Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

в соответствии либо

со

схемой (2.58),

где

лимитирующей

ста-

дией является образование тетраэдрического промежуточного

соединения, либо

со

схемой (2.59),

где

лимитирующей стадией

является разрыв связи.

R—С

OR'

R—С

•7

OR'

ПС

(2.58)

R—С

OR'

R-/

R—С

в-

OR'

(2.59)

ПС

а.

Линейные

зависимости

свободной

энергии,

уравнения

Брёнстеда

Гам

мета

Количественно оценить чувствительность реакции

измене-

нию электронной плотности атакующего нуклеофила можно

пу-

тем измерения констант скорости второго порядка

для

реакций,

где определенный эфир атакуется рядом нуклеофилов. Анало-

гично

тому,

как это

делалось

для

общего основного катализа,

строят график зависимости логарифма константы скорости

от

рКа нуклеофила. Обычно

в тех

случаях,

когда используются

лишь нуклеофилы сходной химической природы

когда диапа-

зон

значений

р/(

невелик, получается линейная зависимость.

Наклон

прямой обозначается буквой

р, как и в

случае

общего

основного катализа.

Эти линейные зависимости

между

логарифмом константы

скорости

и рК

известны

под

названием

линейных

зависимостей

свободной энергии,

поскольку логарифм константы скорости

пропорционален энергии активации Гиббса

для

данной реакции,

а логарифм константы равновесия

—

изменению энергии Гиббса

реакции

(раньше энергия Гиббса называлась свободной

энер-

гией).

Наличие корреляции

между

нуклеофильностью нуклео-

фила

и его

основностью указывает

на то, что

энергия активации

Гиббса

для

образования связи

углеродом карбонильной груп-

пы

пропорциональна энергии Гиббса

для

переноса протона

нуклеофилу.

Аналогичная корреляция (соотношение Брёнстеда) суще-

ствует

между

константой скорости

и р/С

уходящей группы

в том

ГЛАВА

случае, когда определенный нуклеофил взаимодействует

с ря-

дом эфиров, имеющих разные уходящие группы. Другой способ

графического представления данных, который используется

для

ароматических соединений, основан

на

применении уравнения

Гаммета

констант Гаммета

для

заместителей.

Эти

константы,

характеризующие способность заместителей

бензольном коль-

це отдавать

или

принимать электроны, связаны

с рКа

замещен-

ных бензойных кислот следующей эмпирической зависимостью:

(Р^аК

(

р/С

а)

Х>

(2.60)

где

X —

заместитель

бензойной кислоте

мета-

или

пара-

положении,

(рКа)х — это р/Ca

замещенной кислоты,

Таблица

2.5

Константы,

характеризующие различные заместители

а)

Заместитель

—NH

—NHj

—NHAc

—ОН

—ОАс

—N(Me)

-со;

—СО

—СОСНз

—С1

—Вг

—I

—NO

—CN

—СНз

—ОСНз

Алифатическое

соединение ")

°1

0,10

0,60

0,28

0,25

0,39

0,73

—0,17

0,34

0,29

0,52

0,47

0,45

0,39

0,63

0,58

—0,05

0,25

°т

—0,16

0,63

0,21

0,121

0,39

0,88

-0,10

0,37

0,38

0,337

0,373

0,391

0,352

0,710

0,56

—0,069

0,115

Ароматическое

соединение

°Р

—0,66 (-0.17)

г)

0,00

-0,37 (—0,11)

г)

0,31

0,82

0,00

0,45

0,50 (0,87)

д)

0,062

0,227

0,232

0,18

0,778

(1,24)

А)

0,66

(0,90)

д)

-0,17

-0,268 (-0,11)

г)

> Из Charton M., J. org. Chem., 29, 1222 (1964); Ritchie С. О.,

Sager

W. F.,

Progress

Physical

Organic Chemistry, 2, 323 (1964).

> Рассчитано из уравнения (о,) х=[(РКа)СНзСО

Н-(РКа)Х-СН

СО

н]/з,95.

> Рассчитано из уравнения o=(pK

)phCO

H-(P^a)x-PhCO

) Для соединений, отличных от бензойной кислоты и карбонильных соединений.

) Для фенолов, анилинов и тиофеиолов.

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ 83

(рК

)о

— рКа незамещенной кислоты, ох — константа, характе-

ризующая заместитель X (разная для заместителей в

пара-

жега-положениях). Обнаружено, что уравнение Гаммета выпол-

няется и для реакций с

участием

производных бензойной кисло-

ты (при определении скорости гидролиза эфиров бензойной

кислоты, а также при изучении равновесий

других

реакций, в

которых

участвует

соединение с бензольным кольцом, например

при

ионизации фенолов), но, оценивая чувствительность реакции

изменению а, используют коэффициент пропорциональности р,

постоянный

для данной реакции. Например, при ионизации фе-

нолов

(Р*а)

-Р

СТ

Х.

(2.61)

где р = 2,1. Для щелочного гидролиза фенилацетатов

(2.62)

где р = 0,8.

Соотношения Брёнстеда и Гаммета эквивалентны. Например,

согласно уравнению Гаммета, для щелочного гидролиза фенил-

ацетатов логарифм константы скорости, как и р/С

исходных

фенолов, пропорционален а. Следовательно, логарифмы кон-

стант скорости гидролиза пропорциональны р/Са, что непосред-

ственно

следует

из графика Брёнстеда для зависимости лога-

рифма константы скорости от р/Са.

Соотношения Брёнстеда и Гаммета выполняются также в

случае

атаки определенным нуклеофилом эфира с конкретной

уходящей

группой, в которой варьируется ацильный фрагмент.

б. Смысл коэффициента р в уравнении Брёнстеда

Важным параметром, который можно определить из графи-

ков

Брёнстеда, является коэффициент р.

Знак

и величина этого

коэффициента

указывает на знак и величину заряда переходно-

го состояния. Рассмотрим, например, атаку эфиров нуклеофила-

ми.

Для констант равновесия при переносе ацильных групп

между

оксианионами, а также третичными аминами р равно

1,6—1,7.

Эта величина больше 1,0, поскольку ацетильная группа

сильнее оттягивает электроны, чем протон (для которого р =

1,0 по определению), и более чувствительна к изменению р/С

спирта или амина. Установлено, что для атаки третичными ами-

нами

эфиров, образованных сильно основными спиртами, значе-

ние

р при замене нуклеофила составляет

i+l,5,

а при замене

спирта —1,5 [43]. Это показывает, что переходное состояние

реакции по своей

структуре

очень близко к продуктам, т. е.

ГЛАВА2

характеризуется

тем, что

ацил почти полностью перенесен

от

спирта

на

амин [схема (2.63)],

OEt

сн.,—cf

'OEt

(2.63)

ПС

другом

крайнем случае,

для

реакции основных нуклеофи-

лов

эфирами, содержащими активированные уходящие груп-

пы,

коэффициент

равен +(0,1—0,2)

при

замене нуклеофила

— (0,1

—0,2) при

изменении

р/Са

уходящей группы.

Это

означа-

ет,

что в

переходном состоянии почти

не

происходит образования

новых

разрыва старых связей

и что оно

близко

по

своей

структуре

исходным соединениям:

RCT

СНзС

ОАг

.О

СНэ.С

RCT

' ОАг

(2.64)

ПС

Коэффициент

является мерой величины заряда, образую-

щегося

переходном состоянии,

а не

мерой степени образования

связи.

Однако

реакциях

(2.63)

(2.64),

также

других

ситуациях, характеризующихся отсутствием кислотно-основного

катализа, образование связи

заряда взаимосвязано, поэтому

служит также мерой степени образования связи.

При

наличии

же кислотно-основного катализа, когда происходит частичная

нейтрализация зарядов, образующихся

переходном состоянии,

между

р и

степенью образования связи никакой зависимости

нет

[44].

2. Факторы, определяющие нуклеофильность

легкость отщепления уходящей группы

Эффективность общего кислотно-основного катализа кисло-

род-и азот-содержащими основаниями зависит ТОЛЬКО

ОТ ИХ р/Са

не

зависит

от

химической природы этих соединений

(за ис-

ключением случая повышенной активности оксимов

при

общем

кислотном катализе),

а на

нуклеофильную реакционную способ-

ность заметно влияет природа реагентов.

Эти

реакции можно

разделить

на два

больших класса

зависимости

от

того,

слабые

или

сильные

электрофильные центры

при

этом атакуются

[45].

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

а. Реакции

нуклеофилов

карбонильной,

фосфорильной,

сульфгидрильной

другими

сильными

электрофильными

группами

Атака

нуклеофилом амидного, эфирного

или

карбонильного

углерода

сопровождается образованием «реально существую-

щего»

промежуточного соединения,

валентность углеродного

атома

не

превышает

при

этом обычного значения,

т. е. 4. Ана-

логичным образом атакуется эфир фосфорной кислоты, при этом

образуется промежуточное соединение

пятивалентным атомом

фосфора.

Переходное состояние

для

этой реакции включает

об-

разование обычной ковалентной связи. Такая ситуация харак-

терна

для

сильных электрофильных центров. Основным факто-

ром,

определяющим нуклеофильность

этих реакциях, является

основность нуклеофила

—

чем

она

выше,

тем

сильнее нуклео-

фильность.

Однако реакционные способности разных классов

нуклеофилов различаются: амины

тиолят-анионы,

как

прави-

ло,

более сильные нуклеофилы, чем окси-анионы [46,47]. Кроме

того,

ряд

нуклеофилов,

которых

два

электроотрицательных

атома расположены рядом (например,

OH,

CONHNH

НОО-

МеОО~), обладают большей реакцион*

ной

способностью, чем можно было

бы

ожидать, исходя

из

значе-

ний

их р/Са. Это

явление известно

под

названием

а-эффекта.

Относительные реакционные способности разных классов

нук-

леофилов часто коррелируют

константами равновесия реак-

ций

присоединения этих веществ

альдегидам

кетонам

[48].

Легкость

отщепления

группы

зависит

как от ее

р/С

так и от

состояния

протонирования.

По

существу

«хорошая уходящая

группа»— это группа, устойчивая

растворе. Например, м-нит-

рофенолят-ион

является хорошей уходящей группой, поскольку

представляет собой слабое основание (р/Са л-нитрофенола равен

7,0).

основе

его

стабильности лежит делокализация отрица-

тельного заряда

на

ароматическом кольце

нитрогруппе [схема

(2.65)

(2.66)

ГЛАВА

-1

-2

-3

-4

• о/

/\ i

•

N0H

•NH

Nrl

1 I I

PKa

Рис.

2.6. График зависимости Брёнстеда для нуклеофильнои атаки л-нитрофе-

нилацетата первичными и вторичными аминами. [Jencks W. P., Gilchrist М.,

Amer.

chem. Soc, 90,

2622,

1968).]

Обратите внимание, что такие нуклеофи-

лы,

как семикарбазид (SC), гидроксиламин и гидразин более реакционноспо-

собны («а-эффект»), чем можно было бы ожидать, исходя из значений их

рК>-

- 0-

6 8 10 12 Н IS

Рис.

2.7. График

зависимости

Брёнстеда

для атаки л-нитрофенилацетата окси-

анионами-нуклеофилами.

Как и в предыдущем

случае

(рис. 2.6), нуклео-

филы

(••) также обладают необычно высокой реакционной способностью

(«а-эффект»). Обратите внимание на нарушение линейности на графике

с увеличением р/(

для нуклеофилов с более высокой реакционной способно-

стью. Вообще говоря, для этих реакций соотношения Брёнстеда выполняются

только в узком диапазоне р/Са- Часто отклонение от линейности незаметно, по-

скольку число используемых оснований весьма невелико.

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

(2.65)]. Этот ион легко высвобождается непосредственно из

тетраэдрического промежуточного соединения [схема (2.66)].

Для данного класса уходящих групп уменьшение основности

приводит к облегчению отщепления уходящей группы.

Ацетат

(р/Са уксусной кислоты равен 4,76) — более хорошая уходящая

группа, чем n-нитрофенол и фосфат (р/С

около 7), которые в

свою очередь являются более хорошими уходящими группами,

чем ОН-

(р/Са=

15,8).

Отщепление алкоголят-ионов затруднено, поскольку это

сильные основания (р/С

низших спиртов равен примерно 16).

Отщепление спиртов ускоряется при общем кислотном катализе

[схема (2.67)].

СН

^ ^

СНз

~/х

СН

+HOEt

(267

по

OEt

он

H ВН

В.

Нитрофениловые эфиры часто используются в качестве ухо-

дящих групп в синтетических

субстратах

по

двум

причинам:

а) нитрофенолят-ион имеет характерный максимум поглощения

при

400 нм и, следовательно, легко идентифицируется спектро-

фотометрически; б) этот ион является очень хорошей уходящей

группой, в

результате

чего образуется реакционноспособный

субстрат.

Оба эти фактора обусловлены делокализацией заря-

дов [схема (2.65)].

Чтобы амин отщепился от молекулы, он должен присоеди-

нить протон, поскольку амид-ионы

(RNH-)

слишком нестабиль-

ны,

чтобы непосредственно высвобождаться в раствор. (Исклю-

чение составляют сильно активированные производные, напри-

мер, 2,4-динитроанилин.)

б.

Атака

нуклеофилом у насыщенного атома

углерода

Атака

нуклеофилом у насыщенного атома

углерода

(напри-

мер, бимолекулярная реакция, в

ходе

которой тиол атакует

углерод

метильной группы в S-аденозилметионине) сопровож-

дается образованием переходного состояния, в котором к обычно

четырехвалентному

углероду

присоединено пять групп (2.68).

<T%.s*

(2.68)

ДО

ГЛАВА

Такое число связей

не

является нормальным

для

углерода

свойственно лишь переходному состоянию. Это типичный пример

«слабого»

центра. Тяжелые, способные поляризоваться атомы,

например атомы серы

иода

(т. е.

«слабые»

лиганды), более

реакционноспособны,

чем

слабо поляризующиеся атомы

—

кис-

лород

или

азот

(т. е.

«сильные» лиганды). Способность

поля-

ризации

является главным фактором, определяющим нуклео-

фильность

по

отношению

алкильным группам

другим

сла-

бым центрам.

пределах любого данного класса соединений

увеличение основности увеличивает нуклеофильность, однако

при

переходе

от

класса

классу более важным фактором

ста-

новится способность

поляризации (табл.

2.6).

Таблица

2.6

Относительная реакционная способность

различных нуклеофилов

Нуклеофил

N0"

F-

СН

СО

С1"

НРО*-

Вг-

ОН"

CN"

SH"

—

1,74

-1,3

3,17

4,76

-7,0

5,17

7,21

-9,0

15,74

4,62

—

10,0

9,40

7,00

Реакционная

способность

по

отношению

реак-

ционной

способности

СНзВг

1,00

100

525

1,1

•

4,0 •

6,3-10

7,8

•

1,6-10*

3,1

•

1,1-10

1,3- 10

1,3-10

Swain

С. О.,

Scott

С. В., J. Am.

chem.

Soc. 75,

141 (1953).

Как

и в

случае

реакций

карбонильной группой, слабоос-

новные уходящие группы замещаются легче,

чем

группы

высо-

кой

основностью.

в.

Активация

уходящей

группы

Как

ясно

из

предыдущего раздела, замещение сильнооснов-

ных групп

карбонильных соединениях

групп, связанных

насыщенным атомом

углерода,

затруднено. Крайним примером

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

такого рода является этерификация спирта карбоксилат-ионом.

Для ее осуществления потребовалось бы образование тетраэд-

рического промежуточного соединения с двумя отрицательно

заряженными атомами кислорода и последующим высвобожде-

нием О

R—С—СГ

OR'

RCO

(2.69)

При

катализируемой аминоацил-тРНК-синтетазой этерифика-

ции

тРНК аминокислотами аминокислота активируется путем

образования связанного с ферментом смешанного ангидрида с

AMP [схема

(2.70)]

точно таким же образом, как это

делает

химик-органик, когда он активирует карбоновую кислоту с по-

мощью образования ацилхлорида или смешанного ангидрида.

.• W

г-

Р—О—Р—О—СН

id •

ОН

RHC

О о~

or+RHC—с—о—Р—осн

(2.70)

ОН

[Заметьте,

что в схеме (2.70) субстратом является комплекс АТР

магнием, причем ион Mg

является электрофильным катали-

затором].

Карбонильная группа аминокислоты активируется со-

гласно

схеме (2.70), связываясь с хорошей уходящей группой —

фосфатным

остатком AMP, имеющим р/С

около 6 или 7. Он

легко

атакуется одной из гидроксильных групп рибозного коль-

ца

концевого аденозина

тРНК.

ГЛАВА

Еще одним примером активации

уходящей

группы является

использование S-аденозилметионина, а не метионина в реакциях

метилирования. От метионина должен отщепляться относитель-

но

основный тиолят-анион, а из активированного производно-

го — вытесниться неосновная нейтральная сера.

"О

CHCH

-CH

(2.71)

он он

3. Применение линейных зависимостей

свободной энергии к ферментативным реакциям

Хотя

коэффициенты р получены уже для многих фермента-

тивных реакций, остается ряд нерешенных вопросов принципи-

ального характера. Прежде всего неясно, какой параметр —

fecat

или

fecat/^См

—

лучше

определять при исследовании влия-

ния

заместителей на реакционную способность. Параметр

kcat/Кгл

неудобен тем, что в него прямо

входит

энергия связы-

вания,

поэтому влияние заместителя на электронную конфигу-

рацию может маскироваться влиянием его на связывание. Па-

раметр же

fecat

зависит от таких факторов, как накопление

промежуточных соединений, непродуктивное связывание, на-

пряжение и индуцированное соответствие (см. гл. 3 и 10).

Известен по крайней мере один случай, когда влияние замести-

телей на непродуктивное связывание было ошибочно приписано

индуктивному влиянию на скорость реакции [49]. Во многих

отношениях

kcat/K/л

^- более надежный параметр, поскольку

все перечисленные выше нежелательные факторы, которые вли-

яют на &cat, в этом

случае

отсутствуют

(гл. 10). Тем не менее

для ряда ферментов была успешно исследована зависимость

реакционной

способности от

структуры.

Проведенные ранее

опыты по ацилированию химотрипсина неспецифическими суб-

стратами [50] и деацилированию неспецифических ацилфермен-

тов [51] показали, что данные реакции очень чувствительны к

оттягиванию электронов; это означает, что

субстрат

атакуется

основной группой. Исследования гидролиза замещенных анили-

нов

папаином (гл. 12, разд. Б.2) выявили, что р — большая

отрицательная величина, т. е. значения

kcat/Км

возра-

стают

при увеличении способности заместителя в анилиновом