Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 361

Аналогичная ситуация имеет место и в

случае

алкогольдегидро-

геназы печени, где роль ВН+ в стабилизации переходного состо-

яния

и ориентации субстрата играет либо присоединенная к

цинку

молекула воды, либо сам ион

Следствием направленности образующейся водородной свя-

зи

является то, что спирт присоединяется предпочтительно к

основной

форме катализатора (В),

тогда

как альдегид к кислой

(ВН+).

Значение рКа основания В в составе тройного комплекса

E.NAD+.RCH

уменьшается, а в составе комплекса

E.NADH.RCHO

— увеличивается. Это означает, что высвобож-

дающийся при окислении протон не покидает тройного комплек-

са, а захватывается каталитической группой, и наоборот. Вы-

свобождение протона в раствор происходит только при замене

одних молекул субстрата другими [18, 41, 63, 71].

Столь же четкое объяснение получила и природа специфич-

ности

дегидрогеназ. Энантиомеры субстратов L-лактат- и

D-глицеральдегид-З-фосфат—дегидрогеназ не

могут

связываться

продуктивно, гидрофобный карман алкогольдегидрогеназы не

связывает заряженную боковую цепь лактата и т. д. Происходят

ли

в процессе катализа конформационные изменения или имеет

место деформация — неизвестно.

Основная

кинетическая особенность ЫАО+-зависимых дегид-

рогеназ состоит в том, что NADH обычно связывается более

прочно,

чем

NAD+.

Каковы структурные предпосылки такого

различия

— неясно; отметим только, что заряженное никотина-

мидное кольцо более гидрофильно, чем его восстановленная

форма

в NADH. Прочное связывание NADH приводит к

тому,

что диссоциация комплексов E.NADH является в значительной

мере лимитирующей стадией при насыщающих концентрациях

реагентов и физиологическом рН. Более того, хотя константа

равновесия для реакции окисления в растворе такова, что рав-

новесие сдвинуто в сторону образования NAD+ и спирта, благо-

даря более прочному связыванию NADH константа равновесия

для связанных с ферментом реагентов оказывается не столь

неблагоприятной для образования NADH и альдегида: констан-

та равновесия

между

двумя тройными комплексами в реакциях

с участием лактатдегидрогеназы близка к единице.

Б.

Протеазы

Протеазы удобно классифицировать в соответствии с харак-

тером их активности и природой функциональных групп. Сери-

новые протеазы являются эндопептидазами, имеющими реакци-

онноспособный

сериновый остаток, и обладают максимальной

активностью при рН, близких к 7,0. Кислые протеазы представ-

362

ГЛАВА

ляют собой эндопептидазы с реакционноспособными карбок-

сильными группами и обладают максимальной активностью при

низких

рН (за исключением химозина, активность которого со-

храняется вплоть до нейтральных рН). Тиоловые протеазы яв-

ляются эндопептидазами, отличающимися от сериновых протеаз

присутствием реакционноспособных цистеиновых остатков. Кар-

боксипептидазы представляют собой цинксодержащие

экзо-

пептидазы, специфичные по отношению к определенным С-кон-

цевым остаткам белков и функционирующие при нейтральном

рН.

За исключением лейцинаминопептидазы, мол. вес которой

равен 250 000, все перечисленные протеазы представляют собой

небольшие мономерные ферменты с мол. весом от 15 000 до

35 000, легко поддающиеся кинетическим и структурным иссле-

дованиям, в связи с чем относятся к наиболее хорошо изученным

ферментам. Несмотря на то что эти ферменты катализируют

одну и ту же реакцию, механизм каталитического действия

протеаз разных классов различается. Некоторые механизмы

изучены достаточно полно, для них построены химические моде-

ли,

другие

исследованы лишь в общих

чертах.

В данном разделе для описания подцентров связывания ши-

роко используются условные обозначения, введенные Бергером

Шехтером [уравнение (1.6)]. (Расщепляемая связь пептидно-

го субстрата занимает участок

между

подцентрами Si и Si,

С-конец субстрата занимает подцентры S{ — S'

, a N-конец —

S, —S

1. Сериновые протеазы

Эти ферменты уже рассматривались нами в разных разде-

лах. Основной материал распределился следующим образом:

классификация

ферментов, их специфичность — гл. 1, разд. В;

структура

активного центра, фермент-субстратный комплекс,

ацилфермент и комплекс

между

ферментом и продуктом — гл. 1,

разд. Г; кинетика-реакций и установление их механизма — гл.7,

разд. Б; рН-зависимость каталитического процесса и состояние

ионизации

активного центра — гл. 5, разд. Е и Ж.2.а; использо-

вание энергии связывания для увеличения k

t — гл. 10,

разд. А.4; стабилизация переходного состояния, специфическая

сольватация переходного состояния — гл. 10, разд.

В.5.в.

В этом

разделе вкратце рассмотрены все перечисленные вопросы.

Катализируемый сериновыми протеазами гидролиз субстра-

тов, эфиров или амидов, сопровождается образованием промежу-

точного ацилфермента в

результате

ацилирования субстратом

гидроксильной группы Ser-195. В

случае

амидов образование

ацилфермента при насыщающих концентрациях субстрата явля-

СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 363

ется медленной стадией, а гидролиз эфиров часто сопровожда-

ется его накоплением.

Атака

Ser-195

карбоксильной группы суб-

страта, по всей вероятности, приводит к образованию высоко-

энергетического тетраэдрического промежуточного соединения:

Е—OH.R—С—X

—>

Е—OH + R—СО

Н.

(12.19)

Механизм катализа и

структура

промежуточных соединений,

образующихся в

ходе

реакций с участием сериновых протеаз,

определены с помощью более прямых экспериментов, чем в

случае

любого

другого

фермента или класса ферментов. Выяс-

нить

структуру

сериновых протеаз удалось главным образом

благодаря установлению кристаллической структуры сокристал-

лизованных комплексов трипсина и некоторых природных поли-

пептидов-ингибиторов, имитирующих субстраты (гл. 1, разд. Г).

Из

этих исследований известно, что активный центр фермента

комплементарен переходному состоянию субстрата, которое

структурно очень близко к тетраэдрическому

аддукту

остатка

Ser-195

и углеродного атома карбонильной группы субстрата.

Более того,

структура

фермента при связывании субстрата не

искажается. Исследование связывания небольших пептидов с

помощью ЯМР-спектроскопии показывает, что при связывании

эти

пептиды также не деформируются. (Определение кристал-

лической структуры комплекса трипсина с панкреатическим ин-

гибитором трипсина при высоком разрешении ясно показывает,

что реакционноспособная пептидная связь деформируется таким

образом, что ее конфигурация приближается к конфигурации

пептидной связи в тетраэдрическом промежуточном соединении.

Однако, поскольку эта связь уже деформирована до присоеди-

нения

к ферменту, «сконструированный» ингибитор связывается

очень прочно, т. е. является аналогом естественного переходного

состояния.)

а.

Система

переносом

заряда

Долгое время полагали, что основный имидазол остатка

His-57 увеличивает нуклеофильность гидроксильной группы

Ser-195, действуя как общий основный катализатор: активность

364

ГЛАВА

понижается при низких рН в соответствии с изменением состоя-

ния

ионизации основания с р/(а£^7, характерным для остатка

гистидина; His-57 модифицируется аффинной меткой — то-

зил-Ь-фенилаланинхлорметилкетоном — с необратимой потерей

ферментативной активности (гл. 7, разд. Ж) [72].

^2^

(12

20)

Для кристаллографов явилось полной неожиданностью выявле-

ние

того факта, что карбоксильная группа

Asp-102

также

входит

состав активного центра с образованием каталитической триа-

ды, названной «системой с переносом заряда» [73].

^ (12.2!)

о ^/

Хотя карбоксильная группа полностью погружена

вглубь

бел-

ковой

глобулы, она окружена полярными остатками и связан-

ными

с белком молекулами воды. Было высказано предположе-

ние,

что погруженная карбоксильная группа ионизирована в

активном

протонированном состоянии фермента; позже это

предположение подтвердилось (гл. 5, разд. Ж.2.е) [74]. Еще

один

сюрприз преподнесли исследователям данные, полученные

с помощью ЯМР [75], а затем и с помощью ИК-спектроскопии

[76],

которые показали, что группа, ионизующаяся с р/С

~ 7,

принадлежит погруженному внутрь белковой глобулы аспарта-

ту, а не His-57 (гл. 5, разд. Ж.2). Если эти данные правильны, то

имидазол His-57 остается непротонированным в химотрипсине

вплоть до рН 2, поскольку на графике зависимости активности

от рН не обнаруживается данной стадии ионизации при низких

рН

[77].

Как

все эти факторы влияют на катализ — неизвестно. Было

высказано

предположение, что

между

Asp-102

и His-57 в

ходе

реакции

(12.22)

происходит перенос протона [75].

(12.22)

Очень интересно было бы заменить каким-нибудь образом

Asp-102

аспарагином и затем определить каталитическую ак-

тивность такого фермента. По мнению автора, при этом значение

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 365

рК

His-57 было бы равно б, а константа

уменьшилась в

10 раз (исходя из данных об уменьшении р/(

каталитического

—еГ '"HN^NH-O

А"

Ш \

ОН

—

HN Is

А"

ОН. |

—

С 'Н

NH--O

\=/ \

О Н

НА

Рис.

12.4. Ионизированные состояния системы с переносом заряда. А~ — ката-

литически

активное состояние. Состояние НгА+ в реакциях с участием химо-

трипсина

не наблюдается даже при рН 2. Если состояние, реализующееся при

низком

рН,

—Н+А~,

то погруженный в белок

Asp-102

является как раз тем

остатком,

который увеличивает основность His-57 и ответствен за напряжение.

Если

состояние, реализующееся при низком рН, — НА, то появляется возмож-

ность

переноса в процессе катализа протона между Ser-195 и His-57, сопрово-

ждаемое

одновременным переносом протона между His-57 и Asp-102.

основания

приблизительно на 2 единицы и имея в

виду,

что

коэффициент

Брёнстеда р в

случае

общего основного катализа

равен ~0,5) [74].

б.

Структура

реакционная

способность

субстрата

Структурные требования, которым должен удовлетворять

субстрат,

чтобы обладать реакционной способностью, определя-

ются из данных по измерению

и /См для широкого круга

эфирных

субстратов и констант ассоциации для обратимых ин-

гибиторов [78J. Эфиры обладают чрезвычайно высокой реакци-

онной

способностью, что налагает ограничение на выбор эфир-

ных субстратов, которые должны гидролизоваться с доступной

для измерения скоростью. Таким образом, эфиры наиболее по-

366

ГЛАВА

лезны

для

определения стерических требований, предъявляемых

ацильному фрагменту субстрата. Амиды

пептиды настолько

нереакционноспособны,

что

использовать можно только произ-

водные специфических субстратов

—

фенилаланина, тирозина

триптофана. Теперь

эти

исследования удается проводить

соче-

тании

рентгеноструктурным анализом.

Таблица

12.2

Структурные требования при деацилировании

ацилхимотрипсинов (RCO

E) (25° С)

а)

R—

СНз—

СбН

СН

СН2—

СН

(ЫНСОСН

)—

L-C

(NHCOCH3)—

cat

для деацили-

рования,

0,01

0,178

0,12

111

*ОН~

для гйдро-

/ лиза

RCO2CH3,

М-'с"

0.19

0,15

2,48

1,94

) Dupaix

A.,

Bechet J.-J., Roucous

С,

Biochem. Biophys.

Res. Commun.,

41, 464

(1970); Березин

И. В.,

Казанская

Н. Ф.,

Клесов

A. A.,

FEBS Letts.,

15, 121

(1971);

см.

табл.

7.3.

/. Стадия

деацилирования.

табл.

12.2

приведены данные

по

деацилированию различных ацилферментов. Соответствую-

щие данные

для

аминокислот приведены

табл.

7.3.

Наиболь-

шей реакционной способностью обладает производное

аце-

тил-Ь-фенилаланина.

Как

указывалось

в гл. 1, в

химотрипсине

имеется четко выраженный карман

для

связывания ароматиче-

ской

боковой цепи аминокислоты

центр образования водород-

ной

связи (С=О-группа

Ser-214)

NH-группой

СНзСОЫН-фрагменте субстрата

(рис.

12.5).

При

замещении

ацетилфенилаланине С

СН2-

CONH-rpynn водородом

образовании простой ацетильной группы скорость деацилирова-

ния

уменьшается

в 10

раз

(правда, десятикратное уменьшение

скорости обусловлено индукционным эффектом CH

CONH-rpyn-

пы,

как это

видно

из

значений констант скорости катализируе-

мого гидроксил-ионами гидролиза эфиров; последняя колонка

табл. 12.2). Интересно,

что в

повышении реакционной способно-

сти

участвуют

как

ароматическое кольцо,

так и

ациламиногруп-

па (табл. 12.2). Ацетилглицинхимотрипсин деацилируется толь-

ко

в 12 раз

быстрее ацетилхимотрипсина,

и, как

видно

из

значе-

ний

констант скорости гидролиза, катализируемого гидроксил-

ионами,

это

увеличение обусловлено исключительно индукцион-

ным

эффектом ациламиногруппы,

а не

влиянием связывания.

СТРУКТУРА

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

367

Аналогичным образом р-фенилпропионилхимотрипсин деацили-

руется только в 17,8 раз быстрее ацетилхимотрипсина. Причина,

по

которой за повышение реакционной способности ответственны

как

ароматическое кольцо, так и ациламиногруппа, была выяв-

лена с помощью рентгеноструктурного анализа. Как отмечалось

в гл. 1 и

будет

показано ниже, карбонильный кислород поли-

пептидного субстрата расположен

между

NH-группами поли-

пептидного остова, принадлежащими

Ser-195

и Gly-193. Такой

Рис.

12.5. Некоторые аминокислотные остатки химотрипсина,

участвующие

связывании и катализе.

тип связывания был обнаружен недавно для специфического

ацилфермента карбобензокси-Ь-аланинэластазы [79], однако,

как

оказалось, присоединение карбонильного кислорода неспе-

цифического ацилфермента индолилакрилоилхимотрипсина не

приводит в данном

случае

к продуктивному связыванию [80].

Вместо этого

между

карбонильным кислородом и каталитиче-

ским

атомом азота His-57 молекула воды образует мостик из

водородных связей (рис. 12.6). Для осуществления реакции

карбонильный кислород должен повернуться в сторону центра

образования водородной связи

между

Ser-195

и Gly-193, а свя-

занная

молекула воды должна атаковать карбонильный атом

углерода.

Таким образом, присутствие и ациламиногруппы, и

ароматического кольца необходимо для правильной фиксации

карбонильной группы. Если какая-либо из этих фиксирующих

групп

отсутствует,

то карбонильный кислород оказывается во-

влеченным в непродуктивный тип связывания.

368

ГЛАВА

2. Стадия

ацилирования.

Как указывалось в гл. 10, запол-

нение

подцентров S

, S

и S

часто увеличивает

для

гидролиза полипептидных субстратов без уменьшения /См. При-

чина

такого явления неизвестна. Энергия связывания с подцент-

ром Si' также используется для увеличения

at,

а не для по-

Вода

Рис.

12.6. Кристаллическая

структура

индолилакрилоилхимотрипсина. [Hender-

son R., J. molec.

Biol.,

54, 341

(1970).]

Отметим, что карбонильный кислород

этого неспецифического ацилфермента связан не с NH-группами

Ser-195

Gly-193, а непродуктивно присоединен к His-57 через водородную связь с мо-

лекулой воды. Установлено, что этот ацилфермент деацилируется в растворе

с такой же скоростью, как и в кристалле (гл. 1).

[Rossi

G. L., Bernhard S. A.,

J. molec.

Biol.,

49, 85 (1970).!

вышения

прочности связывания. Было высказано предположе-

ние,

что это обусловлено наличием невыгодных взаимодействий

между

уходящей группой и ферментом, которые уменьшаются

при

образовании тетраэдрического промежуточного соединения

(гл. 10, разд.

В.5.в)

[81]. Возможно,

между

NH-группами по-

липептидного остова и отрицательно заряженным кислородом

тетраэдрического промежуточного соединения образуются более

прочные водородные связи, чем

между

указанными группами и

карбонильным

кислородом субстрата.

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 369

в.

Описание

механизма

реакции

Кинетические и структурные данные позволяют качественно

описать механизм ащилирования химотрипсина хорошим поли-

пептидным субстратом [81].

В специфическом кармане химотрипсина

между

атомом во-

дорода N-ациламиногруппы субстрата и карбонильной группой

Ser-214

образуется водородная связь. Все располагающиеся

Ч_/

Рис.

12.7. Ы-ацетил-Ь-триптофаналанинамид, связанный с химотрипсином. Об-

ратите внимание на образование водородных связей между карбонильной

группой субстрата и NH-группами остатков Gly-193 и Ser-195. Гидроксильная

группа

Ser-195

поворачивается из верхнего положения, занимаемого ею в

кристалле фермента, в сторону субстрата.

дальше остатки в N-ациламино-фрагменте связываются с до-

ступными подцентрами. Реакционноспособная карбонильная

группа располагается со своим атомом кислорода

между

NH-группами

Ser-195

и Gly-193 (рис. 12.7). Однако не исключе-

но,

что водородная связь

между

указанным атомом кислорода и

Gly-193 довольно слабая. Уходящая группа помещается в под-

центре Si, «втискиваясь»

между

ним и боковой цепью Ser-195.

Было

высказано предположение, что это заставляет реакцион-

носпособную гидроксильную группу

Ser-195

в химотрипсине по-

вернуться и занять примерно такое же положение, какое она

занимает в переходном состоянии. Однако в трипсине эта гид-

роксильная группа, по-видимому, частично повернута указан-

ным

выше образом и в отсутствие субстрата. Первой стадией

химического превращения в этой реакции является атака карбо-

нильного атома

углерода

субстрата гидроксильной группой

370

ГЛАВА

уэ

'Asp

102

Рис.

12.8. Образование тетраэдрического промежуточного соединения. Гидро-

ксильная

группа

Ser-195

продолжает поворачиваться и образует связь с суб-

стратом. При этом атомы углерода и кислорода карбонильной группы суб-

страта также перемещаются, возможно образуя более прочные водородные

связи

с группами полипептидного остова фермента.

.M-*-N

Слишком

Оj

тесный

контакт

/Asp

102

Рис.

12.9. Распад тетраэдрического промежуточного соединения, при котором

происходит высвобождение аланинамида и образование ацилфермента. Ала-

нинамид

не может остаться связанным с центром связывания уходящей

группы (S l) из-за слишком тесного контакта с карбонильной группой ацил-

фермента.