Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

Гл

а в а

ТРЕХМЕРНАЯ

СТРУКТУРА

ФЕРМЕНТОВ

В 1930 г. вышла книга Холдейна о ферментах [1], прочесть

которую стоит и сегодня. Более всего в этой книге меня поразило

несоответствие

между

обширностью для того времени знаний о

свойствах и действии ферментов и их ограниченностью в отно-

шении

химической природы ферментов: вопрос о том, являются

ли ферменты белками, все еще широко дискутировался. Такая

односторонность была обусловлена отсутствием методов, позво-

ляющих проводить прямое исследование ферментов. Вся

инфор-

мация

носила косвенный характер — ее источником служили

опыты по действию ферментов на соответствующие субстраты.

Тем не менее уже спустя немногим более 30 лет после получения

Бухнером в 1897 г. бесклеточного экстракта ферментов были

заложены основы современной ферментативной стационарной

кинетики.

Для дальнейшего развития энзимологии необходимо было

получить очищенные ферменты в количествах, сравнимых с ко-

личеством субстратов, и непосредственно исследовать их. Пер-

вые шаги в этом направлении сделал в 1926 г. Самнер, которому

удалось получить кристаллы уреазы, выделенной из экстрактов

канавалии мечевидной. Вскоре

(1930—1936

гг.) Нортроп и Ку-

нитц

закристаллизовали пепсин, трипсин и химотрипсин. Полу-

ченные факты позволили, наконец, доказать, что ферменты яв-

ляются белками, и дали возможность разработать методы сов-

ременной химии белка, определить аминокислотную последова-

тельность (Сэнджер), установить трехмерную

структуру

моле-

кул белков в растворе (Перутц и Кендрью), применить методы

исследования кинетики быстрых реакций (работы, начатые Роу-

тоном в 1923 г.).

Основная часть данной монографии посвящена прямым ис-

следованиям ферментов, выполненным уже после того, как вы-

шла в свет книга Холдейна [1]. В этой главе мы остановимся

на

наиболее значительном достижении в изучении ферментов —

установлении их трехмерной структуры. Кроме того, здесь же

вкратце

будет

рассмотрена

структура

лизоцима и сериновых

протеиназ, поскольку работы, связанные с экспериментальным и

ГЛАВА

теоретическим исследованием этих ферментов, обсуждаются в

последующих главах. В гл. 12 рассматриваются структура и

механизм действия отдельных ферментов.

А. Первичная структура белков

Остовом белковой молекулы является неразветвленная поли-

пептидная

цепь из L-a-аминокислот, которые связаны

друг

Е-цепь

Рис.

1.1. Первичная структура a-химотрипсина. Фермент состоит из трех це-

пей,

связанных друг с другом дисульфидными мостиками. Эти цепи образо-

вались

из одной полипептидной цепи химотрипсиногена в результате выщеп-

ления

аминокислотных остатков Sep-13,

Arg-14,

Thr-147 и Asn-148. (С любез-

ного

разрешения Blow D. М.)

ТРЕХМЕРНАЯ

СТРУКТУРА

ФЕРМЕНТОВ

Таблица

Основные аминокислоты

(RCH(NHJ)

CO2)

Аминокислота

(трех

однобук-

венные обозначения,

мол. вес)

Боковая цепь,

н—

СНз—

СНз

СН—

CHCHj—

СНз

СН3СН2

СНз

СН—

Глицин

(Qly, G, 75)

Алании

(Ala, A, 89)

Валин

(Val, V, 117)

Лейцин

(Leu, L, 131)

Изолейцин

(lie, I, 131)

Фенилаланин

(Phe, F, 165)

Тирозин

(Туг, Y, 181)

Триптофан

(Trp, W, 204)

Серии

(Ser, S, 106)

Треонин

(Thr, T, 119)

Цистеин

(Cys, С, 121)

Метионин

(Met, M, 149)

Аспарагин

(Asn, N, 132)

Глутамин

(Gin, Q, 146)

Аспарагиновая кислота

(Asp,

D, 133)

Значения

рК

взяты

из

справочника Data

for

biochemical research,

Dawson R. M. C,

Elliott

D. c.

Elllotf

W. H.,

Jones

К. М.,

Oxford

University

Press

(1969).

CH,—

—

HOCHj—

CH—

HSCH

—

SCH

—

(=O)CH

NC(=O)CH

—

CCH

—

2,35;

9,78

2,35;

9,87

2,29;

9,74

2,33;

9,74

2,32;

9,76

2,16-

9,18

2,20;

9,11; 10,13

2,43;

9,44

2,19;

9,21

2,09;

9,11

1,92; 8,35, 10,46

2,13;

9,28

2,1;

8,84

2,17;

9,13

1,99; 3,90; 9,90

ГЛАВА

Продолжение

Аминокислота (трех- и однобук-

венные

обозначения, мол. вес)

Глутаминовая кислота

(Glu,

E, 147)

Лизин

(Lys, К, 146)

Аргинин (Arg, R, 174)

Гистидин

(His, H, 155)

Пролин

(Pro, P, 115)

Боковая

цепь, R

"О

ССН

СН

—

(CH

)

\с—NH(CH

)

—

>СО

Р'

kj/ '' Н

2,10;

2,16;

1,82;

1,80;

1,95;

РК

4,07;

9,18;

8,99;

6,04;

10,64

9,47

10,79

12,48

9,33

другом

амидными связями; последние образуются а-карбок-

сильной

группой одного остатка и а-аминогруппой соседнего.

Обычно белки состоят только из 20 перечисленных в табл. 1.1

аминокислот.

Первичная

структура

белковой молекулы —

это

последовательность, в которой аминокислоты соединяются

друг

с другом, образуя биополимер. По договоренности эта

последовательность записывается, начиная с N-конца цепи:

NCHC

1—NHCHC—NHCHC—NHCHC—NH—

(1.1)

Почти

все внутриклеточные белки — это линейные полипеп-

тидные молекулы, многие же внеклеточные белки содержат

ковалентные поперечные (—S—S—)-мостики, образованные ти-

оловыми группами

двух

остатков цистеина. Эти мостики нахо-

дятся либо в пределах одной цепи (и

тогда

в главной полипеп-

тидной цепи возникают петли), либо связывают разные цепи

(рис.

1.1). В последнем

случае

из одноцепочечного предше-

ственника

результате

протеолитического расщепления форми-

руются многоцепочечные структуры. Примером такого рода мо-

жет служить образование инсулина из проинсулина и химо-

трипсина

из химотрипсиногена. При восстановлении тиолами

ТРЕХМЕРНАЯ

СТРУКТУРА

ФЕРМЕНТОВ 15

дисульфидные мостики разрываются. Интересно, что отдельные

полипептидные цепи часто можно восстановить и денатуриро-

вать, а затем вновь обратимо окислить и ренатурировать, в то

время как восстановление и денатурация белков, образовав-

шихся из предшественников путем химической модификации

последних, обычно носит необратимый характер.

Способность отдельных полипептидных цепей к самопроиз-

вольной укладке позволяет сделать важный вывод: трехмерная

структура

белка определяется генетически детермируемой ами-

нокислотной

последовательностью.

Б.

Трехмерная структура ферментов

1. Рентгеноструктурный анализ

Значение

рентгеноструктурного анализа в энзимологии, по-

жалуй, невозможно переоценить. Этот метод не только стал

экспериментальной

основой, позволившей получить все извест-

ные

к настоящему времени данные о

структуре

белков, но и

оказался

наиболее ценным методом исследования механизмов

ферментативного катализа. В этом разделе мы вкратце рас-

смотрим, какую информацию позволяют получить рентгено-

структурные исследования белков.

Рентгеновские лучи рассеиваются на электронах атомов ана-

логично

тому,

как рассеиваются световые волны, падающие на

дифракционную решетку. Для монохроматического пучка рент-

геновских лучей регулярная решетка кристалла играет роль

трехмерной дифракционной решетки, дающей рефлексы в тех

местах, где происходит усиление рассеянных лучей в

результате

интерференции.

Структуру

кристалла, или, точнее говоря, рас-

пределение электронной плотности, можно определить по рент-

генограмме с помощью преобразования Фурье. Для этого

необходимо знать интенсивность и направление дифрагирован-

ных лучей (что легко определить на фотопленке либо по распре-

делению рефлексов, либо с помощью дифрактометра), а также

их

фазы.

Определение фазы каждого рефлекса (главное условие

при

использовании преобразования Фурье) — наиболее трудная

задача. Способ ее решения, разработанный для случая простых

кристаллов, непригоден при установлении структуры белков.

Проблема

фаз была преградой на пути развития кристаллогра-

фии

белков до тех пор, пока в 1954 г. Перутц и др. [2] не

разработали метод

изоморфного

замещения,

основанный на

включении в определенные участки молекул белка тяжелых ато-

мов без нарушения кристаллической структуры белка и его упа-

ковки.

Атомы

металлов рассеивают рентгеновские лучи сильнее

ГЛАВА

атомов белка и изменяют интенсивность дифрагированных

лучей. Из изменения интенсивности, которая может как увели-

чиваться, так и уменьшаться в

результате

рассеяния на тяжелых

атомах, удается определить фазу дифрагированных на белке

лучей. Для точного определения фаз необходимо иметь несколь-

ко

различных изоморфных производных.

После

определения фаз и амплитуд

всех

дифрагированных

лучей рассчитывают электронную плотность белковой молекулы.

Затем в соответствии с рассчитанной электронной плотностью из

проволочных моделей аминокислотных остатков строят при-

ближенную модель молекулы белка, которую впоследствии

уточняют с помощью ЭВМ.

Точность и разрешение

Получаемая точность определяется качеством эксперимен-

тальных данных и

разрешением.

Смысл термина «разрешение»

лучше всего иллюстрируется данными табл. 1.2. Карта элект-

ронной

плотности, полученная при низком разрешении (порядка

Таблица

1.2

Разрешение

получаемая

информация

Разрешение,

<lA=0,l

нн)

5,5

3,5

3,0

2,5

1,5

0,77

Выявляемая

структура

Общая

конфигурация молекулы. Спирали в виде

интенсивно

рассеивающих лучи палочек

Полипептидный

остов (обычно не совсем четко)

Боковые

цепи (не совсем четко)

Четкое

разрешение боковых цепей. Разрешена

плоскость

пептидной группы. Расположение

атомов

определено с точностью ±0,4 А

Расположение

атомов определено с точностью

±0,1

А — предельная точность, достижимая

настоящее время в кристаллографии

Длины

связей в небольших кристаллах измерены

точностью

0,005

4—6 А), в большинстве случаев

дает

представление лишь об

общей конфигурации молекулы. При разрешении 3,5 А часто

удается определить положение полипептидного остова, хотя и не

совсем точно. Разрешение 3,0 А при благоприятных условиях

позволяет различить боковые цепи аминокислот и с той или иной

степенью точности сопоставить их последовательность с элект-

ронной

плотностью. При разрешении 2,5 А часто путем подгонки

ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ

можно найти местоположение атомов с точностью ±0,4 А. Что-

бы определить местоположение атомов с точностью 0,2 А, нужно

иметь совершенные кристаллы и разрешение 1,9 А. Что это

означает на практике, видно из рис. 1.2. Для получения высокого

разрешения

необходимо использовать при расчетах рефлексы,

полученные при больших

углах

рассеяния, а из рисунка видно,

что эти рефлексы очень сла-

бы.

Следует

отметить к то-

му же, что большинство кри-

сталлов

дает

худшую

ди-

фракционную

картину, чем

представленная на рис. 1.2.

Кроме

того, число рефлек-

сов,

которые необходимо

иметь, возрастает при пере-

ходе,

например, от разреше-

ния

3 А к разрешению 1,5 А

= 8 раз, а объем затра-

чиваемых при этом усилий

возрастает еще больше

вследствие ухудшения каче-

ства данных.

При

разрешении, боль-

шем чем 2,5 А, метод изо-

морфного

замещения при

исследовании кристаллов

белка становится неэффек-

тивным,

поскольку включе-

ние

тяжелых атомов в моле-

кулу

приводит к некоторым

изменениям

в ее структуре;

кроме того, становится очень

трудно определять неболь-

шие

изменения интенсивностей и без того крайне слабых реф-

лексов.

В настоящее время разработаны машинные методы

уточнения структуры, в которых используются значения интен-

сивностей,

полученные при более высоком разрешении, и мо-

дельная

структура,

определенная при разрешении

2—2,5

А.

Рис.

1.2. Рентгенограмма кристалла

а-химотрипсина, иллюстрирующая увели-

чение количества данных, необходимых

для получения более высокого разреше-

ния.

2. Структурные элементы белков

Еще до того как была определена

структура

белковых кри-

сталлов методом рентгеноструктурного анализа, Полинг и Кори

теоретически установили

структуру

единиц, которые, как было

впоследствии показано, являются основными строительными

ГЛАВА

блоками белков [3]. Сначала они установили

структуру

кри-

сталлов небольших пептидов, что позволило определить разме-

ры и геометрию пептидной связи, а затем после построения

точных моделей подобрали структуры, которые соответствовали

рентгенограммам фибриллярных белков. Дифракционные рент-

генограммы фибрилл представляют собой не набор точек, как

для трехмерных кристаллов, а ряд линий, соответствующих

расстояниям

между

регулярно повторяющимися элементами

структуры. Позднее этот метод построения моделей был исполь-

зован Уотсоном и Криком при установлении структуры ДНК.

а. Пептидная связь [3]

Исследование кристаллов небольших пептидов показало, что

пептидная связь плоская и имеетгранс-конфигурацию (рис. 1.3).

Такое строение характерно для

всех

пептидных связей в белках

3,8

Рис.

1.3. Пептидная связь. Все расстояния даны

ангстремах [3].

(за очень редким исключением). Планарность пептидной связи

обусловлена значительным смещением неподеленной электрон-

ной

пары азота к кислороду карбонильной группы. Связь С—N

соответственно укорочена и имеет характер двойной связи, ко-

торый нарушается при повороте вокруг этой связи; при этом

затрачивается энергия, равная энергии делокализации — 75—

88кДж-моль-'

(18—21

ккал-моль-

) [3,4]

>-< -— )C=N( (1.2)

ТРЕХМЕРНАЯ

СТРУКТУРА

ФЕРМЕНТОВ

б. Вторичная

структура:

а-спираль и р-структура [3]

Полипептидные цепи фибрил-

лярных белков организованы в

так называемую вторичную

структуру,

стабилизируемую во-

дородными связями. В этих упо-

рядоченных областях атом кис-

лорода каждой пептидной группы

образует водородную связь с NH-

группой соответствующей пеп-

тидной связи. При этом форми-

руются структуры

двух

основных

типов: а-спираль ( как показал

рентгеноструктурный анализ фиб-

рилл а-кератина) или

р-структу-

ра (в

случае

р-кератина). Поли-

пептидная цепь глобулярного бел-

ка

также самопроизвольно укла-

дывается с образованием локаль-

ных упорядоченных областей.

На

рис. 1.4 изображена а-спи-

раль. Она представляет собой ус-

тойчивую

структуру,

в которой

каждая амидная группа образует

водородную связь с третьей от нее

в любом направлении амидной

группой. Группы С = О распола-

гаются параллельно оси спи-

рали и почти точно напротив

NH-групп,

с которыми они сое-

диняются водородными связями.

Боковые цепи аминокислот на-

правлены под

углом

к оси спи-

рали. На каждый виток прихо-

дится 3,6 аминокислотных остат-

ка,

шаг спирали — около 5,4 А.

Вытянутая полипептидная цепь

(рис.

1.5) может образовать

комплементарные водородные

связи с параллельной ей цепью,

которая в свою очередь способна

соединяться с

другой

вытянутой цепью, в

результате

чего обра-

зуется складчатая

структура.

Существуют две устойчивые струк-

Рис.

1.4. Правая а-спираль —

структура, характерная для моле*

кул белков. (Из книги Pauling L.,

The nature of the chemical bond.

by Cornell University. С разреше-

ния

Cornell University Press.)

ГЛАВА

туры такого типа: параллельная плоская р-структура, в которой

все вытянутые цепи имеют одинаковое направление, и антипа-

раллельная плоская р-структура с чередующимся направлением

цепей

(рис. 1.6). Плоские связи при тетраэдрических атомах

углерода образуют плоскую

структуру.

Рис.

1.5. Вытянутая полипептидная цепь. Водородные связи перпендику-

лярны

плоскости рисунка, так что в результате наложения параллельных

цепей

друг

на

друга

образуется Р-структура.

Ос

Рис.

1.6. Две полипептидные цепи, образующие

Р-структуру.

Аналогич-

ным

образом можно присоединить следующие цепи.

Данные,

полученные из статистического анализа и опытов с

синтетическими полимерами, показывают, что одни аминокисло-

ты предпочитают находиться в составе спирали, тогда как дру-

гие дестабилизируют эту структуру [5]. Например, пролин не

может быть встроен в спираль без значительного нарушения ее

структуры.

в.

Изгибы в основной цепи [6—9]

Другой часто встречающийся тип структуры образуется в тех

местах, где основная цепь резко изменяет направление, образуя

«р-изгиб» из четырех последовательно расположенных остатков.

В этих случаях С=О-группа г-го остатка соединяется с по-