Шендрик А.Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования

Подождите немного. Документ загружается.

142

4,6 4,8 5 5,2 5,4 5,6 5,8

рН

Растворимость (L), мг/мл

1 мМ

5 мМ

10 мМ

мМ

Рис.2.7

Зависимость растворимости β-лактоглобулина от рН при различных концен-

трациях NaCl, T = 25

C. Концентрации NaCl обозначены на кривых

Как видно из рисунка, независимо от содержания соли в растворе, мини-

мум растворимости белка находится в области рН около 5.2 - 5.3. По обе сторо-

ны от этой точки растворимость быстро возрастает. Величина рН, при которой

растворимость β-лактоглобулина минимальна, совпадает с его изоэлектриче-

ской точкой. Эта особенность является практически правилом для глобулярных

белков. В изоэлектрической точке молекулы белка не имеют заряда и могут

свободно агрегироваться в твердую фазу. При рН отличных от рI на молекулах

появляются заряды, которые препятствуют их «слипанию».

В отсутствии солей некоторые белки при рН = рI практически не раство-

ряются. Это свойство используют нередко для разделения смесей белков с раз-

ными величинами рI. Метод такого разделения получил название - метод изо-

электрического осаждения. Варьируя величину рН можно поочередно осаж-

дать отдельные белки из смеси в точках рН = рI.

143

2.3.3.2 Зависимость растворимости белков от ионной силы раствора.

Уже из рис.2.7 видно, что нейтральные соли оказывают заметное влияние

на растворимость белка. В малых концентрациях они, как правило, повышают

растворимость. В разбавленных растворах электролитов этот эффект не зависит

от природы соли. Существенным являются только величины зарядов, образую-

щихся из соли ионов, и их концентрации (активности). Соли двухвалентных

ионов эффективнее повышают растворимость чем соли одновалентных ионов,

таких например как NaCl, NH

Cl, KCl.

Причина повышения растворимости белков в присутствии солей - изме-

нение степени диссоциации ионизируемых R-групп. При увеличении концен-

трации солей растворимость белка проходит через максимум. Явление пониже-

ния растворимости белка с увеличением концентрации нейтральных солей на-

зывается высаливанием. Физико-химические основы высаливания до конца не

выяснены.

Оба эффекта: повышение растворимости и высаливания широко приме-

няются при разделении смесей белков. Разделение удается осуществить на той

основе, что зависимость растворимости различных белков от ионной силы рас-

твора различна. Обычно, эта зависимость представляет собой несимметричную

кривую с максимумом. В качестве примера на рис. 2.8 приведена кривая зави-

симости растворимости (L, мг/мл) карбоксигемоглобина от ионной силы рас-

твора в присутствии соли K

. Измерения выполнены в изоэлектрической

точке. Ионная сила раствора (χ), по определению, задается выражением:

∑

где с

- концентрация каждого из ионов смеси и его заряд соответствен-

но.

144

0 0,5 1 1,5 2

Ионная сила (

)

-0,2

0,2

0,4

0,6

lgL

Рис. 2.8

Зависимость логарифма растворимости карбоксигемоглобина в изоэлектриче-

ской точке от ионной силы раствора в присутствии K

2.3.3.3 Зависимость растворимости белков от полярности растворителя.

Смешивающиеся с водой растворители, такие например как этанол или

ацетон, уменьшают растворимость большинства белков в воде. Увеличение со-

держания в растворе органического растворителя приводит к осаждению белка.

При количественных исследованиях установлено, что растворимость белков

при фиксированных значениях рН и ионной силы зависит от диэлектрической

постоянной среды и от способности неводного растворителя уменьшать сте-

пень гидратации ионных групп. Поскольку диэлектрические постоянные (ε) ор-

ганических растворителей существенно меньше, чем у воды (см.табл.2.2), они

значительно уменьшают ионизирующую способность среды.

Причина уменьшения ионизирующей способности - увеличение силы ку-

лоновского электростатического притяжения между противоинами. Она опре-

деляется выражением:

⋅

−=

145

из которого видно, что с уменьшением ε сила притяжение между противоиона-

ми будет возрастать. Это способствует объединению ионов в молекулы. По

этой собственно причине вода является одним из уникальных ионизирующих

растворителей.

Таблица 2.2

Диэлектрические постоянные некоторых растворителей при Т = 20

Растворитель

Вода 80

Метиловый спирт 33

Этиловый спирт 24

Ацетон 21.4

Бензол 2.3

Гексан 1.9

2.3.3.4 Зависимость растворимости белков от температуры.

Температура является мощным фактором влияния на белки. Они сохра-

няют свою нативную форму, как известно, в сравнительно узком температур-

ном интервале. Относительно растворимости установлено, что в диапазоне 0-

С она для большинства белков увеличивается. Имеются, однако, и исключе-

ния. Дальнейшее повышение температуры ведет, как правило, к денатурации.

Есть, правда, исключения и здесь. Денатурация белка сопровождается обычно

резким падением его растворимости в области нейтральных значений рН.

2.4 Осмос и мембранное равновесие

Многие биологически важные свойства белков в растворах связывают с

большими размерами их молекул. Они не диффундируют через некоторые

мембраны, пропускающие воду и низкомолекулярные соединения. Это позво-

ляет используя, например, целлофановые мембраны, отделять белки от низко

146

молекулярных примесей. Процесс такого разделения называется диализом.

Большинство биологических мембран также непроницаемы для белков.

Если раствор белка отделить от дистиллированной воды полупроницае-

мой (проницаемой для воды и др. небольших молекул и непроницаемой для

белка) перегородкой (мембранной) то молекулы воды начнут диффундировать

через мембрану в раствор белка. Низкомолекулярные соединения наоборот,

устремятся через мембрану в резервуар с водой. Это явление назавается осмо-

сом. В его основе лежит стремление любой термодинамической системы к вы-

равниванию химических потенциалов во всех своих частях.

Рассмотрим этот вопрос более подробно. По определению, химический

потенциал (µ

) отдельного вещества или компонента смеси (термодинамиче-

ской системы) в любом агрегатном состоянии - есть частная производная от

свободной энергии Гиббса (G) по количеству (концентрации) этого компонента

при постоянстве всех естественных параметров для G:

...n,

P,T













∂

Иными словами химический потенциал - это парциальная мольная функция со-

стояния. Очень важно уяснить, что химический потенциал по сути своей есть

обобщенная сила. Он позволяет предсказать в каком направлении будет проис-

ходить обмен энергией или веществом между двумя термодинамическими сис-

темами или частями одной и той же термодинамической системы. Это направ-

ление всегда одно и то же: от системы с большой величиной µ

к системе с

меньшим µ

Точно так же как в механическом случае: в направлении от боль-

шей к меньшей механической силе.

С позиций химического потенциала легко понять и явление осмоса. Об-

ратимся для этого к рис. 2.9.

147

(ж,р)

+ П

Полупроницаемая перегордка

Рис. 2.9

Состояние осмотического равновесия в разделенной полупроницаемой перего-

родкой системе растворитель:раствор. р - атмосферное и П - осмотическое

давление

Пусть в левом колене, разделенного полупроницаемой перегородкой со-

суда (рис. 2.9) находится чистый растворитель. В правом - разбавленный рас-

твор вещества, молекулы которого не могут проникать через мембрану. Они

изображены темными шариками. Рис. 2.9 иллюстрирует состояние равновесия,

когда уровни жидкости в левом (А) с чистым растворителем и правом (В) с рас-

твором коленах различны из-за появившегося осмотического давления - Π.

Чуть позже мы скажем о нем. В исходном же состоянии, когда осмотическое

давление П отсутствует величина химического потенциала растворителя в ле-

вой части сосуда определяется только свойствами самого растворителя его ко-

личеством и внешним (атмосферным) давлением - р. В правой части сосуда хи-

мический потенциал растворителя будет несколько меньше по той причине, что

парциальное содержание его в растворе меньше, чем в чистом веществе. Стре-

мясь выровнять величины химических потенциалов по обе стороны полупро-

ницаемой перегородки молекулы растворителя начнут диффундировать через

мембрану из левой части сосуда в правую. В результате, уровень жидкости в

колене (В) начнет подниматься, создавая дополнительное давление - P . Это и

есть осмотическое давление, за счет которого повышается величина

химического потенциала растворителя в правой части сосуда. Осмотическое

давление будет увеличиваться до тех пор, пока величины химических

потенциалов растворителя не станут равными по обе стороны мембраны. Это

состояние и изображено на рис. 2.9. С этого момента скорости диффузии

молекул растворителя через полупроницаемую перегородку слева направо и

наоборот станут равными. Осмотическое перекачивание растворителя

прекратится. Не вдаваясь в детали явления осмоса отметим, что величина

осмотического давления со стороны разбавленного раствора на

полупроницаемую перегородку не зависит от природы растворенного

вещества, а определяется только его концентрацией. Этот закон описывается

уравнением Вант-Гоффа, которое по форме и сути совпадает с уравнением

состояния идеального газа:

где n

, R, T, V - число молей растворенного вещества, универсальная газовая

постоянная, температура и объем раствора соответственно

Это уравнение выражает очень простое и практически важное

свойство осмотического давления, суть которого в следующем. Растворенное

и непроникаемое через полупроницаемую мембрану вещество создает в

разбавленных растворах такое же по величине осмотическое давление, как

если бы оно находилось в газовой фазе и занимало объем равный объему

раствора. Иными словами, растворитель в явлениях осмоса – это вакуум в

идеальных газофазных системах.

Явление осмоса используется практически всеми клетками и

клеточными органеллами. Кроме того, оно лежит в основе ряда методов

экспериментального исследования белков, в частности определения их

молекулярной массы.

148

ГЛАВА 3

БЕЛКИ КРОВЕНОСНОЙ И МЫШЕЧНОЙ ТКАНЕЙ

3.1 Кровеносная система

Кровь - жидкая ткань организма. Она транспортирует различные химиче-

ские веществ, поддерживая постоянно протекающие в клетках биохимические

реакции. Удельная плотность крови 1.055 - 1.065 г/мл., вязкость в 5-6 раз боль-

ше вязкости воды.

Кровь состоит из плазмы и взвешенных в ней форменных элементов

(эритроциты, лейкоциты и тромбоциты). Плазму отделяют центрифугировани-

ем. Она составляет около 55% от общего объема крови. Из форменных элемен-

тов на долю эритроцитов приходится 44%. Все остальные компоненты крови

составляют около 1%.

Важный физико-химический показатель крови - осмотическое давление

плазмы. Оно определяется суммой всех создающих осмотическое давление час-

тиц в единице объема.

3.1.1 Химический состав крови

Химический состав крови в норме варьирует мало. Большую часть сухого

остатка крови составляют белки. Все случайные колебания в составе крови в

норме организмом быстро гасятся. Перечень основных компонентов крови

приведен в таблице 3.1.

Белки плазмы крови. Из 9-10% сухого остатка плазмы крови - 6.5-8.5%

приходится на белки. Высаливанием их можно разделить на три группы: аль-

бумины, глобулины, фибриноген. Содержание их в плазме приведено в табл.

3.1. Сыворотку крови получают из плазмы удалением из нее фибриногена. Бел-

ки плазмы крови достаточно легко разделяются на несколько фракций методом

простейшего электрофореза на бумаге. В их составе содержатся следующие

149

белки: альбумины - 54-58%, α

-глобулины - 6-7%, α

-глобулины - 8-9%, β-

глобулины - 13-14%, γ-глобулины - 11-12%.

Таблица 3.1

Основные компоненты крови и плазмы человека

Составные части Цельная

кровь

Плазма

Вода, % 75-85 90-91

Сухой остаток, % 15-25 9-10

Гемоглобин, г/л 130-160 -

Общий белок, г/л - 65-85

Фибриноген, г/л - 2-4

Глобулины, г/л - 20-30

Альбумины, г/л - 40-50

Азот небелковый, ммоль/л 15-25 14-21

Мочевина, ммоль/л 3.3-6.6 3.3-6.6

Мочевая кислота, ммоль/л 0.18-0.24 0.24-0.29

Креатинин, ммоль/л 0.06-0.16 0.06-0.16

Креатин, ммоль/л 0.23-0.28 0.08-0.11

Азот аминокислот, ммоль/л 4.3-5.7 2.9-4.3

Глюкоза, ммоль/л 3.3-5.0 3.6-5.5

Глюкозамин, ммоль/л - 3.9-5.0

пентозы, ммоль/л - 0.13-0.26

Общие липиды, г/л 1.0-7.2 3.8-6.7

Триацилглицериды, ммоль/л 1.0-2.6 1.2-2.8

Холестерин, ммоль/л 3.9-5.2 3.9-6.5

Фосфолипиды, г/л - 2.2-4.0

Фосфатидилхолин, ммоль/л 3.0 1.5-3.0

Кетоновые тела (в пересчете на ацетон), ммоль/л - 0.2-0.6

Ацетоуксусная кислота, ммоль/л - 0.05-0.19

Молочная кислота, ммоль/л - 1.1-1.2

Пировиноградная кислота, ммоль/л - 0.07-0.14

Лимонная кислота, ммоль/л - 0.10-0.15

α-Кетоглутаровая кислота, ммоль/л

- 0.02-0.07

Янтарная кислота, ммоль/л - 0.01-0.04

Билирубин общий, мкмоль/л - 4-26

150

Электрофорезом в крахмальном геле или методом иммуноэлектрофореза

в плазме обнаруживается значительно большее количество белков. Они приве-

дены в таблице

3.2

Таблица 3.2

Основные белки плазмы крови

Фракция Белки фракции Количество белка в

мг/100 мл

Альбумины Преальбумин

альбумин

10-40

3500-4500

-Глобулины

Гликопротеид

Ретинолсвязывающий белок

антитрипсин

Фетоглобулин

Тироксинсвязывающий бе-

лок

Транскортин

55-140

3-6

200-400

≅ 0.001

1-2

3-3.5

-Глобулины

Церуплазмин

Гаптоглобины

Макроглобулин

Интер-α

-трипсиновый

ингибитор

15-60

380-780

150-420

20-70

β-Глобулины

Трансферрин

Гемопексин

Микроглобулин

200-320

50-100

0.2

γ-Глобулин

700-1500

Большинство белков плазмы крови имеют рI ≅ 5-6, т.е. в их составе пре-

обладают кислые аминокислоты. Синтез белков плазмы крови идет в основном

в клетках печени и ретикулоэндотелиальной системе.

Физическая роль белков плазмы крови состоит в следующем.

¾ Поддержание коллоидно-осмотического (онкотического) давления. Дос-

тигается это тем, что содержание белков в плазме существенно больше, чем в

тканевой жидкости. Белки, находясь в коллоидном состоянии, связывают воду

и удерживают ее в кровяном русле.