Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

132

ры. Успешное решение этой задачи явилось результатом кропотливых исследо-

ваний на протяжении 25 лет, которые выполнены Перутцем с сотрудниками в

Кембридже. Одновременно и параллельно в этой же лаборатории был исследо-

ван методом РСА и миоглобин.

Молекула гемоглобина состоит из двух идентичных α- и двух β-цепей.

Каждая цепь вместе с гем-группой очень сходна с молекулой миоглобина. Каж-

дая из 4-х цепей свернута нерегулярным образом и состоит из ряда α-

спиральных участков, разделенных между собой местами сгибов. Подобно ми-

оглобину, α- и β-цепи гемоглобина содержат около 70% α-спиральных участ-

ков.

По третичной структуре α- и β-цепи очень близки. Они состоят из α-

спиральных участков одинаковой длины, согнутых под одинаковыми углами и

в одних и тех же направлениях. Кроме того, обе цепи гемоглобина имеют весь-

ма сходную с миоглобином третичную структуру. Это сходство связывают со

значительным числом одинаковых аминокислотных остатков в ключевых по-

ложениях пептидной цепи.

Многие олигомерные белки диссоциируют на субъединицы при высоких

и низких значениях рН, а также под действием больших концентраций мочеви-

ны или солей.

Денатурируют олигомерные белки в две стадии:

¾ первая стадия - разделение на субъединицы (отдельные цепи);

¾ вторая - разворачивание (денатурация) отдельных цепей.

Олигомерные белки наделены способностью к самосборке. Например, в

смеси, содержащей α- и β-цепи при благоприятных условиях идет самосборка

гемоглобина. Этот факт свидетельствует о том, что в аминокислотной последо-

вательности (первичной структуре) белков закодированы все структурные осо-

бенности вторичной, вторичной, третичной и четвертичной структур. Одна из

133

отличительных особенностей олигомерных белков - способность проявлять

кооперативный эффект.

Суть кооперативного эффекта рассмотрим на конкретном примере. Срав-

ним между собой процессы насыщения кислородом молекул миоглобина (од-

ноцепочечный белок, не имеющий четвертичной структуры) и гемоглобина -

олигомерного белка. Полученные в эксперименте кривые насыщения кислоро-

дом для этих двух белков существенно различаются между собой (см.рис.2.4).

Рис. 2.4

Кривые поглощения кислорода миоглобином и гемоглобином

Кривая с насыщением у миоглобина характерна для процесса связывания

единственного лиганда. Сигмоидная кривая характерна для белков с несколь-

кими пептидными-цепями. В данном случае проявляется положительный коо-

перативный эффект. Подобное явление можно наблюдать у белков с различны-

ми функциями.

Качественно, положительную кооперативность можно описать так. Пер-

воначальное связывание одного лиганда в олигомерной молекуле белка облег

134

чает связывание второго лиганда этой молекулы, затем третьего, четвертого и

т.д. В гемоглобине, в частности, связывание молекулы О

с первой гем-группой

облегчает связывание с кислородом второго гема, третьего и четвертого.

В основе кооперативной связи между субъединицами в олигомерной мо-

лекуле белка лежит аллостеризм. Суть аллостеризма состоит в том, что белко-

вые молекулы способны принимать различные конформации в пространстве с

различной активностью. Важность этого свойства белков весьма велика. Очень

многие ферменты, контролирующие регуляторные функции (функции, обеспе-

чивающие поддержание требуемых скоростей реакций), относятся к классу

олигомерных белков.

2.2.4.1 Функциональное значение четвертичной структуры белка

Четвертичная структура характеристична для каждого белка не только с

точки зрения его пространственного строения, но и с позиций функциональной

направленности. Вместе с тем, с четвертичной структурой связывают и некото-

рые общие признаки присущие белкам, имеющим этот уровень структурной ор-

ганизации.

Ранее предполагалось, что образование четвертичных структур - это один

из путей уменьшения ошибок трансляции пептидных цепей в процессе биосин-

теза. Так, например, даже одна ошибка при трансляции пептидной цепи из 1000

аминокислот может привести к тому, что такая белковая молекула не сможет

принять необходимую пространственную конформацию, т.е. окажется функ-

ционально непригодной. Если же белок построен из 4-х пептидных цепей по

250 звеньев, то вероятность трансляционной ошибки существенно уменьшает-

ся. Результаты последних исследований убеждают однако в том, что такие

предположения, видимо, не верны. Ошибки трансляции практически не про-

слеживаются даже в биосинтезе белковых молекул, состоящих из нескольких

тысяч аминокислотных остатков, если специально не вмешиваться в генетиче-

ский аппарат клетки.

135

Более привлекательные гипотезы в отношении роли и значимости четвер-

тичной структуры белков состоят в следующем.

Объединение нескольких взаимосвязанных функций. Эта особенность

четвертичной структуры реализуется через размещение нескольких функцио-

нальных центров по отдельным пептидным цепям объединенного в четвертич-

ную структуру олигомерного белка. Так устроены, например, РНК-полимераза,

крупные полиферментные комплексы.

Архитектурная функция. Четвертичная структура позволяет формировать

из отдельных субъединиц самые различные объемные формы, которые и обес-

печивают специальные функциональные возможности белка. Например, моле-

кула ферритина построена из 24-х субъединиц собранных таким образом, что

внутри общей глобулы образуется полость. В этой полости запасается и хра-

нится до 3500 группировок FeO

OH. Другой пример - активные центры ряда де-

гидрогеназ формируются только после образования четвертичной структуры

аминокислотными остатками различных субъединиц.

Регуляторная функция. Это главная функциональная особенность белка,

которая обеспечивается его четвертичной структурой. Проявляется она рас-

смотренным выше кооперативным эффектом.

2.2.4.2 Гибридные олигомерные белки

Некоторые олигомерные белки существуют в двух, трех и более про-

странственных формах. Эта особенность белков была впервые обнаружена в

1957 г. для тетрамерного фермента лактатдегидрогиназы и затем выявлена для

многих других белков. Гибридные формы называют изоферментами или изози-

мами. Существование изозимов обусловлено комплексообразованием разных

пептидных цепей в разных соотношениях. Например, семейство изозимов тет-

рамеров лактатдегидрогеназы включает в себя пять гибридных форм, состав-

ленных из различных комбинаций двух разных пептидных цепей, обозначае

136

мых как Н и L - это H

- , H

L- , H

-, HL

, L

лактатдегидрогеназа. Эти белки-

изозимы можно разделить методом электрофореза.

Соотношение изоферментов в биологических средах является, как прави-

ло, определенным и постоянным. Эта особенность не имеет пока строгого объ-

яснения, но используется в диагностике патологий.

2.2.5 Домены в белках

Молекулы белков с большой ММ (более 14-16 кДа) склонны формиро-

ваться в относительно независимые глобулы, составленные из отдельных уча-

стков пептидной цепи. Каждая из этих глобул имеет свое гидрофобное ядро,

окруженное мозаичной поверхностью гидрофобных и гидрофильных элементов

цепи. Эти структурные образования внутри одной и той же молекулы белка на-

званы доменами.

Домены определяют как области третичной структуры, которым присуща

определенная анатомия структурной организации. Молекулу белка часто удает-

ся расчленить на отдельные домены, подвергнув ее частичному гидролизу.

Помимо структурной организации, домены нередко различаются своими

биологическими функциями, т.е. обладают функциональной специфичностью.

Например, нуклеотидсвязывающий домен дегидрогеназ, независимо от функ-

ции фермента и способа укладки его пептидной цепи, отвечает за связывание с

коферментом NAD или NADH. Аминоконцевые домены (криглы) ферментов

системы свертывания крови, обеспечивают связывания с липидами мембраны и

другими белками. Аминоконцевые домены иммуноглобулинов содержат центр

связывания антигена и т.д.

Однозначно определить функциональную роль отдельных доменов уда-

ется, однако, далеко не всегда. Например, молекула протеолитического фер-

мента папаина содержит два хорошо различимых домена, однако функцио-

нальная направленность каждого из них пока не ясна (см рис. 2.5).

137

Рис. 2.5

Домены в пептидной цепи протеолитического фермента папаина

Домены формируются чаще всего автономным свертыванием последовательно

расположенных участков пептидной цепи. Известны, однако, случаи формиро-

вания доменов и далеко отстоящими друг от друга отрезками участками одной

и той же молекулы.

Предполагают, что домены относятся к раннему этапу эволюции про-

странственной структуры белков, которые образовались из менее крупных гло-

бул. Например, маленькая молекула протеазы вируса иммунодифицита челове-

ка (ВИЧ) имеет пептидную цепь, состоящую из 99 аминокислотных остатков.

Она имеет два домена и по структуре этих доменов очень сходна с протеазой

пепсином. Эти две протеазы весьма сходны и по своему действию. Предпола-

гают, поэтому, что протеаза ВИЧ является более ранним предшественником

пепсина.

По устоявшемуся мнению домены - есть промежуточный подуровень

структурной организации белка на пути от вторичной к третичной структуре.

Не исключено, что процесс упаковки молекулы белка в третичную структуру

включает стадию формирования доменов..

138

2.3 Поведение белков в растворах

2.3.1 Кислотно-основные свойства белков

Кислотно-основные свойства нативных белков определяются, главным

образом, наличием в них и числом ионизируемых R-групп в аминокислотных

остатках. Две концевые функциональные группы пептидной цепи: амино- и

карбоксигруппа практически не оказывают влияния на кислотно-основные

свойства белковой молекулы в целом.

Степень ионизации функциональных групп в R-остатках, входящих в

белковую молекулу аминокислот определяется не только его первичной струк-

турой (аминокислотной последовательностью), но и структурами более высо-

кой иерархии. Нельзя, поэтому, только на основании известной аминокислот-

ной последовательности в точности предсказать кислотно-основные свойства

белковой молекулы и ее суммарный заряд.

Рассмотрим кривую потенциометрического тирования рибонуклеазы.

0 5 10 15 20 25 30

Эквиваленты ОН

→

рН

Зона рН, в которой молекула

имеет суммаррный

отрицат. заряд

Зона рН, в которой

молекула имеет

суммарный

положительный заряд

Изоэлектрическая

точка, рН = 9.6

Рис. 2.6

Кривая потенциометрического тирования рибонуклеазы

139

Пептидная цепь

молекулы этого белка свернута в плотную глобулу, состоящую

из 124 аминокислот, последовательность которых известна. Помимо концевых

остатков с -NH

и -COOH группами, в пеп-

тидной цепи содержится 34 ионизируемые R-

группы, большая часть которых обладает ос-

новными свойствами. Поэтому кривая титро-

вания имеет достаточно "сглаженную" форму,

по сравнению с кривыми титрования простых

соединений, например двухосновной кислоты

(см. рис.).

Как видно из кривой титрования рибо-

нуклеазы (см. рис. 2.6), изоэлектрическая точ-

ка для этого белка смещена в сторону больших значений рН, т.е. для молекулы

в целом характерны основные, а не кислотные свойства. Очень сходные резуль-

таты были получены при титровании β-лактоглобулина, яичного альбумина и

ряда других глобулярных белков. На основании полученных данных был сде-

лан вывод о доступности подавляющего большинства входящих в пептидную

цепь ионизирующихся R-групп кислотно-основному титрованию. Этот вывод

хорошо согласуется с данными рентгеноструктурного анализа о том, что почти

все ионогенные R-группы в глобулярных белках расположены на внешней по-

верхности молекулы, а большинство неполярных (гидрофобных) групп скрыто

внутри клубка. В некоторых глобулярных белках одна или несколько ионизи-

рующихся R-групп тем не менее не тируются. Предполагают, что они либо на-

ходятся внутри глобулы, либо вовлечены в образование прочных водородных

связей. Так например, в миоглобине 5 из 11 содержащихся в нем R-групп гис-

тидина удается оттитровать только после денатурации белка.

Для белков, так же как и для аминокислот характерно наличие изоэлек-

трических точек, т.е. таких значений рН, при которых их молекулы имеют сум-

марный нулевой заряд. На этом свойстве основан метод изоэлектрофокусиров

Количество добавленных

эквивалентов ОН

→

pKa1

pKa2

Точки нейтрализации

Кривая титрования двухосновной

кислоты

140

ки белков. Положения изоэлектрических точек определяются числом и типом

входящих в белок аминокислот с ионизирующимися R-группами. Изоэлектри-

ческая точка будет располагаться тем выше величины рН = 7, чем больше в

пептидной цепи белка содержится основных R-групп, например, Лиз, Арг. И

наоборот, чем больше в молекуле белка кислотных R-остатков (Асп, Глу и др.),

тем ниже величина изоэлектрической точки. У большинства глобулярных бел-

ков изоэлектрические точки лежат в пределах рН 4.5 - 6.5 (см. табл. 2.1)

Таблица 2.1

Положения изоэлектрических точек некоторых белков

Белок рН изоэлектрической точки

Пепсин < 1.0

Яичный альбумин 4.6

Сывороточный альбумин 4.9

Уреаза 5.0

β-Лактоглобулин

5.2

-Глобулин

5.6

Гемоглобин 6.8

Миоглобин 7.0

Химотрипсиноген 9.5

Цитохром с 10.65

Лизоцим 11.0

Кривые потенциометрического титрования позволяют определять вели-

чину и знак суммарного заряда белковой молекулы при заданном значении рН.

При рН выше изоэлектрической точки молекула белка заряжена отрицательно и

в электрическом поле будет двигаться к аноду. По мере повышения рН величи-

на отрицательного заряда белковой молекулы будет возрастать в соответствии с

формой кривой титрования. При рН ниже изоэлектрической точки молекула

белка заряжена положительно и движется к катоду.

Вид кривой титрования сильно зависит от присутствия в растворе ней-

тральных солей. Они по разному влияют на степень ионизации отдельных R-

141

групп. Кроме того белки склонны связывать неорганические катионы (Cu

, например) и анионы (например, хлор- и фосфат-ионы). По этой причине

положение изоэлектрической точки для одного же белка может значительно

варьировать в зависимости от состава среды.

2.3.2 Осаждение белков из растворов в виде солей

Большинство белков полностью осаждаются из водных растворов неко-

торыми кислотами. Наиболее часто для этих целей используют трихлоруксус-

ную и хлорную кислоты. Они образуют с белками водонерастворимые соли.

Эти кислоты широко применяют для «осветления» биологических жидкостей

или клеточных экстрактов перед анализом низкомолекулярных или других не-

белковых компонентов смесей. Например, глюкозы, аминокислот, нуклеиновых

кислот, углеводов, липидов и др.

Хорошими осадителями для белков являются также вольфрамовая, фос-

фовольфрамовая и метафосфорная кислоты. Хорошо осаждают белки и двухва-

лентные катионы Zn, Pb.

2.3.3 Растворимость белков и факторы ее определяющие

Существенное влияние на растворимость белков оказывает ряд факторов,

основными из которых являются:

¾ рН раствора;

¾ ионная сила среды;

¾ диэлектрические свойства растворителя;

¾ температура.

2.3.3.1 Зависимость растворимости белков от рН среды.

Рассмотрим конкретные экспериментальные данные по растворимости натив-

ного β-лактоглобулина от рН при различных концентрациях NaCl (см.рис.2.7)