Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

292

¾ Дифракционная картина кристалла формируется только в результате ин-

терференции когерентных волн, т.е. только теми лучами, длина волны которых

не изменилась после рассеяния.

¾ Интенсивности дифракционных максимумов (рефлексов) являются ком-

плексными параметрами и объединяют в себе информацию как об интенсивно-

сти рассеянных лучей, так и об их фазах. Проще говоря по интенсивности реф-

лекса ничего нельзя сказать о том, на каких именно атомах кристалла рассеян-

ны лучи, породившие данный конкретный дифракционный максимум. Этот так

называемая фазовая проблема РСА. Без разрешения фазовой задачи, простран-

ственные координаты атомов кристаллической решетки остаются неопределен-

ными.

¾ Закон отражения рентгеновских лучей кристаллами имеет ту особенность,

что зависимость между углом отражения (θ) и величиной межплоскостного

расстояния (d) является обратно пропорциональной (см.ур.Брегга): sinθ = nλ/2d.

R(d2)

R(d1)

Плоскости кристалла

Экран (фотопленка)

293

Это означает фактически, что дифракционные пятна (рефлексы) на рентгено-

грамме дают как бы обратную картину размещения атомов в кристалле. Иначе

говоря, чем ближе расположены атомы (чем меньше межплоскостное расстоя-

ние) тем сильнее отклонится отраженный рентгеновский луч на рентгенограм-

ме (см. рисунок выше.).

Этой особенностью дифракционной рентгенографии обусловлено введе-

ние в РСА пространства обратной решетки, а пространство, в котором распо-

ложена дифракционная картина называют обратным пространством. Абстракт-

но, это обратное пространство можно представить себе как совокупность ди-

фракционных пятен (точек) существующих в пространстве, окружающем кри-

сталл. Практически, все эти рефлексы фиксируют на фотопленке или посредст-

вом дифрактометра, вращая кристалл.

Преобразование от пространства кристаллической решетки к пространст-

ву обратной решетки есть просто строгая математическая формулировка брэг-

говского закона дифракции. При этом один масштабный параметр - расстояние

от кристалла до фотопленки - выбирается произвольно.

Задача рентгеноструктурного анализа заключается в том, чтобы перейти

от системы точек в обратном пространстве к искомой структуре решетки в

прямом пространстве. Для простых молекул она решалась методом проб и

ошибок. Известны были заранее симметрия и кристаллографические свойства

кристалла, а также строение молекул, заполняющих решетку. Это давало воз-

можность избегать многих ошибок и выбирать правильную структуру из не-

многих гипотетических альтернативных вариантов. При этом, кроме координат

дифракционного пятна, имеется еще один важный фактор - интенсивность пят-

на. Так как рентгеновские лучи одинаково рассеиваются электронами каждого

атома, то интенсивность отражения (I) от некоторой системы плоскостей будет

определяться так называемым структурным фактором, равным сумме квадратов

атомных номеров, т. е. чисел электронов всех атомов, на единицу площади:

294

∑

где С

, — концентрация атомов i-го типа в единице площади, z

- атомный но-

мер.

Сделав предположение о расположении атомов в решетке, легко рассчитать

всю ожидаемую картину как по положению пятен, так и по интенсивности.

Рентгеноструктурный анализ долгое время обходился этой примитивной тех-

никой. Однако постепенно в поле зрения рентгеноструктурного анализа вошли

сложные органические молекулы. И от простого подтверждения структурных

формул неорганических и органических соединений рентгенография перешла к

разгадке строения новых неизученных молекул. Пробным камнем для метода

послужила молекула пенициллина, которая вследствие крайней химической ла-

бильности долго не поддавалась усилиям химиков-органиков. Строение пени-

циллина было найдено, исходя из рентгеноструктурного анализа кристалла в

работе Дороги Ходжкин (1944 г.). Это было первое применение рентгеновских

лучей для решения задачи, перед которой методы органической химии отсту-

пили. Молекула пенициллина содержит 23 атома, кроме водородов.

Следующая по сложности задача, разрешенная той же исследовательницей, бы-

ло определение структуры витамина В

. В этом случае необходимо было найти

из рентгенограммы пространственные координаты 93 атомов, и это удалось

осуществить. В итоге была сконструирована пространственная модель молеку-

лы витамина, а следовательно, найдена его структурная формула, т. е. схема

расположения ковалентных связей между атомами.

После этого пришла эра белков, и задача анализа структуры усложнилась

неимоверно. В качестве первых объектов были избраны хромопротеиды гемо-

глобин и миоглобин, содержащие в своем составе гем-группу. РСА этих двух

белков крови был выполнен Кембриджской школой.

295

4.9.5 Проблема начальных фаз в РСА

Прежде, чем перейти к рассмотрению фазовой проблемы РСА введем по-

нятие элементарной ячейки кристаллической решетки. Элементарная ячейка

есть минимальный структурный элемент кристаллической решетки, отражаю-

щий все ее геометрические характеристики. Это шесть скалярных параметров

(величины длин ребер и углов между ни-

ми) или три единичных вектора, в направ-

лениях осей X,Y,Z (не всегда, кстати, ор-

тогональных). Вся бесконечная трехмер-

ная кристаллическая решетка есть, следо-

вательно, повторение в пространстве ее

элементарной ячейки (см. рис.) В случае

белковых молекул элементарную ячейку представляют как объем пространства,

занятого одной или более молекулами белка (см. рис 4.20. для миоглобина) .

Рис 4.20

Упаковка двух молекул миоглобина в элементарной ячейке кристаллической решетки.

Черные пластинки — группы гема.

Простейшая элементарная ячейка.

Параллелепипед повторяемости

296

Конечной целью кристаллографического исследования является установ-

ление распределения электронной плотности в трехмерной элементарной ячей-

ке кристалла

(x,y,z). Обычно считают, что электронная плотность в ячейке

распределена непрерывно и имеет максимумы в центрах тяжести, находящихся

в ячейке атомов. Эта плотность является периодически повторяющейся функ-

цией при переходе из ячейки в ячейку. В трехмерном пространстве она выра-

жается через преобразование Фурье, которое имеет вид не интеграла, а тройно-

го ряда Фурье:

[]

∑∑∑

−++=

hkl

hklDlzkyhxhklF

zyx )()(2cos(

),,(

πρ

где F(hkl)- амплитуды, D(hkl)- начальные фазы лучей.

Амплитуды легко определяются экспериментально по интенсивности ди-

фракционных максимумов (интенсивность пропорциональна квадрату ампли-

туды световой волны), а начальные фазы остаются неизвестными. Приемы оп-

ределения начальных фаз в кристаллографии белков и кристаллографии малых

молекул различны.

Проблема начальных фаз на разных этапах становления метода РСА не-

больших молекул выглядела примерно так. Первый этап - до 1935г. Это период

метода «проб и ошибок», когда модель размещения атомов по ячейке кристалла

фактически подгонялась под экспериментальную дифракционную картину без

всяких попыток решения фазовой задачи. При построении таких моделей исхо-

дили из определенных предположений о трехмерной структуре кристалла, вы-

текающих из каких-либо косвенных физико-химических данных.

Второй этап - с 1935 г., когда Паттерсон предложил первый прямой метод

анализа структуры на основании экспериментальных данных по распределению

дифракционных пятен. Этот метод позволял однозначно определять координа

297

ты входящих в кристалл тяжелых атомов, а вся остальная структура кристалла

следовала как привязка к этим тяжелым атомам.

В 1952г три автора - Захариазен, Кокрен и Сейр независимо и одновре-

менно разработали и предложили принципиально новый статистический под-

ход к решению фазовой проблемы, не требующий присутствия в кристалле тя-

желых атомов.

Ни один из этих методов, однако, неприемлем для анализа таких сложных

молекулярных образований как белки.

4.9.6 Особенности РСА белков

Установить структуру методом РСА - означает восстановить по картине

рефлексов в обратном пространстве, исходную кристаллическую решетку, по-

родившую эту картину, в реальном пространстве самого кристалла. Решение

этой задачи всегда представляло серьезные трудности даже для простых моле-

кул. При переходе же к биологическим объектам потребовались просто нетра-

диционные или специфические приемы проведения РСА.

Основное, что было разработано Кембриджской школой (Перутц, Кенд-

рю) в приложении к РСА белков - это экспериментальный метод определения

фаз. Как это удалось?

Макромолекулы белков образуют молекулярную решетку, в которой они

уложены рядом друг с другом. На модели (см. рис.4.20) приведена упаковка

молекул миоглобина в решетке. Кристаллическая решетка моноклинная, и в

элементарную ячейку входят 2 макромолекулы. Сама по себе внутримолеку-

лярная структура миоглобина чрезвычайно сложна, но способ упаковки целых

макромолекул в решетке прост. Между макромолекулами столь замысловатой

формы с необходимостью должны оставаться зазоры, заполняющиеся при кри-

сталлизации белка водным раствором. Кристаллизационная вода заполняет в

белковых кристаллах часто половину и даже несколько большую часть всего

объема. Высушивание белкового кристалла вызывает обычно нарушение регу

298

лярности структуры. Напомним, что белковые кристаллы долгое время вообще

не считали за кристаллы, так как они не давали рентгеновской дифракции. Бер-

нал и Дороги Ходжкин показали, что ошибка была в высушивании кристаллов;

если снимать рентгенограмму с белкового кристалла, находящегося в маточном

растворе, удается получить поразительные по детальности рентгенограммы, на-

считывающие часто более 20000 независимых рефлексов (см. рис. 4.21).

Рис. 4.21

Рентгеновская дифрактограмма от кристалла гемоглобина

Предположим теперь, что мы вводим в каждую макромолекулу белка

(будем рассматривать для конкретности гемоглобин) тяжелый атом с высоким

атомным номером и притом вводим закономерно, т. е. путем химической реак-

ции с какой-то строго определенной функциональной группой. Еще одно необ-

ходимое требование заключается в том, что результирующее соединение белка

с тяжелым атомом должно быть изоморфно с исходным белком, т. е. кристал

299

лизоваться в той же решетке. Если эти условия выполнены, то тяжелые атомы в

основном изменяют интенсивности отдельных пятен в рентгенограмме, не ме-

няя рентгенограмму коренным образом. Простейшим примером вполне прием-

лемых для этих целей тяжелых атомов являются атомы ртути. Они обладают

специфическим сродством к сульфгидрильным группам. Вводя в маточный

раствор, из которого ведется кристаллизация гемоглобина, специфический

ртутный реактив парахлормеркурибензоат натрия

ClHg COONa

можно получить белок, в котором две сульфгидрильные группы на каждую

макромолекулу прореагировали с ртутным соединением.

Таким образом в каждой элементарной ячейке кристалла в определенных

точках будут находиться четыре атома ртути, сильно рассеивающие рентгенов-

ские лучи. Сняв картину дифракционных пятен от кристалла ртутного соедине-

ния и сопоставляя ее с соответствующими данными для незамещенного белка,

мы получим картину рентгеновской дифракции от пространственной решетки,

состоящей как бы из одних атомов ртути, расставленных в пространстве в точ-

ках, где эти атомы прикрепляются благодаря химическому взаимодействию с

белком. Решетка атомов ртути, естественно, имеет простую структуру (всего 4

атома ртути в элементарное ячейке).

Определение дифракционной картины для разностной «ртутной» решетки

представляется непростым делом. Нельзя обойтись простым вычитанием ин-

тенсивностей пятен комбинированной рентгенограммы белок ртуть и рентгено-

граммы чистого белка. Складываются не интенсивности (квадраты амплитуд-

ных коэффициентов), а сами амплитудные коэффициенты. Последние, как уже

сказано выше, определяются модулем и фазой. Это комплексные числа и они

складываются как векторы на плоскости. А решение фазовой задачи сводится к

совместному решению векторных уравнений, полученных для нескольких раз

300

личных соединений тяжелого атома с белком. Большую помощь при этом ока-

зывают двойные дериваты, содержащие два разных тяжелых атома в двух точ-

ках макромолекулы. Большое облегчение в структурном анализе оказывает на-

личие оси симметрии кристалла 2-го порядка.

Не останавливаясь на деталях, отметим, что «ртутная» решетка, хотя ее

элементарная ячейка остается моноклинной, все же примитивна, так как содер-

жит в каждой ячейке немного атомов. Поэтому ее полный рентгеноструктур-

ный анализ осуществляется относительно просто и без принципиальных за-

труднений. А тогда оказывается возможным вычислить ретроспективно значе-

ния всех амплитудных коэффициентов, причем вычислить их полностью, т. е.

определить амплитуды и фазы. Знание всей пространственной картины как в

прямом, так и в обратном пространстве для «ртутной» решетки используется

для решения основной задачи - нахождения фаз амплитудных коэффициентов

для кристалла белка.

Для самоконтроля рентгенографисты стремятся иметь не 2 замещенных

тяжелыми атомами изоморфных белковых деривата, а 4 - 5 и более. Тогда сте-

пень надежности и точности в определении фазы для каждого дифракционного

пятна возрастает в большей мере и всякая случайная ошибка вскрывается, так

как приводит к несогласованности данных.

Из всего сказанного можно лишь в общих чертах представить себе колос-

сальный объем измерений и вычислений. Зато после определения фаз и сумми-

рования рядов Фурье мы имеем все, т. е. значения электронной плотности

(х,у,z) в каждой точке пространства внутри элементарной ячейки. Точки, где

электронная плотность проходит через максимум, дают нам координаты ато-

мов.

Чтобы построить с помощью электронной плотности пространственную

модель молекулы, ее восстанавливают по слоям. Все это напоминает систему

гистологических срезов через сложную ткань, когда накладывая друг на друга

последовательные срезы, мы реконструируем пространственную картину тка

301

ни. Подобным же образом реконструируют пространственную картину молеку-

лы по плоским срезам поверхностей равной электронной плотности (см. рис.

4.22).

Рис. 4.22

Пространственное распределение электронной плотности в миоглобине.

Для иллюстрации идеи изоморфного замещения для решения фазо-

вой проблемы при РСА сложных молекул Бреггом был предложен

простой и весьма оригинальный эксперимент. В нем, вместо ди-

фракции рентгеновских лучей Брэгг предложил наблюдать дифрак-

цию видимого света, вместо пространственной решетки - плоскую

решетку. Чтобы осуществить дифракцию видимых лучей, пользу-

ются простым прибором, изображенным на рис. Свет от источника

А собирается конденсором в главном фокусе плоско-выпуклой лин-

зы. Затем параллельные лучи проходят через маску О. Это черная

бумага, в которой пробиты отверстия.