Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования
Подождите немного. Документ загружается.
102
В органической фазе проводят идентификацию ФТГ. Для этой цели используют
хроматографию на бумаге или в тонком слое, жидкостную, газожидкостную
хроматографию и др. методы физико-химического анализа. ФТГ можно гидро-
лизовать с помощью НJ до свободной аминокислоты и идентифицировать ее.
В 1967 г. Эдман и Бэгг разработали прибор (секвенатор) для установле-
ния аминокислотной последовательности коротких пептидов и их фрагментов в
автоматическом режиме. В секвенаторе все реакции проводят в цилиндриче-
ском стеклянном стакане, который вращается вокруг собственной оси с посто-
янной скоростью в атмосфере инертного газа (см. рис.).
Реагенты
Продукты
Пленка
белка
Пленка
белка
Продукты
Продукты
Образец белка наносится в виде пленки на стенки стакана, а реагенты в
растворителе подаются на дно. За счет центробежной силы раствор при враще-
нии стакана поднимается по его стенкам, омывая белок и собираясь в специ-
альной канавке. Из этой канавки растворенные продукты удаляются из стакана
посредством специальной отводной трубки. Такой способ проведения реакции
обеспечивает большую площадь соприкосновения белка с реагентами, высокую
скорость и непрерывность процесса секвенирования.
В настоящее время приборостроительная промышленность ряда развитых
стран мира производит автоматические секвенаторы, работающие по предло
103
женному Эдманом и Бэггом принципу вращающегося стакана. Разделение и
анализ образующихся фенилтиогидантоинов выполняется в них с помощью ме-
тода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Внешний вид одного из
таких секвенаторов представлен на рисунке ниже:
2.1.5.3 Секвенирование пептидных цепей на твердофазных носителях
В 1971 г. американский биохимик Ларсен предложил твердофазный
(ТФ) анализатор аминокислотной последовательности пептидов. Принцип дей-
ствия этого анализатора заключается в ковалентном связывании пептида с не-
растворимым носителем и последующем последовательном отщеплении ами-
нокислот от пептидной цепи по Эдману. Носитель с нанесенным на него пепти-
дом помещают в колонку, а в качестве элюэнта используются растворы соот-
ветствующих реагентов. ТФ-секвенатор технологичнее жидкофазного. Он по-
зволяет анализировать от 500 пмоль до 20 нмоль пептида. ТФ-секвенатор по-
зволяет определять последовательность в 20-30 аминокислотных остатков.
Можно анализировать и более крупные пептиды.
104
Носители для твердофазных секвенаторов. В качестве носителей для
ТФ-секвенаторов используют сополимеры на основе сшитого (сетчатого) поли-
стирола или пористых стекол.
Носители на ос-
нове полистирола. При-
меры получения некото-
рых смол-носителей на
основе сетчатого поли-
стирола приведены на
схеме.
Полимеры для ТФ-
секвенаторов должны
удовлетворять двум ос-
новным требованиям:
1.
функциональные группы полимеров должны быть доступны для пептидов
и реагентов;
2.
смола должна быть механически и химически устойчива в условиях реак-
ции Эдмана.
Носители на основе стекол. В 1973 в качестве носителей для ТФ-
секвенаторов были предложены пористые стеклянные шарики следующего со-
става: 96% кремнезема, 3-4% B
2
O
3
, 0.5% Na
2
O и следовые количества оксидов
других металлов. Они производятся в виде необработанных пористых шариков
модифицированных разными химическими методами.
Стеклянные шарики очень устойчивы к механическим повреждениям, но
заметно ухудшают свои свойства во времени под действием трифторуксусной
кислоты (ТФУ). Весьма чувствительны к фтороводороду (плавиковой кислоте).
P
P
NO
2
P
NH
2
P
CH
2
Cl
P
CH
2
Cl
NO
2
NNH
2
P
CH
2
NH (CH
2
)
2
NH
2
P
CH
2
NH(CH
2
)
2
NH
2
P
CH
2
(NH(CH
2
)
2
)
3
NH
2
(I)
(II)
(III)
(IV)
(V)
(VI)
(VII)
(VIII)
І)
Сетчатый полистирол
II)
Нитрополистирол
III)
Аминополистирол
IV)
Хлорметилированный
полистирол
V)
Этилендиамино-
полимтирол
VI)
Триэтилентриамино-
полистирол
VII)
Нитрохлорметил-
полистирол
VIII)
Аминоэтилендиамино-
полистирол
105
Химическая модификация стекол
Ведение аминогрупп. Для получения аминопропилстекла (АПС) и β-N-
аминоэтил-(3-аминопропил)стекла (β-АПС) пористые шарики CPG обрабаты-
вают 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС) и β-аминоэтил-(3-
аминопропил)триметоксисиланом (АЭАПТМС) соответственно.
Получение изотиоцианатного стекла. Для синтеза изотиоцианатами-
нопропильного носителя аминогруппы аминопропильного стекла активируют
п-фенилендиизотиоцианатом (ДИТЦ-стекло).
Аминопропилстекло
O
O
Si (CH
2
)
3
NH
2
стекло
O
SCN SCN
O
стекло
O
O
Si (CH
2
)
3
NH C NH
S
NCS
ДИТЦ-стекло
п-Фенилендиизотиоцианат
OH
OH
стекло
OH
(C
2
H
5
O)
3
Si(CH
2
)
3
NH
2
+
O
стекло
O
O
Si (CH
2
)
3
NH
2
Аминопропилстекло
OH
стекло
OH
OH
(CH
3
O)
3
Si(CH
2
)
3
NH(CH
2
)
2
NH
2
+
O
O
Si (CH
2
)
3
NH(CH
2
)
2
NH
2
стекло
O
2-Аминоэтил-
(
3-аминоп
р
опил
)
стекло
106
Ограничения. ДИТЦ-стекла можно применять только для анализа пепти-
дов, содержащих остатки лизина или аминоэтилцистеина, по месту расположе-
ния которых ПП-цепь присоединяется к носителю (стеклу). Пептиды, которые
имеют вышеназванные остатки внутри цепи можно анализировать только до
этих остатков, т.е. до точек присоединения. Метод неприменим для аргининсо-
держащих пептидов.
Связывание пептидов с носителем
Определяющей стадией при ТФ-секвенировании является присоединение
пептида к носителю. Эта операция называется иммобилизацией. Используют
преимущественно два способа присоединения пептидов к ТФ-носителям.
1.
Присоединение по
α- и ε-аминогруппам
пептидной цепи. Пеп-
тиды с остатками лизина
или аминоэтилцистеина,
расположенными как
внутри цепи так и на С-
конце пептида, эффек-
тивно присоединяются
свободными аминогруп-
пами к смолам на основе
стирола или к амино-
пропильным стеклам по-
средством ДИТЦ
2.
Присоединение по карбоксильной группе. Карбоксильную группу С-
концевой аминокислоты пептида можно связать ковалентно с аминополистиро
NH
2
CH C
R
1
O
NH A
1
A
2
A
3
Lys COOH
NH
2
NH
2
NH
2
смола
+
ДИТЦ
NH NH
CC
NH NH
SS
NH NH
CCSS
CH C
R
1
O
NH A
1
A
2
A
3
Lys COOH
NH
HN
ДИТЦ-
фрагмент
Смола
Пептид
107
лом и аминопропилстеклом посредством карбодиимида. Этот метод применим
практически ко всем пептидам и может быть использован в микроварианте.
Секвенирование пептидов на твердофазных носителях осуществляют
с использованием метода Эдмана или описанных ниже его модификаций.
1.
Метод ФИТЦ-ДАБИТЦ. ДАБИТЦ - это аналог ФИТЦ - 4-N-N-
диметиламино-азобензол-4’-изотиоцианат:
(CH
3
)
2
NNNNCS
ДАБИТЦ образует гидантоин с коэффициентом экстинкции в 2 раза большим,
чем с ФИТЦ. Это существенно повышает чувствительность и позволяет анали-
зировать 10-50 пмоль образца.
Недостаток ДАБИТЦ: при обычной температуре он реагирует не количе-
ственно. Поэтому применяют двойное карбамоилирование. Вначале с
ДАБИТЦ, а затем с ФИТЦ.
2.
Метод ДНС – Эдмана. По этому методу перед каждым циклом деграда-
ции пептидной цепи отбирают определенную аликвотную часть раствора для
анализа N-концевой аминокислоты в виде дансильного производного. Остав-
шийся раствор пептида анализируют по Эдману. При этом опускается стадия
промывки ФТК-пептидов от избытка ФИТЦ и его побочных продуктов, что
уменьшает потери веществ в ходе анализа.
2.1.5.4 Предварительные исследования белков перед секвенированием
Прежде, чем приступить к секвенированию белок подвергают некоторым
предварительным исследованиям:
1.
Очищают.
2.
Определяют тип и число простетических групп. Иногда простетическую
группу перед секвенированием отделяют от пептидной цепи.
108
3.
Определяют наличие внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей.
Этот тип связей есть не во всех белках, но если она есть, то она играет обычно
важную роль. Такие связи обнаруживают химической модификацией:
NC
S
S
NC
NC
SH
SH
NC
NC
SO
3
-
SO
3
-
NC
восстановл.
окисление
Избирательным и удобным методом расщепления S-S связей является
восстановление. Типовая методика сводится к обработке белка избытком низ-
комолекулярного тиола. В качестве тиолов используют: цистеин, восстанов-
ленный глутатион, 2-меркаптоэтиламин, тиогликолевую кислоту меркаптоэта-
нол - HSCH
2
CH
2
OH, реагент Клеланда - HSCH
2
(CHOH)
2
SH и др.
После восстановления SH-группы легко окисляются кислородом воздуха
с замыканием S-S-связей. Поэтому восстановленные SH-группы защищают не-
посредственно в реакционной смеси, в которой проводилось восстановление.
Для защиты SH-групп используют: этиленимин
SH CH
2
NH
CH
2
SCH
2
CH
2
NH
2
+
4-винилпиридин
SH CH
2
CH
N
CH
2
N
CH
2
S
+
и ряд других алкилирующих агентов.
109
Дисульфидные связи можно восстанавливать другими реагентами, на-
пример боргидридом натрия. Однако, эти методики практически не находят
применения в химии белка из-за побочных реакций. Так, например, боргидрид
натрия расщепляет пептидные связи, диборан восстанавливает карбоксильные
группы.
Иногда восстановление S-S-связей в белках проводят на ртутном капель-
ном электроде, т.е. электрохимически. Для окисления часто используют надму-
равьиную кислоту.
Помимо дисульфидных связей в белках встречаются и иные типы меж-
молекулярных связей, которые с трудом поддаются анализу и специфическому
расщеплению. Это альдиминовая связь (I) в коллагене, десмозин (II) и изодес-
мозин в эластине, изопептидные связи между ε-аминогруппой лизина и амид-
ной группой глутамина (III) в экстрацеллюлярных структурных белках и, по-
видимому, ди- и тритирозины (IV).
CH
N
CH
2
CHOH
N
(CH
2
)
2
CO
NH
(CH
2
)
4
OH
OH
(I)
Дегид
р
о
гид
р
окси
лизин
норлейцин
(II)
Десмозин
(III)
ε
-(
γ
-глутамил)-
лизин
(IV)
Дитирозин
Для идентификации альдиминной связи в коллагене, ее вначале стабили-
зируют в белке восстановлением цианоборгидридом натрия. Затем проводят
ферментативный гидролиз и выделяют сшитые между собой пептиды. Эти
фрагменты идентифицируют, используя восстанавливающий агент с тритиевой
меткой.
110
Десмозины в эластине выявляют восстановлением белка NaBD
4
в воде
или в D
2
O. Проводят гидролиз и анализируют аминокислоты хроматографиче-
ски или методом масс-спектрометрии.
Наиболее известным изопептидным фрагментом типа (ІІІ) является ε-(γ-
глутамил)лизин. После полного ферментативного гидролиза белка этот фраг-
мент можно выявить непосредственно методами анализа аминокислот.
4.
Определяют наличие в белке сульфгидрильных (S-H) групп цистеина. Од-
ним из эффективных методом является обработка белка 5,5’-дитиобис-2-
нитробензойной кислотой (реагент Элмана). Он избирательно реагирует со сво-
бодными SH-группами, образуя модифицированный белок и окрашенный тио-
нитробензоатанион (λ
max
= 412 нм.). Это позволяет проводить после соответст-
вующей калибровки количественный анализ.
S H O
2
NSSNO
2
-
OOC
COO
-
-
H
+
Реактив Элмана
SS NO
2
COO
-
S
-
NO
2
COO
-
Модифицированный белок дианион тионитробензоата
5.
Предварительная обработка белков, имеющих четвертичную структуру,
для разделения (диссоциации) интактных агрегатов и выделения индивидуаль-
ных пептидных цепей. Диссоциация белковых агрегатов достигается простыми
но эффективными приемами: изменение рН, обработка ПАВ (додецилсульфат
111
натрия, например), слабое нагревание, многократное повторение с небольшой
амплитудой температур процедуры замораживание-оттаивание.