Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

[30 кал-(град-моль)-

т. е.

является довольно большой вели-

чиной.

Для

25°С

(298 К) она

равна примерно

кДж-моль-

(9 ккал • моль"

). Энтропия поступательного движения пропорци-

ональна объему, занимаемому молекулой;

чем

меньше объем,

тем меньше возможностей

для

движения молекулы

и тем

мень-

ше энтропия. Аналогичным образом энтропия уменьшается

увеличением концентрации вещества, поскольку средний объем,

занимаемый

молекулой, обратно пропорционален концентрации.

Отметим,

что

зависимость энтропии

от

массы слабая (табл.

2.3).

10-кратное увеличение молекулярного веса

(от 20 до 200) при-

водит лишь

небольшому изменению энтропии поступательного

движения.

Для больших органических молекул энтропия поступатель-

ного движения также весьма велика

— до 120

Дж-(град-

•моль)-

[30

кал-(град-моль)-

Она

слабо растет

увеличе-

нием

массы,

но не

зависит

от

концентрации.

Таблица

2.3

Энтропия

поступательного, вращательного

колебательного

движений

при 298 К [18]

Движение

поступательных

степени

свободы

для мол.

веса

20—200

(Стандартное состояние—1М)

вращательных

степени

свободы

Вода

к-Пропан

эндо-

Дициклопентадиен

Внутримолекулярное

вращение

Колебания, см-'

1000

800

400

200

100

Энтропия

Дж-(град-моль)~'

120-150

114

13-21

0,4

0,8

4,2

9,2

14,2

кал

•(град-моль)

29—36

10,5

21,5

27,2

3-5

0,1

0,2

1,0

2,2

3,4

Для большинства ковалентных связей неупругие колебания

вносят

энтропию очень небольшой вклад. Низкочастотные

ко-

лебания,

при

которых движение атомов менее ограничено,

могут

дать вклад, составляющий несколько энтропийных единиц.

Энт-

ропия

внутримолекулярного вращения равна

13—21

Дж-(град-

•моль)-

[3—5

кал-(град-моль)-'] (табл.

2.3).

ГЛАВА

в.

Уменьшение

энтропии

при

образовании

из

двух

молекул

одной

Образование из

двух

молекул одной приводит к потере од-

ного набора энтропии вращательного и поступательного дви-

жения.

Эти энтропийные составляющие для продукта слияния

двух

молекул лишь ненамного превышают соответствующие

Рис.

2.5. Каждая из изобра-

женных в верхней части ри-

сунка молекул имеет три

поступательных степени сво-

боды и три вращательных.

Молекула, образующаяся

при

слиянии

двух

таких мо-

лекул, имеет только три по-

ступательных степени свобо-

ды и три вращательных. Со-

ответствующее уменьшение

энтропии

частично компен-

сируется за счет увеличения

энтропии

внутримолекуляр-

ного

колебательного и вра-

щательного движения про-

дукта.

значения

для одной из исходных молекул, поскольку слабо

зависят от размера молекулы (табл. 2.3).Уменьшение энтропии

составляет примерно 190 Дж-(град-моль)-

[45 кал-(градХ

Хмоль)-

], т. е.

55—59

кДж-моль-

(13—14

ккал-моль-

) при

25°. Это уменьшение может частично компенсироваться за счет

возрастания энтропии внутримолекулярного движения, об-

условленного появлением новых типов вращений и колеба-

ний.

Приведенное

выше значение уменьшения энтропии относится

стандартному состоянию 1 М растворов. Если раствор более

разбавлен, энтропия уменьшится еще больше, поскольку энтро-

пия

поступательного движения зависит от концентрации.

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ 63

г. Энтропийное преимущество мономолекулярных реакций

над бимолекулярными

Сравним

реакцию

двух

молекул, А и В, в

результате

которой

образуется третья молекула, с аналогичной внутримолекуляр-

ной

реакцией:

*АВ*-*АВ

(2.22)

А В->

АВ*->

АВ

(2.23)

V У ч_^ V-^

В соответствии с вышеизложенным образование переходного

состояния

АВ+ сопровождается уменьшением энтропии посту-

пательного и вращательного движения. Внутримолекулярная

циклизация

[уравнение

(2.23)]

приводит лишь к небольшому

уменьшению энтропии внутримолекулярного вращения. Однако

уменьшение энтропии при образовании АВ* частично компен-

сируется за счет некоторого увеличения энтропии внутримоле-

кулярного вращения.

В зависимости от относительного увеличения и уменьшения

энтропии

внутримолекулярного вращения при внутримолеку-

лярной

реакции увеличение энтропии может достигать

190 Дж-(град-моль)-

[(45 кал-(град-моль)-

], или 55—

59 кДж-моль"

(13—14

ккал-моль-') при 25°. Это увеличение

эквивалентно

повышению эффективной концентрации соседней

группы. Подстановка величины 190 Дж-(град-моль)-

[(45 кал-(град-моль)-

] в энтропийный член уравнения (2.7)

дает

для максимальной эффективной концентрации соседней

группы значение 6- 10

М.

Уменьшение внутримолекулярного вращения весьма суще-

ственно снижает эффективную концентрацию. В

случае

сукци-

ната теряется три вращательные степени свободы. Согласно

оценкам

Пейджа и Дженкса, потеря вращательных степеней

свободы метиленовой группы приводит к уменьшению энтропии

примерно

на 13кДж- (град-моль)-

[(Зккал-(град-моль)-

], а

потеря вращательных степеней свободы при ограничении вра-

щения

вокруг связи

между

метиленовой и карбоксильной груп-

пами—

на 25кДж-(град-моль)-

[(6 ккал-(град-моль)-

]. Это

эквивалентно

множителю 2-Ю

. Если же свободное вращение

групп в молекулах производных янтарной кислоты заморозить,

то эффективная концентрация карбоксильной группы

будет

рав-

на

~5-10

М. Поправка на энергию экранирования атомов во-

дорода метиленовых групп при образовании пятичленного коль-

ца

дает

увеличение концентрации еще в 10 раз.

ГЛАВА

СО

•я

сн

Эти расчеты до конца справедливы только для газовой фазы.

Однако до работы Пейджа и Дженкса вообще не предполагали,

что реакции в растворе сопровождаются аналогичными измене-

ниями

энтропии, считая, что эффективная концентрация сосед-

ней

группы достигает 55 М, т. е. концентрации молекул воды в

воде. Это то значение, которое характерно для внутримолеку-

лярного общего основного катализа.

д. Зависимость эффективной концентрации от

«жесткости»

переходного состояния

Более низкая эффективная концентрация, полученная для

внутримолекулярного основного катализа, связана с тем, что

переходное состояние для этих реакций менее

«жестко».

В нук-

леофильных реакциях нуклеофил и электрофил довольно точно

фиксированы,

что и приводит к значительному уменьшению энт-

ропии.

При общем основном или кислотном катализе атомы в

переходном состоянии обладают довольно большой свободой

перемещения.

Положение катализатора фиксировано не столь

жестко, как в

случае

нуклеофильного катализа. Следовательно,

общий

основный катализ сопровождается меньшим снижением

энтропии,

т. е. внутримолекулярные реакции менее выгодны, чем

аналогичные им нуклеофильные.

При

расчете эффективных концентраций Кошланд вначале

предполагал, что концентрация внутримолекулярных групп при-

мерно равна концентрации молекул воды в водном растворе,

поскольку в растворе молекула полностью окружена водой [20].

Это

дает

верхний предел эффективной концентрации, равный

55 М, что эквивалентно изменению энтропии на 34 Дж-(град-

•моль)-

[(8 кал-(град-моль)-

]. Данная величина определяет

вероятность нахождения в растворе

друг

возле

друга

двух

мо-

лекул. Однако, как только две молекулы жестко связываются

друг

с другом, энтропия существенно уменьшается. «Разрых-

ленное» переходное состояние, вероятно, можно рассматривать

как

систему из

двух

молекул, находящихся рядом

друг

с другом,

но

сохранивших большую энтропийную свободу.

В заключение можно сказать, что энтропия является одним

из

важнейших факторов ферментативного катализа. Реакции,

катализируемые в растворе, протекают медленно, поскольку

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

сближение катализатора и субстрата приводит к значительному

уменьшению энтропии. Ферментативные реакции протекают в

пределах фермент-субстратного комплекса; каталитические

группы являются частью той же молекулы, что и

субстрат,

так

что в переходном состоянии уменьшения энтропии поступатель-

ного или вращательного движения не происходит. В

результате

этого «эффективные концентрации» каталитических групп ста-

новятся

очень высокими по сравнению с таковыми для бимоле-

кулярных реакций в растворе. Этот выигрыш в энтропии «опла-

чивается» энергией связывания субстрата ферментом. Умень-

шение

энтропии поступательного и вращательного движения

субстрата происходит при образовании фермент-субстратного

комплекса,

а не на химических стадиях реакции. (Уменьшение

энтропии

при образовании фермент-субстратного комплекса

увеличивает константу диссоциации последнего.)

5. «Орбитальное управление» [21]

Были

предприняты попытки объяснить увеличение скорости

реакции

при внутримолекулярном катализе повышением

эффек-

тивной

концентрации каталитических групп до 55 М и необхо-

димостью очень точной ориентации электронных орбиталей реа-

гирующих атомов («орбитальное управление»). Несомненная

заслуга

Шторма и Кошланда состоит в том, что они обратили

внимание

на роль точной ориентации в фермент-субстратном

комплексе,

однако эти авторы переоценили важность данного

фактора, поскольку, как теперь известно, при использовании

значения

55 М сильно недооценивается вклад в эффективную

концентрацию

энтропии поступательного движения. В настоя-

щее время считается, что, хотя перекрывание орбиталей в пе-

реходном состоянии и должно быть, оно может иметь точность

~10° [22, 23]. Напряжение, обусловленное деформацией

даже

полностью образовавшейся углерод-углеродной связи на 10°,

составляет всего 11 кДж-моль~' (2,7 ккал-моль-

). Для дефор-

мации

на 5° необходимо только 2,8 кДж-моль-' (0,68 ккал-

•моль-

) [19],

6. Электростатический катализ

Химические исследования с использованием модельных со-

единений

не выявили сколько-нибудь заметного ускорения реак-

ций

за счет электростатических сил. В

результате

некоторые

химики пришли к отрицанию самой идеи такого механизма,

однако это было связано с недопониманием тех особенностей

электростатических взаимодействий, которые имеют место в бел*

ковых молекулах. Энергия электростатического взаимодействия

ГЛАВА

двух

точечных зарядов в\ и е

, находящихся

друг

от

друга

на

расстоянии

г в среде с диэлектрической постоянной D, равна

/Dr.

(2.24)

Для протона и электрона, находящихся в

вакууме

на расстоянии

3,3 А, энергия взаимодействия составляет —418 кДж-моль-

(—100 ккал-моль-

). В воде, для которой диэлектрическая по-

стоянная

равна 79, эта величина уменьшается до

—5,4 кДж-моль-' (—1,3 ккал-моль-

). Как мы видим, чтобы

энергия

взаимодействия

между

двумя заряженными частицами

не

уменьшалась, они не должны находиться в водной среде.

Рассмотрим протонирование

двух

оснований аминов в воде:

NNH

Энергия

дестабилизации дикатиона с двумя расположенны-

ми

рядом положительными зарядами, образующимися при

протонировании

гидразина, составляет ~920 кДж-моль-

(220 ккал-моль"

), что соответствует энергии взаимодействия

двух

положительных зарядов, находящихся в

вакууме

на рас-

стоянии

1,5 А. Однако в действительности два значения р/Са

различаются только на 9 единиц, что соответствует разности

энергий

50,2 кДж-моль-

(12 ккал-моль-

Атомы

азота в три-

этилендиамине разделены расстоянием 2,6 А [уравнение (2.26)].

Можно

было бы ожидать, что в

вакууме

энергия взаимодействия

двух

положительных зарядов в этом дикатионе составит

~546

кДж•

моль-' (130 ккал-моль-

), однако второе значение

р/Са

соответствует изменению энергии только на 33,4 кДж

ккал).

По-видимому, в обоих случаях эффективная диэлект-

рическая

проницаемость среды

между

этими двумя атомами

азота равна примерно 17. Это обусловлено тем, что положи-

тельно заряженные ионы поляризуют растворитель и индуциру-

ют образование диполей. Электростатическое поле этих диполей

любых противоионов частично нейтрализуют положительное

поле катионов, в связи с чем окружающие ионы,

даже

не нахо-

дясь

между

катионами, понижают энергию их взаимодействия.

То обстоятельство, что исследования модельных соединений

проводились в воде, привело к сильной недооценке роли элект-

ростатического катализа в

случае

белков.

В органических растворителях электростатическое взаимо-

действие гораздо сильнее, нежели в воде, из-за более низкой

диэлектрической проницаемости. Это обстоятельство было ис-

пользовано химиками-синтетиками для повышения скоростей

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ 67

реакций.

Сказанное справедливо также и для ферментов. Здесь

уместно привести слова Перутца:

«Для

живой клетки неполяр-

ные внутренние области в молекулах ферментов играют ту же

роль, что и органический растворитель для химика-синтетика»

[24].

Проведенные недавно расчеты показали, что энергия стаби-

лизации карбоний-иона в реакции, катализируемой лизоцимом,

составляет 37,6 кДж (9 ккал); стабилизация осуществляется за

счет взаимодействия с карбоксилат-ионом

Asp-52

(относительно

неионизированной

карбоксильной группы) [25]. Это эквива*

лентно увеличению скорости в 4-Ю

раз.

7. Катализ ионами металлов [26]

а. Электрофильный катализ

Одна из функций, которую выполняют металлы в металло-

ферментах, состоит в том, что они выступают в роли электро-

фильных катализаторов, стабилизирующих образующиеся отри-

цательные заряды. В карбоксипептидазе (гл. 12) карбонильный

кислород амидной группы субстрата связан координационной

связью с ионом цинка этого фермента, что приводит к поляри-

зации

амида, подвергающегося нуклеофильной атаке, и эффек-

тивной стабилизации тетраэдрического промежуточного соеди-

нения.

/> /°"

R-C;

—> R-C(

(2.27)

NHR'

_Q/

NHR'

RCT

Такой механизм действия ионов металлов был продемонстриро-

ван на модельных соединениях, которые

дают

увеличение ско-

рости реакций в 10* — 10

раз [27, 28]. Например, при образо-

вании

координационной связи

между

(Этилендиамин)

Со

этиловым эфиром глицина скорость катализируемого основани-

ем гидролиза возрастает в 2-10

раз.

>Со

СН

-i

(2.28)

к/

OEt

NCH

(2.29)

НО"

ГЛАВА

б. Источник гидроксил-ионов при нейтральном значении рН

Другой

очень важный

результат,

полученный недавно при

кинетических исследованиях в области неорганической химии,

состоит в том, что связанные с металлом гидроксильные ионы

являются мощными нуклеофилами [29—31]. Связанная с ко-

бальтом молекула воды [см. уравнение

(2.30)

] имеет р/С

= 6,6;

это на 9 единиц ниже р/(а свободной воды

(NH

)

^=fc (NH

)

OH + H

(2.30)

Однако связанная с кобальтом гидроксильная группа только в

40 раз менее эффективна, чем свободный гидроксил-ион, в отно-

шении

ускорения гидратации двуокиси

углерода

[29]. Подобное

отсутствие

связи

между

высокой реакционной способностью и

р/Са является довольно общей закономерностью, проявляющейся

независимо от того, ион какого именно металла связан [31].

Таким

образом, источником нуклеофильных гидроксильных

групп при нейтральном значении рН

служат

связанные с метал-

лом молекулы воды. Подобно

тому

как основание с р/С

= 7

является наиболее эффективным общим основным катали-

затором (разд. Б, 2,6), связанная с металлом молекула воды с

рК& = 7 является наиболее эффективным соединением при нук-

леофильной атаке, поскольку

обладает

высокой реакционной

способностью и с большой вероятностью находится в ионизиро-

ванном

состоянии.

Изложенные соображения применимы и к механизму дей-

ствия карбоангидразы. Этот фермент, катализирующий гидра-

тацию СО

, содержит в активном центре ион цинка, связанный

координационной

связью с имидазольными кольцами

трех

ги-

стидиновых остатков. Согласно классическим представлениям о

механизме этой реакции, четвертый лиганд — это молекула во-

ды с р/Са = 7 [32]. Полагают, что реакционноспособной едини-

цей

является связанный с цинком гидроксил; это согласуется с

результатами химических исследований, согласно которым свя-

занные

с цинком гидроксильные группы

обладают

высокой ре-

акционной

способностью. Молекула воды в составе комплекса,

представленного на

схеме

(2.31), имеет р/С

= 8,7 и катализи-

рует

гидратацию двуокиси

углерода

и ацетальдегида [33].

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

Возможно, механизм действия карбоангидразы включает

следующую

реакцию:

Е—Zn

—O^C *=s E—Zn

HCOj.

(2.32)

Наличие связанной с металлом гидроксильной группы в со-

четании с внутримолекулярной реакцией привело к одному из

самых больших увеличений скорости реакции, характерному для

ненапряженных систем. Комплекс глицилглицина с (Этилендиа-

мин)

Со

+и

ыс

"гидроксилом [уравнение

(2.33)]

гидролизуется

при

рН = 7 почтив 10

раз быстрее, чем свободный глицилгли-

цин

[34].

CONHCH

pH7.25°C

Известны более сложные примеры катализа ионами метал-

лов. Кобальт в реакциях с участием витамина B

образует

ковалентные связи с углеродными атомами субстратов [35, 36].

Металлы

могут

также выступать в качестве проводников элект-

ронов в окислительно-восстановительных реакциях. Например, в

цитохроме с геминовое железо обратимо окисляется и восста-

навливается.

В. Ковалентный катализ

1. Электрофильный катализ с образованием

шиффова

основания [37]

Примером того, как кратковременная химическая модифика-

ция

может активировать

субстрат,

является образование шиф-

фова основания при конденсации амина с карбонильным соеди-

нением.

R' R'

^О Н

Ш *=*

<^NR

O=NR

(

R" R"

ГЛАВА

При

нейтральных рН шиффово основание может протониро-

ваться. Оно

действует

как электронный сток, стабилизируя об-

разование отрицательного заряда на одном из сс-углеродных

атомов:

СНз

~СН

1 СН

C=NR

• у

C=NR

*—*

^"^C-Q^R

(2.35)

/ Н /

/ Н

(енамж)

После

таутомеризации, в

результате

которой образуется

енамин,

атом

углерода

метиленовой группы активируется как

нуклеофил. Еще одним следствием образования шиффова осно-

вания

является облегчение атаки нуклеофилом карбонильного

углерода

вследствие сильного оттягивания электронов протони-

рованным

атомом азота.

а. Ацетоацетатдекарбоксилаза [38, 39]

Этот фермент катализирует декарбоксилирование ацетоаце-

тата до ацетона и двуокиси

углерода.

ходе

неферментативной

реакции

происходит отщепление сильно основного енолят-иона

при

нейтральном рН [уравнение (2.36)],

9°

•/ ч

О"

•

СН

сн

СН

С'. >

СН

(2.36)

СН

а в ферментативной реакции эта стадия

отсутствует,

но зато

образуется шиффово основание с остатком лизина. Затем про-

тонированный

имин легко отщепляется. Этот процесс можно

промоделировать в растворе, используя в качестве катализато-

ра анилин.