Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ 101

1. Асимметричный фермент может превратить

симметричный субстрат в асимметричный

Хотя в случае простых химических реакций в молекуле

RR'

оба атома водорода эквивалентны, при связывании с

асимметричным активным центром фермента эта эквивалент-

ность может быть утрачена [67]. Например, присоединение к

ферменту молекулы CH

RR' группами R и R'

(2.90)

приводит к тому, что водородные атомы оказываются в разном

окружении.

Атом

может оказаться рядом с каталитически

активным основанием, тогда как атом Нь — попасть в неактив-

ное окружение.

Еще одним примером такого рода служат реакции между

карбонильными соединениями и соединениями с двойными уг-

лерод-углеродными связями. Если реагент атакует плоский три-

гональный атом углерода только с одной стороны, то образуется

оптически активное соединение. Например, если на схеме (2.91)

нуклеофил атакует ацетальдегид «с фронта», то образуется

продукт, изображенный слева, тогда как при атаке с

«тыла»

образуется энантиомер, изображенный справа.

Y СН

' (2.91)

(Заметим, что атака тригонального атома углерода всегда про-

исходит перпендикулярно плоскости двойной связи.) В случае

простой химической реакции в растворе вероятность атаки три-

гонального углеродного атома со всех сторон одинакова (2.91), и

в результате образуется рацемическая смесь, содержащая по

50% каждого энантиомера. В

ходе

ферментативной же реакции

атака возможна только с одной стороны, поскольку субстрат

жестко удерживается в асимметричном активном центре и для

атакующей группы доступна только одна сторона субстрата.

2. Обозначения [65]

Символы D и L, которые обычно используются для обозна-

чения

конфигурации, имеют тот недостаток, что не являются

абсолютными, а относятся к эталонному соединению. Более по-

102

ГЛАВА

лезная

система обозначений, описывающая

абсолютную

асим-

метрию молекул, использует символы R и S. Согласно этой

системе, определяется приоритет групп, связанных с хиральным

углеродным атомом, основанный на ряде правил, в основу кото-

рых положены значения атомного номера и массового числа

присоединенных атомов. Сначала рассматриваются атомы,

непосредственно связанные с хиральным атомом

углерода;

чем

больше атомный номер, тем выше приоритет атома. При наличии

изотопов

«старшим»

считается изотоп с большим массовым чис-

лом.

Если группы связаны с хиральным атомом

углерода

через

одинаковые атомы, то рассматриваются атомные номера и мас-

совые числа следующих атомов.

Лучше

всего этот

прин-

цип

иллюстрирует последовательность наиболее часто

встречающихся групп: —SH > —OR > —ОН >

NHCOR

—NH

> —CO

R > —СО

Н > —СНО > —СН

ОН >

—С

> СНз > —Т > —D > —Н. (Заметим, что приори-

тет группы —СНО выше, чем группы —

СН

ОН,

поскольку счи-

тается, что в группе С=О

углерод

связан с двумя атомами кис-

лорода.)

Хиральный атом

углерода

обозначается буквой R или S. На

этот атом смотрят в направлении, противоположном

тому,

кото-

рое

ведет

к заместителю, обладающему низшим приоритетом.

Если

приоритет оставшихся

трех

заместителей уменьшается в

направлении,

совпадающем с направлением движения часовой

стрелки, то говорят, что молекула имеет абсолютную конфигу-

рацию R (от rectus — правая). Если приоритет уменьшается в

обратном направлении, то считается, что имеет место абсолют-

ная

конфигурация 5 (от

sinister

— левая). Например,

СНО

СНО Н ^РН-ч

Н—С—ОН

з н»•<>« ОН = С J

(2.92)

СН

ОН

СН

ОН

НОН

СНО

В-иицерсиьдегид=К-глицеральдегид

СНО

СНО НО Н

НО—С—Н

Н»-С-«Н = ( С

(2.93)

СН

ОН

СН

ОН

L-глицеральдегид

S-

глнцеральдеъид

[Отметим, что формулы глицеральдегида, расположенные сле-

ва, написаны в соответствии с правилами Фишера; связи в

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

103

направлении

«восток — запад» выступают вперед из плоскости

рисунка, а связи, идущие в направлении «север — юг»,

уходят

за плоскость, как это изображено на формулах в центре схем

(2.92) и (2.93).]

сНз

СО

L-

аланин

s-аланин

Кроме

того, сушествует правило

прохиральности.

Например,

если

двум

протонам в этаноле присвоить индексы а и b и при-

нять,

что приоритет атома Н

выше, чем атома Нь [схема

(2.95)],

(2.95)

то Н

будет

считаться

npo-R-атошоы,

поскольку приоритет при

движении по часовой стрелке уменьшается. Напротив, атом Н

называют атомом

npo-S.

Обратите внимание, что если повторить

это рассмотрение, считая, что теперь приоритет атома Н

выше,

то все равно Н

остается лро-У?-атомом, а #ь—

npo-S.

Следо-

вательно, прохиральность является абсолютной и не зависит от

того, какому из атомов — Н

или Нь — принадлежит приори-

тет.

Две стороны соединения, содержащего тригоналбный

угле-

родный атом, на основании ряда сложных правил обозначаются

символами re (от rectus) и si (от sinister). Простой пример

такого рода приведен на схеме (2.96); одно и то же соединение

обращено к читателю двумя противоположными сторонами.

(2.96)

104

ГЛАВА

3. Примеры стереоспецифичности ферментов

а.

Никотинамидадениндинуклеотид-зависимое

окисление

восстановление

В окислительно-восстановительных реакциях NAD+ и NADP+

= Н и РОз соответственно) выступают в роли коферментов,

обратимо присоединяя водород в положение 4 никотинамидного

кольца.

(2.98)

Положение 4 в дигидроникотинамидном кольце является

прохиральным. Стороны никотинамидного кольца и протоны при

атоме С-4 можно пометить в соответствии с RS-системой, при-

няв,

что та часть кольца, которая содержит группу —

CONH

имеет больший приоритет, чем остальная

HR H

^.Cf

(299)

ходе

важных с исторической точки зрения экспериментов

было выявлено, что

между

субстратом и NAD+ происходит

прямой

стереоспецифический перенос водорода [68, 69]. Дрож-

жевая алкогольдегидрогеназа переносит 1 моль дейтерия от

на

NAD+.

При инкубации полученного таким путем

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

105

NADD

ферментом

немеченым ацетальдегидом

весь

дейтерий

оказывается перенесенным

от

NADD

на

образовавшийся спирт.

Дейтерий

или

водород стереоспецифически присоединяется

лишь

одной стороне молекулы NAD+

впоследствии

от

этой

же стороны отщепляется. Неспецифическое присоединение

обеим сторонам NAD+ привело

бы к

обратному переносу

на

ацетальдегид лишь

50%

дейтерия

(или

значительно меньшего

количества, поскольку кинетический изотопный эффект замед-

ляет перенос). Одни дегидрогеназы переносят водород

на ту же

сторону

NAD+,

что и

алкогольдегидрогеназа (дегидрогеназы

класса

А),

другие

—на

противоположную сторону (класс

В);

эти

дегидрогеназы перечислены

в гл. 12.

Впоследствии было

уста-

новлено,

что

ферменты класса

осуществляют перенос протона

re-стороне NAD+

(или

NADP+)

используют

npo-R-волорой

NADH.

NAD

—»

NADD

CDO

(2.100)

NADD

СН3СНО

—»

NAD

CH3CDHOH.

(2.101)

Перенос

на

альдегид также стереоспецифичен. Образую-

щийся

спирт

-{схема

(2.102)]

является S-энантиомером

обла-

дает

оптической активностью

удельным оптическим вращением

—0,28

± 0,03° [70].

Ну ,D

снДон

(2102

б.

Гидратация

фумарата,

катализируемая

фумаразой

Фумараза катализирует присоединение составных частей

во-

ды

по

двойной связи фумарата [схема (2.103)].

'CR

С ~CR

;я-

А ^ >

но

он

(2.103)

Стереохимический анализ образующейся яблочной кислоты

по-

казал,

что

присоединяющаяся

находится

транс-,

а не з

ц«с-положении

(т. е. D+

присоединяется

ввреху,

со

стороны

re,

a DO~

—

внизу,

со

стороны

si).

106

ГЛАВА

в.

Днс-ендиольное

промежуточное

соединение

в реакциях

ферментативной

изомеризации

альдоз в кетозы

При

катализе реакций изомеризации альдоз в кетозы обра-

зуется ендиольное промежуточное соединение, в котором пере-

носимый

протон [Т на схеме (2.104)] остается на той же сторо-

не

\ ^° т-с-он

=о

тсон

-> , (2.104)

с=

т—с—он

промежуточного соединения. Анализ стереохимии продуктов по-

казывает, что промежуточное соединение представляет собой

цис-, а не гранс-форму [71].

Альдозы, которые относительно атома С-2 являются ^-фор-

мами [схема (2.105)], всегда образуют кетозы, которые явля-

ются У?-формами относительно атома С-1. Это предполагает, что

ендиол имеет цис- [схема (2.105),

вверху],

а не грамс-конфигу-

рацию.

\ ^

ОН

—

он

1*-

.он

\ /

6=о

т,

.А»

СПИСОК

ЛИТЕРАТУРЫ

Pelzer

H.,

Wigner

E., Z. phys. Chem., B15, 445 (1932).

Eyring

H., Chem. Rev., 17, 65 (1935).

3. Evans M. G.,

Polanyi

M., Trans. Faraday Soc, 31, 875 (1935).

Frost

A. A.,

Pearson

R. G., Kinetics and mechanism, John

Wiley

& Sons

Inc.,

(1961).

5. Hammond G. S., J. Am. Chem. Soc, 77, 334 (1955).

Bronsted

J. N.,

Pedersen

K., Z. phys.

Chem.,

A108, 185 (1923).

7. Jencks W. P.,

Carriuolo

J., J. Am. chem. Soc, 83, 1743 (1961).

Fife

Т. Н.,

Aces.

chem. Res, 5, 264 (1972).

Craze

G. A.,

Kirby

A. J., J. chem. Soc. Perk. II, 61 (1974).

10.

Atkinson

R. F.,

Bruice

Т. С, J. Am. chem. Soc, 96, 819 (1974).

СПИСОК

ЛИТЕРАТУРЫ 107

11.

Bordwell F. G., Boyle W. J., Jr., J. Am.

chem.

Soc, 94, 3907 (1972).

12.

Fersht

A. R., Kirby A. J. J. Am.

chem.

Soc, 89, 4853, 4867 (1967); 90, 5818,

5826 (1968).

13.

Pierre

T. St., lencks W. P., J. Am.

chem.

Soc, 90, 3817 (1968).

14.

Получено

экстраполяцией

на

основании

данных, представленных в

рабо-

тах Gaejens E. Morawetz H., J. Am.

chem.

Soc, 82, 5328 (1960) and

Gold

V., Oakenfull D. G., Riley Т., J.

chem.

Soc, 1968B, 515 (1968).

15.

Fersht

A. R., Kirby A. J., J. Am.

chem.

Soc, 90, 5833 (1968).

16.

Higuchi Т., Eberson L, Macrae J. D., J. Am.

chem.

Soc, 89, 3001 (1967).

17.

lencks W. P., Barley F., Barnett R.,

Gilchrist

M., J. Am.

chem.

Soc, 88,

4464 (1966).

18.

Page

M. /., lencks W. P.,

Proc.

natn.

Acad. Sci., U. S. A., 68, 1678 (1971).

19.

Page

M. I.,

Chem.

Soc. Revs., 2, 295 (1973).

20.

Koshland D. £., Jr., J. theoret. Biol., 2, 75 (1962).

21.

Storm D. R., Koshland D. E., Jr., Proc. natn. Acad. Sci., U.S.A., 66, 445

(1970); J. Am. chem. Soc, 94, 5805 (1972).

22.

Bruice T. C, Brown A., Harris D. C, Proc. natn. Acad. Sci., U. S. A., 68,

658 (1971).

23.

Jencks W. P., Page M. I., Biochem. biophys. Res. Comm., 57, 887 (1974).

24.

Perutz M. F., Proc. Ry. Soc, B167, 448 (1967).

25.

Warshel A., Levitt M., J. molec. Biol., 103, 227 (1976).

26.

Mildvan A. S., The Enzymes, 2, 246 (1970).

27.

Buckingham D. A., Davis C. £., Foster D. M., Sargeson A. AT, J. Am.

chem. Soc, 92, 5571 (1970).

28.

Buckingham D. A., MacB. Harrowfield J., Sargeson A. M., J. Am. chem.

Soc,

96, 1726 (1974).

29.

Chaffee E., Dasgupta T. P., Harris G. M., J. Am. chem. Soc, 95, 4169

(1973).

30.

Palmer D. A., Harris G. M., Inorg. Chem., 13, 965 (1974).

31.

Buckingham D. A., Engelhardt L. M., J. Am. chem. Soc, 97, 5915 (1975).

32.

Coleman J. E., Prog, bioorg. Chem., 1, 159 (1971) (см. также

ссылки

этой

работе).

33.

Woolley P.,

Nature,

Lond., 258, 677 (1975).

34.

Buckingham D. A., Keene F. R., Sargeson A. M., J. Am.

chem.

Soc, 96,

4981 (1974).

35.

Finlay T. H., Valinsky J., Sato K.,

Abeles

R. Я., J. biol.

Chem.,

247, 4197

(1974).

36.

Golding

В. Т., Radom L, J. Am.

chem.

Soc, 98, 6331 (1976).

37.

Snell E. E., di Mari S. J., The Enzymes, 2, 335 (1976).

38.

Hamilton G. A., Westheimer F. H., J. Am.

chem.

Soc, 81, 6332 (1959).

39.

Warren S. G., Zerner В., Westheimer F. H., Biochemistry, 5, 817 (1966).

40.

Rose I. A.,

O'Connell

E. L, Mehler A. H., J. biol.

Chem.,

240, 1758 (1965).

41.

Rose I. A.,

O'Connell

E. L., J. biol.

Chem.,

244, 126 (1969).

42.

Davis L., Metzler D. E., The Enzymes, 7, 33 (1972).

43.

Fersht

A. R., Jencks W. P., J. Am.

chem.

Soc, 92, 5442 (1970).

44.

Fersht

A. R., J. Am.

chem.

Soc, 93, 3504 (1971).

45.

Pearson R. G, J.

chem.

Educ,

45, 103, 643 (1968).

46.

Jencks W. P.,

Carriuolo

J., J. Am.

chem.

Soc, 82, 1778 (1960).

47.

Jencks W. P.,

Gilchrist

M., J. Am.

chem.

Soc, 90, 2622 (1968).

48.

Sander E. G., Jencks W. P., J. Am.

chem.

Soc, 90, 6154 (1968).

49.

Fastrez J.,

Fersht

A. R., Biochemistry, 12, 1067 (1973).

50.

Bender M. L, Nakamura K., J. Am.

chem.

Soc, 84, 2577 (1962).

51.

Caplow

M., Jencks W. P.,

Fedn

Proc,

21, 248 (1962).

52.

Lowe G., Yuthavong У., Biochem. J., 124, 107 (1971).

53.

Klinman J., Biochemistry, 15, 2018 (1976).

54.

Jarv J., Kesvatera Т., Aaviksaar A., Eur. J. Biochem., 67, 315 (1976).

55.

Thomsen J. S., Phys. Rev., 91, 1263 (1953).

108 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

56. Krupka R. M.,

Kaplan

H., Laidler К. J., Trans. Farad. Soc, 62, 2754 (1966).

57. Richards J. H., The Enzymes, 2, 321 (1970).

58.

Sawyer С. В.,

Kirsch

J. F,, J. Am. chem. Soc, 95, 7375 (1973).

59. Sawyer С. В.,

Kirsch

J. F., J. Am. chem. Soc, 97, 1963 (1975).

60.

O'Leary

M. H.,

Urberg

M.,

Young

A. P., Biochemistry, 13, 2077 (1974).

61.

O'Leary

M. H., Kluetz M. D., J. Am. chem. Soc, 94, 3584 (1972).

62.

Dahlquist

F. W., Rand-Meir Т., Raftery M. A., Proc. natn Acad., U. S. A.,

61,

1194 (1968).

63.

Smith L. E. H., Mohr L. H., Raftery M. A., J. Am. chem. Soc, 95, 7497

(1973).

64.

Kresge

A. J., J. Am. chem. Soc, 95, 3065 (1972).

65.

Popjak

G., The Enzymes, 2, 115 (1970).

66.

Bergman

M.,

Fruton

J. S., J. biol. Chem., 117, 193 (1937).

67.

Ogston

A., Nature, Lond., 162, 963 (1948).

68. Westheimer F. H.

Fisher

H.,

Conn

E. E.,

Vennesland

В., J. Am. chem. Soc,

73,

2043 (1951).

69.

Fisher

H. F.,

Conn

E. £.,

Vennesland

В., Westheimer F. H., J. bjol. Chem.,

202, 687 (1953).

70. Levy H. R., Loewus F. A.,

Vennesland

В., J. Am. chem. Soc, 79, 2949

(1957).

71.

Rose

1. A.,

O'Connell

E. L., Biochim. biophys. Acta, 42, 159 (1960).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ

ЛИТЕРАТУРА

Jencks W. P., Catalysis in chemistry and enzymology, McGraw-Hill Inc. (1969).

(Имеется

перевод: Дженкс В. Катализ в химии и энзимологии. — М.:

Мир,

1972.) (Подробно рассмотрено большинство вопросов, обсуждаемых

данной главе.)

Page

M. /., The energetics of neighbouring group participation, Chem. Soc.

Revs., 2, 295 (1973). (Рассмотрены вопросы, касающиеся энтропии, на-

пряжения

и т. д. в случае внутримолекулярных реакций.)

Bruice

Т. С, Benkovic S. J., Bioorganic mechanisms, Benjamin W. A. (1966).

(Исчерпывающее

описание химических механизмов многих важных в био-

логическом отношении реакций.)

Глава

ОСНОВНЫЕ

УРАВНЕНИЯ

ФЕРМЕНТАТИВНОЙ КИНЕТИКИ

А.

Стационарная

кинетика

Концепция

стационарного состояния широко используется в

динамических системах. Система находится в стационарном со-

стоянии,

если некоторые существенные для ее характеристики

величины не меняются со временем или если скорость образова-

ния

какого-либо существенного компонента системы равна ско-

рости его распада. Например, в стационарном состоянии ско-

рость увеличения численности населения данной страны равна

скорости его убыли. Аналогичным образом концентрация мета-

болита в клетке стационарна, если скорость его образования

равна скорости распада. В ферментативной кинетике эта кон-

цепция

применяется к концентрациям ферментсодержащих про-

межуточных

соединений. При смешивании фермента с большим

избытком

субстрата

наблюдается период, известный под назва-

нием

прёдстационарного,

во время которого концентрации этих

промежуточных соединений

выходят

на стационарный уровень.

Вслед

за этим скорость реакции меняется со временем сравни-

тельно медленно, и можно считать, что концентрации промежу-

точных соединений являются стационарными. По традиции ско-

рость ферментативных реакций измеряют именно на этом

стационарном участке. Стационарное состояние является изве-

стной аппроксимацией, поскольку

субстрат

постепенно

расходу-

ется в

ходе

эксперимента. Однако, если скорость измеряется за

достаточно короткий отрезок времени и концентрация

субстрата

остается практически постоянной, это приближение является

достаточно хорошим.

Хотя

концепция предстационарности, несомненно, весьма по-

лезна для анализа химических механизмов ферментативного

катализа (гл. 4 и 7), для анализа метаболизма более важны

данные стационарной кинетики, поскольку они

характеризуют

каталитическую активность фермента в условиях

существующе-

го в клетке стационарного состояния.

110

ГЛАВА

1. Экспериментальная основа:

уравнение Михаэлиса—Ментен [1]

При

выводе приведенных ниже кинетических уравнений

предполагается, что концентрация фермента пренебрежимо ма-

ла по сравнению с концентрацией

субстрата.

За исключением тех

случаев,

когда речь

идет

о быстрых реакциях, описанных в

следующей

главе, это допущение выполняется почти

всегда,

Рис.

3.1. Зависимость скорости реакции от концентрации

субстрата

для

меха-

низма

Михаэлиса — Ментен.

поскольку каталитическая эффективность ферментов достаточно

высока.

Как

правило, начальная скорость v образования продукта

или превращения

субстрата

участием

фермента прямо пропор-

циональна концентрации фермента [Е]о. Однако по мере повы-

шения

концентрации

субстрата

[S] линейность начинает нару-

шаться, рост v замедляется и наконец при достаточно высо-

ких, или

насыщающих,

концентрациях S скорость

достигает

предельного значения

Vmax-

Аналитически этот процесс описы-

вается уравнением Михаэлиса — Ментен, основным уравне-

нием

ферментативной кинетики:

где

"cat

(3.1)

(3.2)