Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

Сульфгидрильные протеазы ингибируются избытком алкилирующих

агентов, например, иодуксусной кислотой. Металлоферменты ингибируют хе-

латирующими добавками. Это может быть в частности , этилендиаминтетраук-

сусная кислота (ЭДТА).

2.1.4.2 Характеристика протеаз с высокой специфичностью

Из ферментов этого типа наиболее важен трипсин. Широкое применение

находит также протеаза V8 из S.aureus. Этот фермент гидролизует пептидные

связи по остаткам дикарбоновых кислот, в основном глутаминовой. Недавно

выделена новая протеаза из мутанта Pseudomonas fragi, которая гидролизует

связь по аминогруппе остатков аспрагиновой и цистеиновой кислот.

Трипсин - сериновая протеаза. Один из наиболее доступных высокоспе-

цифичных ферментов. Его получают из различных источников. Специфичность

трипсина не абсолютная. Он гидролизует пептидные связи со стороны карбок-

сильной группы лизина и аргинина со всеми остальными белковыми аминокис-

лотами, кроме Про. Присутствие кислотных остатков вблизи атакуемой связи

резко уменьшает скорость гидролиза или вообще останавливает его. Скорость

снижают также положительно заряженные группы.

Описаны случаи неспецифического действия трипсина, когда гидролизу

подвергались пептидные связи расположенные вблизи ароматических или гид-

рофобных аминокислотных остатков, а также расщепление связей Арг-Про в

цепочках Три-Арг-Про-Ала и Ала-Арг-Про-Ала.

Условия гидролиза. Трипсин имеет максимальную активность при рН=7-

9. Обратимо инактивируется при рН<4. Склонен к автолизу (авторасщепление),

поэтому фермент растворяют в 10 мМ HCl и хранят замороженном состоянии.

В этих условиях он устойчив неделями. Гидролиз трипсином проводят в 0.1 М

аммонийбикарбонатном буфере при соотношении фермент : субстрат 1:50-100,

Т=37

С, в течении 1 - 4 часов. Фермент необратимо инактивируется (ингибиру

ется) ДФФ и ФМСФ. Для трипсина известен ряд специфичных ингибиторов,

например трипсиновый ингибитор из сои.

Тромбин - доступный и высокоспецифичный фермент, однако для рас-

щепления белков практически не применяется. Причина, вероятно, в том, что

выпускаемые различными фирмами препараты тромбина широко варьируют по

степени очистки и активности.

Протеаза V8 из Staphylococus aureus. Эту сериновую протеазу выделяют

из штамма S.aureus и производят серийно в форме коммерческого препарата.

Специфичность - расщепляет в основном пептидную связь со стороны

карбоксильной группы глутаминовой кислоты с любой другой аминокислотой

кроме Про и Глу. На субстратную специфичность влияет состав буферной сме-

си. Известны случаи неспецифического действия. Затрагивается главным обра-

зом связь Сер-Х.

Условия гидролиза: рН=3.5-9.5, максимальная активность наблюдается

при двух значениях рН: 4.0 и 7.8. Буфер - 50 мМ ацетат аммония. Т=37

С, время

гидролиза - до 18 часов. Ингибируется ДФФ. Фермент сохраняет активность в

0.2% растворе дансилнатрия (ДСН) и 50% активности в 4 М мочевине. Это по-

зволяет применять его в денатурирующих условиях.

Клострипаин - сульфгидрильная протеаза. Выделена из Clostridium his-

tolyticum. Фермент выпускают в виде коммерческого препарата.

Специфичность - гидролизует пептидные связи со стороны карбоксиль-

ной группы аргинина с любой другой аминокислотой. Иногда расщепляет связь

Лиз-Х. Это направление гидролиза можно ограничить или пресечь, варьируя

условия. Условия гидролиза - максимум активности при рН=7.7 в присутствии

сульфгидрильных реагентов. Способствуют гидролизу ионы Са

, хотя их при-

сутствие не обязательно. Соотношение фермент:субстрат - 1:50. Буфер - 100

мМ NH

HCO

в дитиотреите (ДТТ): SHCH

-CH(OH)-CH(OH)-CH

SH. Темпера-

тура - 25

С, время - 4 часа.

Протеаза из подчелюстной железы мыши - сериновая протеаза. Выде-

лена из подчелюстной железы мыши. Расщепляет пептидные связи со стороны

карбоксильной группы аргинина со всеми аминокислотами, за исключением

связей Арг-Вал, Арг-Арг. По специфичности фермент аналогичен клострипаи-

ну, однако практически не затрагивает связи Лиз-Х.

Условия гидролиза: буфер - 1% NH

HCO

, рН=8, Т=37

С, время до 24 ча-

сов соотношение фермент : субстрат - 1 : 50. Гидролиз тормозится подкислени-

ем среды соляной кислотой до рН=1.5-2.

Протеаза из Armillaria mellea представляет собой Zn

-содержащий ме-

таллопротеин. Фермент выделен и получен в виде чистого активного препарата

с молекулярной массой 14000 и максимумом активности при рН=6.8. В виде

коммерческих образцов пока не производится.

Специфичность. Гидролизует пептидные связи со стороны аминогруппы

лизина и аминоэтилцистеина (Аес) типа Х-Лиз, даже если Х=Про. Устойчивы к

действию фермента пептидные связи, содержащие вблизи остатков Лиз кислот-

ные остатки. Иногда расщепляет связь Арг-Х (со стороны карбоксильной груп-

пы Арг). Степень гидролиза возрастает если Х = Лей, Иле.

Условия гидролиза: - 0.2 М N-этилморфолинацетатный буфер, рН=8, со-

отношение фермент : субстрат - 1:100, Т=35

С, время до 22 часов, или 0.1 М

HCO

, соотношение 1:500-1000, Т=37

С.

Постпролинспецифичный фермент. Пролин - редкая аминокислота.

Пока известен и испытан только один постпролинспецифичный фермент, выде-

ленный из почек ягненка. По предварительным данным - это сериновая протеа-

за.

Специфичность. На коротких пептидах (не более 13 аминокислот) пока-

зано, что фермент расщепляет все связи Про-Х, за исключением Про-Про. Ско-

рость гидролиза зависит от Х. Она максимальна, если Х обладает гидрофобны-

ми свойствами и минимальна если Х - кислая или основная аминокислота.

Фермент затрагивает связи Ала-Х, но скорость гидролиза в 100-1000 раз мень-

ше, чем по связи Про-Х.

Условия гидролиза: рН = 7.5 - 8.0 (максимум активности), буфер 100 мМ

HCO

и по 1мМ ДТТ и ЭДТА, температура 22

С, время 24ч.

2.1.4.3 Характеристика протеаз с широкой специфичностью

Ниже кратко описаны не все протеазы этого класса, но большинство из

часто применяемых в лаборатории.

Химотрипсин - сериновая протеаза. Один из наиболее специфичных

ферментов этого класса. Он широко применяется для получения первичных

гидролизатов.

Специфичность - гидролизует, в основном, пептидные связи со стороны

карбоксильной группы ароматического или объемного гидрофобного остатка

аминокислоты типа Н-Х, где Х=Тир, Три, Фен, Лей. Устойчива связь Н-Про.

Может расщеплять также по остаткам Гис, Иле, Мет, Сер, Вал.

Условия гидролиза: 100 мМ NH

HCO

, соотношение фермент : субстрат -

1 : 50, Т = 37

С, время 4 ч. Ингибируется соевым ингибитором трипсина.

Термолизин применяется очень широко для определения аминокислот-

ной последовательности белков. Производится в виде коммерческого препара-

та.

Специфичность: гидролизует пептидные связи со стороны аминогруппы

гидрофобных аминокислотных остатков типа Х-Н, где, в большинстве случаев,

Н= Вал, Лей, Иле, Фен, Тир, Три. Хорошо гидролизует также пептидные связи

с Ала, фрагмент Про-Иле. Редко отмечается гидролиз по остаткам: Асн, Тре,

Гис, Глу. Гидролиз термолизином ингибируется соседними α-амино- или α-

карбоксильными группами, следовательно, он не обладает экзопептидазной ак-

тивностью (по пептидной связи с концевой аминокислотой). Амино- и карбок-

сильные группы в боковых цепях аминокислот не оказывают заметного влия-

ния на активность фермента.

Протеаза получила название "Термолизин" потому, что сохраняет 100%

активность в течении 1ч при Т=60

С, и значительную активность при 80

С.

Кроме того, этот фермент устойчив в 8 М мочевине, 20% этаноле или метаноле.

В этих условиях, однако, повышается вероятность его термической денатура-

ции

Условия гидролиза: рН = 7 - 8, требует наличия ионов Са

, буфер: 100

мМ NH

HCO

, содержащий 5мМ СаCl

, соотношение фермент : субстрат 1:50,

Т=37

С, время - 4 ч. Фермент ингибируется ЭДТА.

Пепсин - практически единственная хорошо изученная и доступная в ви-

де коммерческого препарата кислая протеаза.

Специфичность: расщепляет, преимущественно, пептидные связи с аро-

матическими и объемными алифатическими аминокислотными остатками. Ха-

рактеризуется, к сожалению, выраженной специфичностью и к ряду других

пептидных связей, поэтому окончательный результат частичного гидролиза

предсказать трудно. Фермент применяется для ограниченного протеолиза на-

тивных белков.

Условия гидролиза: рН = 1 - 5 (оптимум рН = 2), буфер - 10 мМ HCl или

5% CH

COOН. Инкубация с пепсином приводит к получению коротких пепти-

дов с правильно замкнутыми дисульфидными связями. Фермент необратимо

ингибируется при рН ≥ 6.

Папаин - сульфгидрильная протеаза. Ее выделяют из латекса дынного

дерева. Налажено производство препарата в товарном виде рядом фирм.

Специфичность: в целом, папаин гидролизует самые разнообразные пеп-

тидные связи, поэтому результат гидролиза практически непредсказуем. Фер-

мент применялся для получения крупных фрагментов нативных белков. На-

пример, иммуноглобулинов, миозина, экстрацеллюлярного фрагмента антиге-

нов гистосовместимости человека и др.

Условия гидролиза: максимум активности в диапазоне рН = 5 - 7.5, акти-

вацию фермента проводят в присутствии сульфгидрильных реагентов, буфер-

0.2 М пиридин-ацетатный буфер (рН = 6.5) с добавкой 1% 2,3-

димеркаптопропанола-1, соотношение фермент : субстрат 1 : 50, Т = 37

С, вре-

мя гидролиза - 1ч. Фермент инактивируется при окислении солями тяжелых

металлов или цианат-ионами в присутствии цистеина. Устойчив в деионизиро-

ванном растворе мочевины (вплоть до 8 М мочевины).

Эластаза - сериновая протеаза, гомологичная трипсину и химотрипсину.

Производится несколькими фирмами.

Специфичность: обладает широкой специфичностью. Гидролизует пре-

имущественно пептидные связи по карбоксильной группе аминокислот с не-

большим углеводородным (гидрофобным) радикалом в боковой цепи, например

Ала. Условия гидролиза такие же как для трипсина и химотрипсина.

α-Протеаза из Crotalus atrox - выделяют из яда Crotalus atrox. Выпуска-

ется в товарном виде. Специфичность: гидролизует пептидные связи со сторо-

ны аминогруппы гидрофобных аминокислотных остатков. По специфичности

аналогична термолизину. Условия гидролиза окончательно не установлены.

Максимум активности в диапазоне рН = 7.5 - 8.

На практике наиболее часто используют трипсин, химотрпсин, термоли-

зин и протеиназу V8 из Staphylococus aureas.

Различают исчерпывающий и ограниченный протеолиз. Исчерпывающе-

му гидролизу подвергается, как правило, белок в денатурированном состоянии.

Нативный белок гидролизуется по поверхности глобулы. Ограниченный проте-

олиз можно осуществить в условиях, когда активность фермента понижена:

уменьшение температуры, выбор значений рН за пределами оптимальных,

уменьшение соотношения фермент - субстрат и т.д.

2.1.5 Химическая фрагментация

Помимо ферментативного расщепления белковых молекул используется

и химическая фрагментация. Для этих целей применят химические реагенты,

которые способны специфически взаимодействовать с отдельными аминокис-

лотами в пептидах с расщеплением соответствующей пептидной связи.

Такая фрагментация проводится:

по метионину бромцианом (BrCN);

по триптофану N-бромсукцинимидом (NBS);

по триптофану смесью диметилсульфоксида (DMSO) с галогенводородом

(HGal);

по триптофану бромцианом в гептафтормасляной кислоте;

по триптофану о-иодбензойной кислотой;

по тирозину N-бромсукцинимидом;

по связи Асн-Гли гидроксиламином;

по связи Асп-Про частичным кислотным гидролизом

Метионин и триптофан являются относительно редкими аминокислота-

ми, поэтому после специфического расщепления по точкам их расположения в

пептидных цепях белков образуются довольно большие фрагменты (40-80 ос-

татков). Расщепление по пп. 7 и 8 дает еще более крупные фрагменты.

2.1.5.1 Механизмы реакций химической фрагментации

Расщепление по метионинину бромцианом основано на взаимодействии

бромциана с

тиоэфирной

группой ме-

тионина с об-

разованием

циансульфо-

ниевой соли.

Процесс даль-

нейших пре

HCH CO

HCHR'CO

(

)

HCH C

CHR'CO

HCH C

CHR'O

HCH COOH

Гомосе

ин

Гомосе

ин

лактон

Иминолактон гомосе

ина

вращений этой соли представлен на схеме.

Впервые бромциан был применен при исследованиях рибонуклеазы. Од-

ной из наиболее длинных белковых цепей, которые удалось расщепить с помо-

щью бромциана является β-галактозидаза из E.Coli (1021 аминокислотных ос-

татков).

Условия проведения реакции. Комнатная температура, 15-30 часов, среда

- 70% НСООН, 100 кратный избыток бромциана. Связи мет-Х расщепляются на

90-100%. По избирательности эта реакция уникальна. Для расщепления очень

устойчивых фрагментов Мет-Сер, Мет-Тир реакцию лучше проводить в водной

трифторуксусной кислоте. Во всех полученных фрагментах С-концевые остат-

ки представляют собой гомосеринлактон.

Осложнения: в присутствии бромциана идет окисление цистеина до цис-

тина и дальше до цистеиновой кислоты. Избыток бромциана бромирует остатки

тирозина и расщепляет пептидные цепи по остаткам триптофана.

Замена 70% муравьиной кислоты более сильной гексафтормасляной и

увеличение избытка бромциана (до 10000 моль/моль белка) повышает выход

продуктов гидролиза пептидных цепей по триптофану.

Расщепление по триптофану. Методы селективного расщепление пеп-

тидных связей по остаткам триптофана основаны на высокой реакционной спо-

собности индольного ядра. Таких методов несколько.

По триптофану N-

бромсукцинимидом.

Условия: комнатная

температура, 2 часа, рН

= 4.0, 2 - 3 кратный из-

быток NBS. Пептиды

расщепляются на 50 -

90%, белки - на 10 -60%.

CHCH

бромсукцинимид

В последнее время для расщепления пептидов и белков по остатку трип-

тофана применяют главным образом 2-(2-нитрофенилсульфенил)3-бромо-3-

метилиндоленил (BNPS-скатол). Этот реагент получают бромированием 2-(2-

нитрофенил-сульфенил)-3-метилиндола (I) N-бромсуцинимидом в ледяной ук-

сусной кислоте:

HNO

N-бромсукцинимид

BNPS-скатол

(I)

BNPS-скатол, по сравнению с N-бромсукцинимидом, действует более из-

бирательно. Выполнены многочисленные исследования по применению BNPS-

скатола в химии белка. Выход продуктов избирательного расщепления по

триптофану колеблется в пределах 40-80%. Не исключено, что выход определя-

ется качеством реагента.

BNPS-скатол разлагается при комнатной температуре под действием све-

та с выделением брома. Однако, хорошо очищенные кристаллические препара-

ты (бледно-желтые звездочки из лигроина) хранятся в герметичной упаковке

при 20

С достаточно долго.

По триптофану в системе DMSO-галогенводородные кислоты

Расщепление по триптофану смесью DMSO-HBr проводят в уксусной ки-

слоте. По выходу продуктов реакции этот метод сопоставим с расщеплением

BNPS-скатолом и предпочтительнее его по доступности реагентов и простоте

реализации.

Механизм реакции - окислитель-

ное галогенирование индольного ядра

триптофана. Галогенирование ядра

осуществляется промежуточными про-

дуктами реакции между DMSO и HGal

(дигалогенид сульфида (I), галогенид

галогенсульфония (II), свободный га-

логен)

Непосредственное взаимодействие триптофансодержащих пептидов с

DMSO-HBr приводит к образованию промежуточного продукта - 2-

диметилсульфонийтриптофана:

CHHN CO

, H

иметилс

ль

оний-

ипто

ан

Расщепление по Три о-иодбензойной кислотой проводят в 80% уксусной

кислоте с добавками 4 М солянокислого гуанидина. Согласно последним дан-

ным метод не очень специфичен. Побочно идет расщепление по остатку тиро

SO HGal

SGal

Gal

S Gal

(I)

(II)