Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

262

прекрасные результаты за короткое время (10-45мин). ВЭЖХ применима для

разделения и анализа смесей практически любых типов соединений.

Методом ВЭЖХ удается разделить оптические L- и D-стереоизомеры

аминоксилот. В качестве неподвижной фазы используют полистирольные и по-

лиакриламидные матрицы. Эффективность разделения на энантиомеры сущест-

венно повышается, если к полимерным матрицам ковалентно присоединить хи-

ральные лиганды, которые образуют комплексы с ионами двухвалентной меди.

Разработаны варианты обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ). В этом

случае, ионы металла в комплексе с хиральными лигандами находятся в под-

вижной жидкой фазе, например комплекс Cu

-L-пролин - подвижная фаза, а

стационарная фаза - катионнообменная смола или силикагель. Дальнейший

прогресс в этой области связан с синтезом серии N,N-диалкиламинокислот и

применением их в комплексах с ионами Cu

в качестве подвижных хиральных

фаз для ОФ ВЭЖХ. На хиральном комплексе N,N-ди-н-пропил-L-аланинацетат

меди удалось разделить на энантиомеры все белковые аминокислоты.

4.6.5 Аффинная хроматография

В 1968 году Анфинсен, Куатрекасас и др. предложили новый метод вы-

деления белков из биологических сред, основанный на способности белковой

молекулы к специфическому связыванию. Это свойство белков является до-

вольно распространенным. Обычно связываемое белком (Р) вещество (S) - есть

соединение, с которым белок взаимодействует in vivo, либо синтетический ана-

лог такого соединения, либо антитело, для которого белок выступает антиге-

ном. Сам метод получил название аффинной хроматографии (АХ). Он очень

сильно расширил экспериментальную базу биохимических исследований. Ме-

тодически, АХ очень похож на колоночную хроматографию. Колонка с твердой

полимерной стационарной фазой, на которой предварительно закреплено со-

единение S. При движении смеси белков через колонку на ней задерживается

263

только тот (как правило единственный) белок, который связывается с соедине-

нием S. В качестве матрицы для закрепления вещества S применяют: полиакри-

ламид, агарозу, декстран, силикагель.

Так например, один из белков, обнаруженных в лейкоцитах, связывает

витамин В

. Полагают, что этот белок секретируется в плазму, где участвует в

транспорте витамина В

к тканям. Долгое время исследование этого белка

представляло большие трудности, поскольку его не удавалось выделить в чис-

том виде с хорошим выходом обычными методами очистки. Методом аффин-

ной хроматографии эта проблема была разрешена, после пришивки витамина

к сефарозе, используемой в качестве стационарной фазы. Это почти в 10000

раз увеличило степень очистки специфически связывающегося с витамином В

белка с выходом >90% в одну стадию.

Подготовка афинного сорбента

Этот вопрос в АХ - первостепенной важности. Афинный сорбент состоит,

как правило, из трех частей:

¾ Носителя;

¾ пространственной группы;

¾ лиганда.

Эти три составляющие не являются, однако, абсолютно обязательными. Сам

носитель иногда может содержать в своем составе хорошие лиганды, связы-

вающие требуемый компонент анализируемой смеси. Например, остатки глю-

козы и маннозы в сефадексе G-75 могут выполнять функции лиганда, связы-

вающего лектин.

Носители

В качестве носителя в АХ находит применение агароза. Наиболее распро-

страненный носитель. К нему после активации бромцианом легко присоединя-

ются различные лиганды и пространственные группы. Недостатки агарозы.

264

¾ Биодеградация под действием гидролитических ферментов бактерий.

¾ Химическая деградация под действием аминов, либо кислот.

¾ Неспецифическая сорбция. Она связана со способом активации. Бромциан

активирует множество гидроксильных групп в носителе, не все из которых дос-

тупны для молекул лиганда. Эти свободные ОН-группы могут неспецифически

связывать компоненты анализируемой смеси. Кроме того, применяются.

Целлюлоза. Часто применяют для получения иммуносорбентов. По гид-

родинамическим свойствам целлюлоза хуже других сорбентов.

Полиакриламид. Преимущества - низкая неспецифическая сорбция бел-

ков.

Пористое стекло. Обладает высокими механическими свойствами и про-

ницаемостью.

Нерастворимые белки. Один из первых носителей этого типа получен об-

работкой раствора белка этилхлорформиатом. При перемешивании реакцион-

ной смеси из раствора выпадает гель в виде мелких частиц

Пространственная группа

Это фактически

«мостик» между носителем

и лигандом. Он уменьшает

стерические затруднения

при сшивке носителя с ли-

гандом. Структуры некото-

рых прстранственных групп

приведены на рисунке.

NH (CH

)

NH (CH

)

NH C

NH (CH

)

NH (CH

)

NH C

(C H

)

NH CH

CHOHCH

NH C

CHCH

NHCOCH

NH (CH

)

NH (CH

)

NH C

NH CH

CHOH CH

NH C

CHCH

NHCOCH

Носитель

Пространственная группа

265

Лиганд

Лиганд может быть связан с носителем непосредственно или через про-

странственную группу. Иммобилизованный лиганд должен прочно связывать

анализируемый выделяемый компонент смеси, чтобы обеспечить удаление

примесей из колонки промывкой буфером. В то же время, это связывание

должно быть обратимым, чтобы можно было «снять» белок с носителя после

вымывания примесей.

Афинные сорбенты

В настоящее время наиболее распространены три типа афинных сорбен-

тов:

¾ иммобилизованные лектины для выделения растворимых гликопротеинов;

¾ иммобилизованные антитела для получения очищенных препаратов анти-

генов;

¾ иммобилизованные кофакторы ферментов.

Иммобилизованные лектины

АХ с использованием иммообилизованных лектинов основана на их из-

бирательном сродстве к различным концевым углеводам в молекулах глико-

протеинов. Иммобилизованные конкавалин А или лектин чечевицы специфиче-

ски связывают, например, гликопротеины с остатками глюкозы или маннозы.

Иммобилизованный лимулин применяют для выделения гликопротеинов с вы-

соким содержанием сиаловых кислот. Иммобилизованный агглютинин арахиса

специфичен к гликопротеинам, содержащим N-ацетилгалактозоамин и т.д.

Иммобилизованные антитела

Иммуноадсорбция - принцип породивший афинную хроматографию.

Очищенный антиген присоединяют к носителю и сорбируют (связывают) на

нем специфические антитела. Десорбируют антитело концентрированным рас-

твором антигена. При отсутствии достаточных количеств последнего, белок -

266

антитело элюируют из колонки буферными растворами с низким рН, либо рас-

творами, содержащими солянокислый гуанидин или мочевину.

Высокая избирательность (специфичность) антител - важнейший фактор

при использовании их в качестве лиганда. Получают такие антитела иммуниза-

цией животных препаратами антигена.

Иммобилизованные субстраты, ингибиторы и кофакторы ферментов

Оптимальные лиганды для АХ ферментов - это субстраты. Применять по-

следние, однако, сложно. Они быстро превращаются в продукты соответст-

вующей ферментативной реакции. Необходимо принимать специальные меры

по торможению реакции с сохранением склонности к специфическому связы-

ванию фермента. Обычно это достигается понижением температуры от -2, до -

С. Десорбируют фермент повышением температуры.

Более широко используемыми лигандами являются ингибиторы и эффек-

торы, которые не затрагивают при связывании активный центр фермента.

К настоящему моменту проведены достаточно обширные исследования

по выявлению универсальных афинных лигандов для ферментов. Наиболее

подходящими считаются адениннуклеотидные коферменты, такие например,

как NAD

, NADP

и некоторые другие. Около трети из известных исследован-

ных ферментов проявляют активность в присутствии вышеназванных кофакто-

ров. Хорошо зарекомендовал себя в качестве структурного аналога NAD

содержащих носителей для синтеза сорбентов с широкой специфичностью го-

лубой декстран. Выделение отдельных ферментов из смеси с применением

групповых лигандов удается обеспечить варьированием условий.

267

4.7 Масс-спектрометрия электронного удара

Низкоразрешающая массспектрометрия электронного удара находит дос-

таточно широкое применение для определения аминокислотной последова-

тельности пептидов, подвергнутых ацетилированию или метилированию. Масс-

спектрометры, используемые для установления аминокислотной последова-

тельности пептидов должны удовлетворять двум основным требованиям. Они

должны иметь высокую чувствительность и регистрировать ионы с массами до

1000 Да.

4.7.1 Требования к пептидам анализируемым методом

масс-спектрометрии

Длина пептидов, которые можно анализировать методом масс-

спектрометрии электронного удара, определяется, в основном, их летучестью и

величиной масс образующихся ионов. Обычно, число аминокислотных остат-

ков в пептиде не должно превышать десяти. В случае пептидов, состоящих из

остатков небольших гидрофобных аминокислот (глицина, валина, аланина),

достаточной летучестью могут обладать и двадцатичленные фрагменты (оли-

гомеры). Более крупные пептиды удается проанализировать методом масс-

спектрометрии лишь тогда, когда в ионизирующей камере спектрометра они

распадаются термически на более мелкие и хорошо летучие фрагменты.

Величина пробы. Количество пептида, необходимое для установления

его аминокислотной последовательности методом масс-спектрометрии опреде-

ляется, в основном, его размерами, полярностью и способностью к фрагмен-

нтации. Для серийных масс-спектрометров среднего и более высокого классов

(например MS-50 фирмы KRATOS или ZAB фирмы VG Analytical) достаточно

30-50 нмоль десятичленного пептида на один анализ.

Чистота образца. Применяемая в настоящее время стратегия установ-

ления аминокислотной последовательности пептидов методом масс-

268

спектрометрии разработана для проведенния анализа смесей. Поэтому требова-

ния к возможному присутствию примесных пептидов в пробе не более жесткие,

чем в классическом дансилэдмановском варианте. Категорически недопустимо

при использовании метода масс-спектроскопии присутствие в пробе примесей

непептидной природы. Таких как соли, вещества вакуумных смазок и пласти-

фикаторы. Например, наличие следовых количеств кремнийорганических со-

единений из силиконовой смазки практически полностью подавляет ионизацию

пептидов электронным ударом.

4.7.2 Методы подготовки пробы для масс-спектрометрии

Белковая молекула или ее фрагмент (пептид) содержит, как правило, раз-

нообразные полярные функциональные группы. Это способствует их раство-

римости в воде, но делает практически не растворимыми в органических рас-

творителях и существенно понижает летучесть. По этой причине долгое время

не удавалось выйти на достаточно надежную методологию масс-

спектрометрического исследования пептидов. На разработку этой методологии

ушло, в общей сложности, более десяти лет. В ее основу положены наиболее

совершенные методы химического превращения водорастворимых пептидов в

растворимые в хлороформе летучие производные. Один из наиболее универ-

сальных методов получения летучих производных пептидов для массспектро-

метрического анализа позволяет модифицировать пептиды непосредственно в

смеси, содержащей 5-100 нмоль каждого из компонентов. Схема этой модифи-

кации предусматривает превращение пептидов в N-ацетил-N,O,S-

перметилпроизводные. Аргининсодержащие соединения перед такой химиче-

ской модификацией превращают в орнитилпептиды. Для определения аргинин-

содержащих пептидов в исследуемой пробе часть смеси подвергают предвари-

тельному аминокислотному анализу или аналитическому электрофорезу с по-

следующим окрашиванием.

269

Ацетилирование.

Обработка пробы уксусным ангидридом при комнатной температуре в течении

одной минуты приводит к защите только концевой аминогруппы пептида Мо-

дификация ε-аминогрупп достигается через 3 часа. Для сокращения времени

ацетилирования α- и ε-аминогрупп реакцию проводят в присутствии основа-

ний.

Перметилирование.

Ацетилпептиды метилируют следующим образом. Сначала готовят основание -

метилсульфинильный карбанион. Для этого к 3-4мл. диметилсульфоксида до-

бавляют гидрид натрия и выдерживают реакционную смесь 20 мин при 90

С. О

завершении реакции судят по появлению оранжево-коричневой окраски и пре-

кращению выделения водорода. Затем к растворенному в диметилсульфоксиде

пептиду добавляют в избытке полученный раствор с метилсульфинильным

карбанионом. Через минуту добавляют метилиодид и проводят метилирование

в течении 70с. По истечению этого времени реакцию тормозят добавлением во-

ды. Полученные перметилированные ацетилпептиды сразу же экстрагируют из

смеси хлороформом.

Гидразинолиз аргининовых остатков.

К 5-100 нмоль пептида добавляют 50 мкл. водного раствора гидразингидрата

(1:1) и выдерживают в течении 12 мин при 80

С. После этого реакционную

смесь охлаждают, добавляют 50 мкл воды, замораживают жидким азотом или

смесью этанола с сухим льдом (СО

) и вакуумируют до полного удаления воды.

Затем пробу медленно размораживают до комнатной температуры.

В общем виде схема всего процесса модификации пептида перед направ-

лением его на исследования методом масс-спектрометрии электронного удара

приведена ниже.

270

CH C

NH CH C

)

(

(CH

CO)

/CH

(

CH C

NH CH C

)

CCH

) CH

CH C

NCHC

)

CCH

(

Схема ацетилирования и исчерпывающего метилирования

пептидов для проведения масс

спектрометрии

(CH

)

NH C

(CH

)

Превращение остатков аргинина в остатки орнитина

271

4.7.3 Общие принципы масс-спектрометрического определения

аминокислотной последовательности

Основное достоинство метода масс-спектрометрии при установлении

аминокислотной последовательности пептидов и белков состоит в том, что он

позволяет анализировать смеси этих веществ. Классический дансил-

эдмановский метод требует обязательного предварительного выделения от-

дельных фрагментов после расщепления белковой цепи. Эта стадия является

трудоемкой и лимитирует весь процесс секвенирования по Эдману. В методе

масс-спектрометрии нет необходимости выделять отдельные фрагменты, доста-

точно грубого разделения всей смеси на отдельные фракции.

Благодаря различной летучести модифицированных фрагментов белковой

цепи, отдельные ее компоненты можно последовательно испарить при плавном

нагревании. При таком подходе газовая фаза всегда оказывается обогащенной

каим-либо одним фрагментом. Сравнивая масс-спектры, полученные при раз-

личных температурах, почти всегда удается однозначно установить аминокис-

лотную последовательность отдельных фрагментов. Такой прием дает прием-

лемые результаты при анализе смесей содержащих до пяти различных пепти-

дов.

Для повышения надежности заключений о порядке следования амино-

кислот в исходном белке метод масс-спектрометрии сочетают, как правило, с

классическими методами, придерживаясь такой примерно стратегии.

¾ Определяют N-концевую аминокислоту в автоматическом секвенаторе

или вручную.

¾ Пептиды, образующиеся после специфического ферментативного расщеп-

ления белка трипсином или химотрипсином, анализируют по методу Эдмана.

¾ Аминокислотную последовательность коротких пептидов, полученных

неспецифическим расщеплением белка эластазой или субтилизином, опреде-

ляют методом масс-спектрометрии в смесях. В сочетании с п.2 это позволяет