Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

И ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ 331

1. Механизм Михаэлиса — Ментен

В гл. 3, разд. Ж.2 было показано, что специфичность в случае

конкурирующих субстратов определяется величиной fecat/Дм.

Если

скорость реакции с участием специфического субстрата

А обозначить через v

, а соответствующую скорость для конку-

рирующего субстрата В — через v

, то можно записать

(ИЛ)

Воспользовавшись уравнениями (10.3), (10.4) и (10.10), это со-

отношение

можно представить в виде

(W*M)

W/h) -

(

°о*

b)>

(11.2)

где AG* — энергия активации для стадии химического пре-

вращения

субстрата, a AGb— энергия связывания переходного

состояния

субстрата ферментом.

Если

дополнительная группа R субстрата А не претерпевает

химического превращения в

ходе

данной реакции, то AG* для А

будет

одинакова, если не принимать во внимание индукци-

онные

эффекты. В таком случае, положив разность энергий свя-

зывания

равной AAGb, из уравнения

(11.2)

получаем

где

AAGb

— отрицательная величина.

Уравнение

(11.3)

дает

максимальный

эффект, к которому

может привести связывание дополнительной группы. Если при

переходе от А к В лимитирующей становится другая стадия, то

энергия

активации уменьшается на величину, меньшую AAGb.

Кроме

того, если в случае субстрата В наряду с тем способом

связывания

и химического превращения, которые реализуются в

случае субстрата А, существуют иные, это

будет

приводить к

увеличению суммарной скорости реакции.

Как

мы увидим, высказанное ранее предположение о том,

что специфичность обусловливают перечисленные ниже меха-

низмы,

не подтверждается.

а. Деформация

Как

было показано в гл. 10, деформация не влияет на вели-

чину ucat/Лм, так как вызывает одинаковые изменения k

t и Км-

б. Индуцированное соответствие

В той же гл. 10 указывалось, что в случае индуцированного

соответствия отношение k

t/K,M равно просто отношению

kcatlKu

для активной конформации, деленному на постоянный

для всех субстратов коэффициент [уравнения

(10.14)

и (10.17)].

Индуцированное

соответствие не изменяет значения

kcnlKn

по

332

ГЛАВА

сравнению с соответствующей величиной для случая, когда весь

фермент находится в активной конформации, и, следовательно,

не влияет на специфичность.

в. Непродуктивное связывание

Согласно данным гл. 3, разд. Д, при непродуктивном связы-

вании

отношение

tlKtA

не изменяется, a

и /См уменьша-

ются в одинаковой степени. Специфичность, таким образом,

остается прежней.

г. Последовательность реакций

Специфичность фермента не повышается, если ферментатив-

ная

реакция проходит через ряд последовательных стадий,

каждая из которых характеризуется энергией

AAG

Проще

всего понять этот факт, обратившись к гл. 3, разд. Е, откуда

станет

ясно,

что для реакции

(11.4)

отношение k

cai

/KK всегда

равно

fo/Ks

независимо от числа промежуточных стадий.

E+S

=<=*

ES >• ES' *• ES" *• ES'" и т. д.

(11.4)

2. Общий

случай

Для анализа вклада энергии связывания в свободную

энер-

гию активации для каталитической стадии в общем

случае

можно использовать следующий формальный термодинамиче-

ский

подход.

Рассмотрим последовательность реакций

Лимитирующая

, , стадия

Е+

S ^=4: ES 3=* E'S' ч=^ E"S" E*S

(11.5)

где Е, Е', Е" и т. д. различные состояния фермента, a S, S',

S" — различные состояния субстрата. Скорость реакции можно

рассчитать из теории переходного состояния, пренебрегая все-

ми промежуточными стадиями, а просто рассматривая

энер-

гетику процесса Е + S->-E^S*. Свободная энергия активации

Гиббса представляет собой

сумму

трех

составляющих: измене-

ния

свободной энергии AGf, представляющего собой разность

энергий состояний Е* и Е, AGs — разности энергий состоя-

ний

S* и S и АСь — энергии связывания Е* и S+.

AG*

Схема

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ

333

Из

термодинамического цикла, представленного

на

схеме

видно,

что

энергия активации

^G^

равна

ДО*

= AG* + ДО* + Д0

. (11.6)

Согласно теории переходного состояния, скорость реакции опре-

деляется выражением

(kT/h)

[E] [S] ехр

(ДО*

ДО*

ДО^/ЯГ].

(11.7)

Относительные скорости реакций

участием субстратов

А и

В можно получить, подставив значения энергии Гиббса

для А и

уравнение

(11.7)

взяв отношение скоростей:

*А/Ч

(IА]/[В]) ехр

(ДДО

ДО*

t±G*)/RT].

(11.8)

Разность

энергиях связывания субстратов

А и В,

AAGb,

входит

уравнение только один

раз.

AAGb

нельзя увеличить,

суммируя соответствующие величины

для

каждой

из

стадий.

Специфичность,

обусловленная

AAGb,

просто «распределяется»

по

этим стадиям.

Для подобных субстратов AG*

будет

близка

AGB,

так что

»А/

= ([А]/[В]) ехр (- ДДО

//?Г) (11.9)

Этот

подход

можно использовать

и для

анализа связывания

обычных косубстратов, например NAD+илиАТР. Происходящие

при

этом изменения энергии Гиббса сокращаются,

как и в слу-

чае

AGE

при

определении отношения скоростей

из

уравнения

(11.7)

или

аналогичного

ему

уравнения.

3. Взаимодействующие активные центры

Может

ли

увеличиться специфичность

при

связывании

ферментом,

имеющим несколько центров связывания, более

чем

одной

молекулы

субстрата?

Такая возможность

не

исключается

для систем

vitro, когда присутствует только один

субстрат

анализируется абсолютная скорость,

а не

различие

между

суб-

стратами. Однако

реальных биологических системах,

где

име-

ются специфические

конкурирующие субстраты, специфич-

ность увеличиваться

не

может, поскольку

реакции

участвуют

смешанные комплексы, содержащие фермент

и оба

субстрата.

Это можно показать

помощью формальных термодинамиче-

ских выкладок. Рассмотрим случай, когда реакционной способ-

ностью обладает половина активных центров,

одна молекула

субстрата,

S*,

связывается

ферментом,

но не

претерпевает

химических превращений

образованием продукта

отличие

от

334

ГЛАВА

второй молекулы, S. Сравнение скоростей реакций с участием

пары комплексов, например

Е.А.А*

Е.В.А*,

показывает, что

дополнительная энергия при связывании большего по размеру

субстрата, ДДбь используется только «один раз».

Е* + S* + S**

Е + S + S* — * E+S

S**

Схема II

Согласно теории переходного состояния, выражение для скоро-

сти имеет вид

о=

(АГ/А)

[Е] IS] [S*] ехр [- (до| + AGf + AGj. + (ДО

)

+ (ДО„)

,)/ЯГ]

(11.10)

Если

субстрат

А связывается прочнее, чем

субстрат

В из-за

различия в структуре, обусловливающего разный вклад в

энер-

гию связывания ДДбь, и если У

АВ

, — скорость реакции для слу-

чая,

когда

субстрат

А связывается с центром, осуществляющим

химические превращения, а В — с другим центром, то, подстав-

ляя

выражение для энергии Гиббса в уравнение

(11.7)

и по-

лагая AGA=AGB, получаем

АА'/

ВА» = ([А]/[В]) ехр (-

ДДО

/£Г)

(П.П)

"АВ'А-вв*

= ([А]/[В]) ехр (-

ДДО

//?Г),

(11.12)

так что

САА*

АВ*)/(*вА«

+ "вв«) =

[А1/[В]

ехр (-

ДДО

//?Г).

(11.13)

При

образовании смешанных комплексов А и В с ферментом

специфичность не может увеличиться в

результате

одновремен-

ного связывания

двух

молекул субстрата. Связывание А

дает

больший вклад в скорость каталитической стадии, чем присое-

динение В к некаталитическому центру, однако в смешанном

комплексе ЕАВ связывание А повышает активность в такой же

степени, как и в двойном комплексе ЕА.

4. Стереохимическая природа специфичности

Специфичность в отношении конкурирующих субстратов за-

висит от относительной прочности связывания ферментом их

переходных состояний. Комплементарность фермента переход-

ному состоянию субстрата позволяет достичь максимально вы-

сокой

специфичности, поскольку этим обеспечивается оптималь-

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

И ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ 335

ное связывание переходного состояния. Кроме того, комплемен-

тарность является признаком оптимальности значения fe

at//CM,

что вполне естественно, поскольку специфичность фермента

определяется этим параметром. Максимизация скорости сопро-

вождается максимизацией специфичности.

Причина,

по которой гексокиназа предпочитает фосфорили-

ровать глюкозу, а не

воду,

заключается в том, что глюкоза в

отличие от воды хорошо связывается в переходном состоянии.

Каким

бы ни был механизм этой реакции (деформация или

индуцированное соответствие), исход конкуренции

между

глю-

козой

и водой

будет

одинаковым. Если допустить, что

Vmax

для

фосфорилирования глюкозы и воды одинакова, а энергия свя-

зывания

глюкозы используется на уменьшение Км., то глюкоза

будет

фосфорилироваться эффективнее благодаря

тому,

что ак-

тивный центр предпочтительнее связывает именно глюкозу. Если

бы вся энергия связывания глюкозы использовалась для пони-

жения энергии активации стадии, определяющей

Vmax,

это так-

же привело бы к более эффективному ее фосфорилированию

вследствие повышения реакционной способности этого соедине-

ния

при связывании.

Существуют, однако, случаи, когда механизмы деформации

или индуцированного соответствия оказывают ощутимое влия-

ние

на специфичность. Эти механизмы не имеют значения, когда

между

субстратами

существует

конкуренция. Если же никаких

специфических субстратов нет, указанные механизмы

могут

уменьшить абсолютную активность фермента в отношении, ска-

жем, воды. Так, например, механизм индуцированного соответ-

ствия способен предотвратить превращение гексокиназы в «аг-

рессивную» АТРазу в

отсутствие

глюкозы (хотя такое

отсут-

ствие крайне маловероятно).

Б.

Сверхспецифичность и механизмы корректирования

1. Синтез белков

Ограничения, налагаемые на специфичность различиями в

энергии связывания, не обеспечивают должной точности работы

некоторых биологических систем.

Например,

клетка не смогла бы существовать, если бы точ-

ность процессов репликации и синтеза белка определялась

только описанными выше факторами. Наличие добавочной ме-

тиленовой группы у изолейцина может привести к превышению

скорости реакции этого соединения с изолейцил-тРНК—синтета-

зой над скоростью соответствующей реакции с участием валина

100—200

раз. С

учетом

того, что концентрация валина in

vivo

336

ГЛАВА

в пять раз выше, чем концентрация изолеицина, это могло бы

дать

ошибку в скорости, равную

1/20—1/40.

Однако установлено, что

суммарная ошибка в скорости для валина, ошибочно занявшего

АЦИЛНРОВЛНИЕ

Гидрофобная

полость

ГИДРОЛИЗ

Гидрофобная

полость

Местоположение

гриппы,

образующей

водородную

связь

АЦИЛИРОВАНИЕ

Гидрофобная

полость

ГИДРОЛИЗ

Гидрофобная

полость

Местоположение

группы,

образующей

водородную

связь

тРНК

Рис.

11.2. Возможный механизм специфичности, направленный на предотвра-

щение неправильного ацилирования

тРНК

Уа1

треонином. А, Гидрофобный

центр ацилирования, избирательно связывающий треонин. Б. Гидролитический

центр использует энергию связывания гидроксильной группы треонина для

связывания или катализа. Как показано на рисунке, ацильная группировка

перемещается из положения 2' в положение 3' [3].

в белке место изолеицина, составляет только

1/3000

[1]. Эта

сверхспецифичность обусловлена наличием

корректирующего

механизма

(editing mechanism). Изолейцил-тРНК—синтетаза

не только выполняет свои обычные биосинтетические функции,

но

обладает

гидролитической способностью. Параметр

kcai/Км

для образования связанного с этим ферментом валил-

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ

337

аденилата

будет

примерно

в 150 раз

меньше,

чем при

образова-

нии

изолейциладенилата. Однако

в то

время

как

присоединение

тРНК

Пе

правильному комплексу

ведет

образованию

Пе-тРНК

Пе

при

присоединении неправильного комплекса

ва-

лиладенилата образуются валин

и AMP, а не

Уа1-тРНК"

[2].

В присутствии валина,

АТР и

тРНК

Пе

изолейцил-тРНК—синте-

таза функционирует

как

АТР-пирофосфатаза

—

непроизводи-

тельно,

но по

необходимости гидролизуя

АТР до

AMP.

Не,

АТР

тРНК

Пе

.. ., , , ..

»-

Е.Пе~АМР

»•

Ие-тРНК

Пе

+ AMP + Е, (11.14)

Val,

АТР

тРНК

11е

гт

., , ,_.

•> E.Val~AMP > Val +

тРНК

Пе

+ AMP + Е. (11.15)

Для реакции отщепления треонина валил-тРНК—синтета-

зой

удалось установить механизм специфичности (гл.

разд.

Г)

[3].

Этот фермент имеет отдельный гидролитический центр

для

Быстро

Медленно

Е.АА.АТР.гРНК

J-*-

Е.АА-АМР.тРНК

ЕАА-ТРНК+АМР

Главная

стадия

корректи

роеания

Е+АА+АМР+ТРЖ

^Окончательная

ликвидация"

Рис.

11.3.

Один

из

вариантов механизма «двойного сита»,

котором стадия

корректирования

предшествует стадии переноса аминокислоты

на

тРНК.

гидролиза Thr-TPHK

Val

образует треониладенилатный комп-

лекс

t/K.M

примерно

в 600 раз

меньшей,

чем при

образова-

нии

валиладенилата. Thr-TPHK

Val

очень быстро гидролизуется

с числом оборотов

40 c

-1

Val-TPHK

Val

гидролизуется медленно,

число оборотов составляет лишь

0,015 с-

Ясно,

что

гидроли-

тический

центр фермента

для

обеспечения специфического

свя-

зывания

треонина должен быть способен образовать водород-

ную связь

гидроксильной группой последнего. Гидрофобный

валин

связывается

гидролитическим центром значительно

сла-

бее, гидролизуясь приблизительно

3000

раз

медленнее.

В про-

цессе эволюции природа создала специфический механизм

ис-

пользования

структурного различия, реализующийся

двух

случаях:

один

раз — для

узнавания нужного субстрата

на ста-

дии биосинтеза,

другой—для узнавания неправильного

суб-

страта

на

стадии расщепления

(рис.

11.2).

Наиболее сложен процесс распознавания изолейцила

и ва-

лина

таким ферментом,

как

изолейцил-тРНК—синтетаза. Дело

том, что в Е.соп

содержание валина

пять

раз

превышает

338

ГЛАВА

содержание изолейцина [4]. В этом

случае

может иметь место

механизм двойного контроля, при котором большая часть ва-

лиладенилата

деградирует

еще до переноса к

тРНК

Пе

изолейцил-тРНК—синтетаза

использует свою гидролитическую

БОЛЬШИЕ ПО

РАЗМЕРУ

МЕНЬШИЕ ПО

РАЗМЕРУ

АМИНОКИСЛОТЫ АМИНОКИСЛОТЫ

НЕ

ПРОХОДЯТ

СКВОЗЬ

,СИТО"

ПРОХОДЯТ

СКВОЗЬ„СИТО

ЦЕНТР

АКТИВАЦИИ

&Ь

ГИДРОЛИТИЧЕСКИЙ

ЦЕНТР

Val-

Пв •

Ш-тРНК

Рис.

11.4. Механизм «двойного сита», моделирующий процесс корректирова-

ния

работы изолейцил-тРНК—синтетазы. Активный центр, где происходит об-

разование аминоациладенилата,

«отторгает»

аминокислоты, большие, чем изо-

лейцин,

и связывает меньшие по размеру аминокислоты. Аналогичным обра-

зом гидролитический центр, размеры которого достаточны для связывания

валина, отторгает изолейцин и присоединяет валин и все меньшие по размеру

аминокислоты.

активность, ликвидируя все молекулы Уа!-тРНК

Пе

, которым

удалось пройти через первый «пропускной пункт» [5]. Этот ме-

ханизм аналогичен «двойному

ситу»

(рис. 11.4).

2. Механизм корректирования

при

репликации ДНК [6]

Процесс

репликации ДНК характеризуется чрезвычайно вы-

сокой

точностью. Частота мутации для Е.

coli

составляет 10~

—

10~

, и, следовательно, точность репликации ДНК либо равна

указанным величинам, либо еще больше [7]. Это подтвержда-

ется результатами исследования in

vitro

ДНК-полимеразы из

Е.

coli

и фага Т4, согласно которым вероятность ошибки состав-

ляет менее 10~

[7, 8]. Такая точность обеспечивается сложной

системой корректирующих механизмов.

Основное различие

между

процессами синтеза белка и ДНК

состоит в том, что в последнем

случае

исправить ошибку отно-

сительно легко. При синтезе белка растущий конец полипептид-

ной

цепи активируется и переносится к следующей в цепи ами-

нокислоте.

В этом

случае

удалить неправильный аминокислот-

ный

остаток и «реактивировать» полипептид невозможно.

Ошибку необходимо исправить до полимеризации. При синтезе

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ

339

же ДНК активируется мономерный нуклеотид, присоединяю-

щийся

к неактивированной растущей цепи. Это позволяет ис-

править ошибку уже после завершения полимеризации.

Молекула ДНК синтезируется в направлении 5' — 3' (нукле-

отиды присоединяются к З'-гидроксильной группе полинуклео-

тида), а все ДНК-полимеразы прокариот расщепляют цепь в

направлении 3'—5' (рис.

11.6).

Имеются веские данные в поль-

зу наличия механизма

вырезания

ошибочно присоединенных

з'-

5'-

I I N

Синтез

-ОН

dAMP-PP

ТРНК

Рис.

11.5. В процессе синтеза

молекулы белка происходит пе-

ремещение активированной по-

липептидной цепи к следующе-

му аминокислотному остатку.

3'-

-он

Корректирование

участием

экяонуклеазы

Рис.

11.6. В

ходе

синтеза молекулы

ДНК

происходит присоединение ак-

тивированного дезоксинуклеотидмо-

нофосфата

к З'-гидроксильной группе

растущей цепи. Корректирование про-

исходит в обратном направлении.

оснований

участием

этого фермента. Во-первых, показано, что

экзонуклеаза наиболее эффективно

гидролизует

участки, содер-

жащие ошибочные основания, а также одноцепочечную ДНК [9,

10].

Во-вторых,

частота мутаций у фага Т4 коррелирует с

экзо-

нуклеазной активностью, проявляемой ДНК-полимеразой.

Штаммы, обладающие очень высокой скоростью мутации, син-

тезируют

ДНК-полимеразу с низкой экзонуклеазной активно-

стью

(табл. 11.1) [7]. Штаммы, устойчивые к мутациям,

обладают

высокой экзонуклеазной активностью. Из

табл. 11.1 видно, что эти штаммы

гидролизуют

расточительно

большие количества дезоксинуклеозидтрифосфатов, чтобы

включить единственное основание [11].

В-третьих,

обратная

транскриптаза из РНК-содержащего вируса миелобластомы

птиц,

которая синтезирует ДНК с использованием РНК в каче-

стве

матрицы, не

обладает

3'—5'-экзонуклеазной активностью

частота неправильного включения цитидина составляет 1/600

340

ГЛАВА

[8].

Следует

отметить, что корректирование должно осуществ-

ляться полимеразой, а не репарирующим ферментом, включаю-

щимся

на следующей стадии, поскольку при синтезе двухцепо-

чечной ДНК нельзя было бы выяснить, какое именно из

двух

спаренных оснований было включено по ошибке.

Механизм корректирования при репликации ДНК должен

несколько отличаться от механизма, используемого в

случае

аминоацил-тРНК—синтетаз: для выполнения своей функции в

процессе биосинтеза ДНК-полимераза должна обладать спо-

собностью связывать все четыре дезоксинуклеотида, следова-

тельно, она не может иметь специальный центр связывания для

ошибочного основания (как, например, валил-тРНК—синтета-

за, имеющая центр связывания для треонина).

Нарушения первичной структуры ДНК

могут

быть обуслов-

лены не только ошибками в работе синтезирующего аппарата;

они

возникают под действием рентгеновского излучения и

ульт-

рафиолетового света, в

результате

химической модификации ос-

нований.

В этих случаях ошибка исправляется с помощью

механизма вырезания дефектного участка, замещения его при

участии полимеразы и сшивания концов цепи ДНК-лигазой [6].

Ошибочно включенное основание распознается благодаря

тому,

что оно химически отличается от четырех обычно присутствую-

щих в ДНК оснований. Имеется система, способная выщеплять

остатки дезоксиуридина, ошибочно включенные вместо тимиди-

на

[12]. Здесь можно провести аналогию с распознаванием

изолейцина и валина при синтезе белка, поскольку урацил от-

личается от тимина тем, что последний содержит метильную

группу.

О О

Урацил Тимин

Урацил удаляется из молекулы ДНК с помощью урацилглико-

зидазы, которая отщепляет это основание от сахарного кольца.

Механизм действия данного фермента аналогичен механизму

действия изолейцил-тРНК—синтетазы, гидролизующей

Val-тРНК"

. В обоих случаях гидролитический центр слишком

мал, чтобы вместить

субстрат,

содержащий дополнительную

метильную

группу,

благодаря чему этот

субстрат

остается

неповрежденным. Коррекция при синтезе ДНК осуществляется