению пептидного синтеза эфирные группировки расщепляют

щелочным гидролизом. По мере удлинения пептидной цепи гидролиз эфиров

затрудняется и требует более жестких условий проведения реакции. Это, в

свою очередь, повышает вероятность рацемизации. Поэтому, в таких случаях,

щелочной гидролиз заменяют кислотным.

Трет-бутиловые эфиры аминокислот и пептидов исключительно легко

расщепляются кислотами, что делает их более предпочтительными перед мети-

ловыми и этиловыми эфирами. Известно несколько способов получения трет-

бутиловых эфиров аминокислот.

¾ В реакции этерификации свободных аминокислот с изобутиленом. Ката-

лизатор - серная кислота; растворитель - диоксан:

CHR COOH CH

CHR C

OC(CH

)

¾ В реакции переэтерификации свободных аминокислот трет-

бутилацетатом. Катализатор - хлорная кислота:

CHR COOH CH

OC(CH

)

HClO

CHR C

OC(CH

)

COOH

¾ В реакции N-защищенных ааминокислот с трет-бутанолом и хлорокисью

фосфора в присутствии избытка пиридина.

Трет-бутиловые эфиры большинства аминокислот - устойчивые жидко-

сти. Перегоняются без разложения. Не вступают в реакцию самоконденсации

при хранении. Очень устойчивы к гидразинолизу и аминолизу.

323

Расщепляют трет-бутиловые эфиры хлористым водородом в этилацетате

или хлористом метилене; толуолсульфокислотой в бензоле; трифторуксусной

кислотой. Последнюю особенно часто используют при синтезе фрагментов

биологически активных пептидов.

Бензиловые эфиры аминокислот получают по реакции хлоргидратов хло-

рангидридов аминокислот с бензиловым спиртом:

HCl NH

-HCl

OCH

HCl

Выходы реакции, как правило, невелики.

При использовании в реакции незамещенных аминокислот процессу спо-

собствует бензилборат, связывая образующуюся воду.

Бензиловые эфиры можно получить также по реакции аминокислот с 5-10

кратным избытком дибензилсульфита в присутствии п-толуолсульфокислоты.

Этот метод неприменим к аланину, лизину и пролину.

Расщепляют бензиловые эфиры ааминокислот и пептидов каталитиче-

ским гидрогенолизом в присутствии Pd. Избирательный гидрогенолиз бензило-

вых эфиров в присутствии карбобензоксигруппы невозможен. Бензиловые эфи-

ры можно расщепить также действием натрия в жидком аммиаке. Крайне редко

используется щелочной гидролиз бензиловых эфиров.

Модифицированные бензиловые эфиры

п-Нитробензиловые эфиры аминокислот получают кипячением карбобен-

зоксиаминокислот с п-нитробензилбромидом или п-нитробензилхлоридом в

этилацетате. Катализатор - третичный амин (X - карбобензоксигруппа). Карбо-

бензоксигруппу отщепляют от продукта реакции бромистым водородом в ледя-

ной уксусной кислоте.

324

XNH CHR COOH Br CH

XNH CHR COO CH

-HBr

Второй метод получения п-нитробензиловых эфиров - этерификация сво-

бодных аминокислот п-нитробензиловым спиртом в присутствии толуолсуль-

фокислоты в четыреххлористом углероде.

Третий способ - взаимодействие натриевых или триалкиламмониевых со-

лей карбобензоксиаминокислот с п-нитробензиловым эфиром п-толуолсульфо-

кислоты.

Для расщепления п-нитробензиловых эфиров прибегают к щелочному

гидролизу или каталитическому гидрогенолизу.

5.2.2 Гидразидная группа

Гидразидная группа (-NH-NH

) как таковая для защиты карбоксильной

функции непринима. В ее присутствии невозможно провести селективное аци-

лирование аминогруппы. Поэтому, для получения гидразидов используют про-

изводные гидразина (например, бензил- или третбутилоксигидразид), а амино-

группу в аминокислоте блокируют предварительно подходящей N - защитной

группой (Х):

XNHCHRC

NH C

OCH

XNHCHRC

NH NH C

OCH

NH C

OC(CH

)

()

или

Удаляют гидразидную защиту гидрогенолизом.

325

5.2.3 Защита карбоксильной группы путем солеобразования

Защита карбоксильной группы путем солеобразования - наиболее про-

стой метод. Такая защита легко достигается и дает почти количественный вы-

ход. Соли аминокислот растворяются только в воде. Это затрудняет дальней-

шее использование этих солей в пептидном синтезе. Поэтому, солеобразование

редко используется как метод защиты карбоксильной группы. Во всяком случае

его нельзя рекомендовать в качестве общего метода С-защиты.

5.3 Методы синтеза пептидов

5.3.1 Метод смешанных ангидридов

В методе смешанных ангидридов используются хлорангидриды N-

защищенных ааминокислот, смешанные ангидриды с моноэфирами угольной

кислоты, эфирами фосфорной и серной кислот, смешанные ангидриды с орга-

ническими кислотами (карбоновыми, трифторуксусной, сульфокислотами).

5.3.1.1 Хлорангидридный метод

В этом методе используются хлорангидриды N-защищенных аминокис-

лот. Стадии.

Получают хлорангидрид N-защищенной аминокислоты обработкой ами-

нокислоты большим избытком тионилхлорида в инертном растворителе (на-

пример, бензоле) или без растворителя, либо реакцией с пятихлористым фос-

фором в бензоле или хлороформе.:

XNH CHR C

Cl, PCl

XNH CHR C

Проводят реакцию образования пептидной связи с аминокомпонентой

(NH

-a/k) в присутствии сильного основания для связывания образующегося

хлористого водорода:

326

XNH CHR C

HCl

a/k

XNH CHR C

a/k

5.3.1.2 Смешанные ангидриды с моноэфирами угольной кислоты

Ангидриды с моноэфирами угольной кислоты играют в пептидном синте-

зе исключительную роль по сравнению со смешанными ангидридами других

типов. Этот метод предложен одновременно Виландом, Бернхардом и Буассо-

ном. Основное достоинство и преимущество этого метода - отсутствие побоч-

ных реакций в стадии образования пептидной связи. При аминолизе (в реакции

с аминокомпонентой) смешанного ангидрида образуется помимо соответст-

вующего пептида только двуокись углерода и спирт:

OR'

R''

RCONHR''

R' OH

Смешанные ангидриды с моноэфирами угольной кислоты получают

обычно при пониженной температуре (0

С и меньше). Реакция образования

пептидной связи протекает быстро уже при комнатной температуре. Для за-

вершения реакции требуется в некоторых случаях кипячение. Процесс протека-

ет удовлетворительно с большинством аминокислот.

5.3.2 Азидный метод

Азидный метод является наиболее универсальным методом синтеза пеп-

тидов. Его основное достоинство - отсутствие рацемизации. Реакцию синтеза

пептида проводят в несколько стадий.

Получают гидразид аминокислоты из эфиров N-защищенных аминокис-

лот

XNH CHR C

NH NH

327

Обработкой гидразида N-защищенной аминокислоты азотистой кислотой

получают гидразид:

XNH CHR C

NH NH

HNO

XNH CHR C

NNN

Гидразид вводят в реакцию с аминокомпонентой:

XNH CHR C

NNN

a/k

XNH CHR C

a/k

Образование азидов происходит только в сильнокислых растворах - смесь

уксусной и соляной кислот, или только соляная кислота. После добавления

нитрита натрия азид осаждается из раствора в виде масла, или в кристалличе-

ском состоянии. Азиды легко разлагаются водой. Поэтому их сразу после полу-

чения экстрагируют органическим растворителем (этилацетатом или эфиром).

Основные побочные реакции азидного метода синтеза пептидов обуслов-

лены:

¾ Перегруппировкой азида в изоцианат:

XNH CHR C

NNN

XNH CHR N C O

Изоцианат

¾ Образованием в ходе азидного синтеза амидов. Образовние амида не свя-

зано с перегруппировкой азида. Предполагается, что это побочная реакция гед-

разида с азотистой кислотой, которая протекает по следующему механизму:

NHNH

HNO

NHNNOH

Acea

Aiea

328

5.3.3 Пептидный синтез с использованием

активированных эфиров

Синтез пептидов путем аминолиза сложных эфиров N-защищенных ами-

нокислот известен давно. Систематический поиск наиболее склонных к амино-

лизу «активированных эфиров» начат, однако, только после 1950г.

В ряду изученных ариловых, алкиловых, тиоариловых, тиоалкиловых, ок-

сисукцинимидных и цианметиловых эфиров для синтеза пептидов наиболее

приемлемыми оказались п-нитрофениловые эфиры.

По активности в реакциях аминолиза сложные эфиры располагаются

примерно в такой последовательности:

-O-C

< -O-CH

-C

< -O-CH

< -O-CH=CH

< -O-C

< -S-C

-S-C

< -O-CH

< -O-C

-NO

< -S-C

-NO

Ариловые эфиры. Богдански с сотр. исследовали процесс аминолиза фе-

ниловых и нитрофениловых эфиров фталилглицина и в идентичных условиях

получили следующие выходы реакции для:

-O-C

(3%); -S-C

(31%); p-O-C

-NO

(75%); m-O-C

-NO

(83%);

o-O-C

-NO

(76%).

Как видно наибольшие выходы наблюдаются для нитрофениловых эфи-

ров. Предпочтительное использование пара-изомера обусловлено тем, что он

легче остальных кристаллизуется.

Метод п-нитрофениловых эфиров. Пептидный синтез с использованием

п-нитрофениловых эфиров проводят обычно в этилацетате или тетрагидрофу-

ране (в зависимости от растворимости эфира) при комнатной температуре или

слабом нагревании. Иногда рекомендуется добавлять диметилформамид. Этим

путем удалось синтезировать ряд природных полипептидов.

Скорость аминолиза зависит от длины цепи карбоксильной и аминоком-

понент. Большее влияние оказывает длина цепи карбоксикомпоненты. Амино-

лиз хорошо катализируется добавками имидазола. Реакция образования пеп

329

тидной связи протекает в оптимальных условиях, как правило, без рацемиза-

ции. Однако, для растворов карбобензоксиаминокислот величина удельного

вращения в присутствии даже 1% триэтиламина изменяется уже при 20

. В этих

условиях устойчивы только соответствующие производные глутамина и аспа-

рагина.

Оптически чистые п-нитрофениловые эфиры можно синтезировать по

одному из обычных методов, если С-концевая аминокислота не способна раце-

мизоваться (глицин или пролин).

п-Нитрофениловые эфиры обладают характеристическим поглощением в

УФ-области (λ

мах

= 268-270 нм.), что позволяет следить за кинетикой процесса

спектрофотометрически. Нитрофеннол в этой области не поглощает.

Алкиловые эфиры. Метиловые и этиловые эфиры обладают малой реак-

ционной способностью в пепетидном синтезе. Тем не менее, их используют для

получения циклических и линейных пептидов. Скорость аминолиза метиловых

эфиров можно увеличить добавками имидазола.

Наиболее активными в ряду алкиловых эфиров являются цианметиловые

эфиры. Они легко получаются реакцией N-защищенных аминокислот с хлор-

ацетонитрилом в присутствии триэтиламина. Аминолиз цианэтиловых эфиров

проводят обычно при комнатной температуре. Рацемизации, как правило, не

наблюдается. Процесс, так же как и в случае п-нитрофениловых эфиров, ката-

лизируют добавками имидазола, пиразола, триазолов и др.

Тиоэфиры. В целом тиоалкиловые эфиры малоактивны в реакциях пеп-

тидного синтеза и требуют весьма жестких условий проведения процесса. По-

этому они находят весьма ограниченное применение.

По наблюдениям Фаррингтона с сотр. в ряду ариловых эфиров наиболее

реакционноспособными являются п-нитротиофениловые эфиры. Тиоалкиловые

эфиры по своей активности располагаются в следующий ряд:

-S-CH

-CH

< -S-CH

-CH

-NH-COCH

< -S-CH

-CH

-COOH < -S-CH

COOH.

330

5.3.4 Пептидный синтез с использованием соединений

с кратными С-N и C-C связями.

5.3.4.1 Карбодиимиды

В 1955г Шиэн и Хесс предложили новый метод образования пептидной

связи путем использования N,N’-диалкилпроизводных карбодиимида. Этот

карбодиимидный метод стал одним из основных и широко применяемых спо-

собов образования пептидной связи. Достоинство этого метода - простота и не-

значительная тенденция к рацемизации. Схема реакции образования пептидной

связи выглядит следующим образом:

RCOOH NH

R' R'' N C N R''

RCONHR' R''NHCONHR''

R'' N C N R''

NCN

,N'-

дициклогексилка

бодиимид

При синтезе пептидов карбодиимидным методом N-защищенный карбок-

сильный компонент и аминокомпонент вводят в реакционную смесь одновре-

менно. Поскольку такая процедура не исключает образование соли, рекомен-

дуют карбодиимид вводить в несколько приемов.

5.3.4.2 Цианамиды

Лоссе и Веддиге в 1960г. разработали метод активирования карбоксиль-

ной группы N-защищенных аминокислот реакцией с N,N-диалкилцианамидами:

RCOOH C

RR'

OCOR

(

)

Аддукт N-защищенной а/к

с диациламидом

защищ. а/к

,N-

диалкил-

цианамид

331

Образовавшийся активный аддукт (I) реагирует далее с аминокомпонен-

том с образованием пептидной связи:

RR'

OCOR

NR''

RCNH

R''

(

)

5.3.4.3 Этоксиацетилен

Этоксиацетилен, в качестве конденсирующего средства при пептидном

синтезе, предложили Аренсон (1955) и Паннеманн (1959).

Реакция конденсации описывается в этом случае следующим суммарным

уравнением:

R COOH

NR' HC C OC

NH R'

COOC

Если аминокомпонента вводит в реакцию в форме хлоргидрата, то первой ста-

дией процесса является присоединение хлористого водорода к тройной связи

этоксиацетилена с образованием этилхлорвинилового эфира (II):

HC C OC

HCl

(II)

Этот эфир реагирует затем с карбоксильной компонентой, с образованием хло-

рангидрида:

(II)

HOOC R

COOC