Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

ОСНОВНЫЕ

УРАВНЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ

КИНЕТИКИ

121

Рис.

3.5. А. Конкурентное ингибирование; ингибитор и

субстрат

конкурируют

за один и тот же центр связывания. Например, индол, фенол и бензол связы-

ваются в гидрофобном кармане химотрипсина и ингибируют гидролиз про-

изводных триптофана, тирозина и фенилаланина. Б. Неконкурентное ингиби-

рование;

ингибитор и

субстрат

одновременно связываются с ферментом. При-

мером такой реакции может служить ингибирование фруктозо-1,6-дифосфа-

тазы AMP. Этот тип ингибирования имеет много общего с действием мульти-

субстратных ферментов. Примером бесконкурентного ингибирования односуб-

стратного фермента, который встречается довольно редко, является ингибиро-

вание щелочной фосфатазы L-фенилаланином [Ghosh N. К-, Fishman W. H.,

J. biol. Chem., 241, 2516 (1966)]. Этот фермент состоит из

двух

идентичных

субъединиц, и фенилаланин предположительно связывается с одним центром,

субстрат

— с другим.

иная

картина:

*cat

(3.33)

Для частного

случая

механизма Михаэлиса — Ментен,

когда

константы диссоциации для высвобождения

субстрата

из комп-

122

ГЛАВА 3

лексов EIS и ES одинаковы (т. е. К

1Л

К'

1А

но комплекс ESI

нереакционноспособен

(т. е. /г' = 0),

Yii+7"

(

з4

Это случай

неконкурентного

ингибирования: в присутствии

ингибитора константа Км не изменяется, a

уменьшается в

+[I]/^i)

раз. В более общем

случае

константы диссоциации

для высвобождения S из комплексов EIS и ES различаются. Это

приводит к

тому,

что в присутствии ингибитора меняются оба

параметра (Км и fe

at), и такое ингибирование называют сме-

шанным.

Ингибирование, при котором I связывается ES и не

связывается Е, получило название

бесконкурентного.

Д.

Непродуктивное связывание

Известны

случаи, когда наряду с продуктивным связыванием

происходит связывание субстрата с активным центром фермента

таким

образом, что образуется неактивный комплекс. Подобные

случаи носят название непродуктивного связывания.

v/ES *• ЕР

Е((

(3.35)

*sV*

ES'

Влияние непродуктивного связывания на механизм Михаэ-

лиса — Ментен проявляется в уменьшении обоих параметров,

fecat

/См. Параметр k

t уменьшается из-за того, что при

насыщении

продуктивно связывается только часть субстрата. Км

становится меньше Ks, поскольку наличие дополнительных ва-

риантов связывания должно приводить к более прочному свя-

зыванию.

Решая

уравнение

(3.35)

обычным способом, получаем

Из

сопоставления уравнений

(3.36)

и уравнения Михаэлиса —

Ментен

получаем

fecat

/(l +

tfs/*s)

(3.37)

*M = *S/(1 + *S/*S)-

(3.38)

Следует

отметить, что

(3.39)

ОСНОВНЫЕ

УРАВНЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ КИНЕТИКИ 123

Другими словами, на отношение k

t/Km не влияет наличие

дополнительного способа связывания, поскольку k

ai и Km из-

меняются симбатно. Так, например, если непродуктивно связы-

вающий центр связывает

субстрат

в 1000 раз прочнее, чем про-

дуктивно связывающий, то Km

будет

в 1000 раз меньше Ks,

однако,

поскольку из тысячи молекул продуктивно связывается

только одна,

будет

в 1000 раз меньше, чем k

(строго

говоря, в 1001 раз).

Е.

KJK

Уравнение

(3.39)

для непродуктивного связывания носит до-

вольно общий характер. Оно применимо не только к случаям

непродуктивного связывания, но и к реакциям, в

ходе

которых

образуются промежуточные соединения. Например, если для

катализируемого химотрипсином гидролиза эфиров [схема

(3.19)], при котором происходит накопление ацилфермента,

взять отношение выражений

(3.21)

и (3.22), мы получим равен-

ство

t/KM.

/Ks.

Очевидно, это соотношение не выполня-

ется для механизма Бриггса — Холдейна, когда фермент-суб-

стратный комплекс не находится в термодинамическом равнове-

сии

со свободным ферментом и субстратами.

Следует

иметь в

виду,

что если имеется несколько фермент-содержащих проме-

жуточных соединений, находящихся по отношению

друг

другу

состоянии быстро устанавливающегося равновесия, как в

схеме

(3.16), Km может оказаться сложной функцией многих

компонент.

В этом

случае

в параметр

at/Km

вносят вклад все

фермент-содержащие соединения.

Ж.

Конкурирующие

субстраты

1. Другая форма записи уравнения

Михаэлиса — Ментен

Предположим, что за активный центр фермента конкурируют

два субстрата:

(3.40)

Скорости

реакций можно получить с помощью обычных методов

стационарной

кинетики или из уравнения Михаэлиса — Ментен.

Однако если нас интересует отношение скоростей, то можно

124

ГЛАВА

воспользоваться следующим простым приемом. Подставив

(3.24)

в уравнение Михаэлиса — Ментен (3.1), получаем

°-(*c.t/*M)[E][S],

(3.41)

где [Е] — концентрация свободного фермента. Ценность этого

уравнения состоит в том, что в него вместо [Е]

входит

[Е].

Оно позволяет прямо получить ряд важных соотношений.

2. Специфичность ферментов по отношению

конкурирующим субстратам

Если за фермент конкурируют два субстрата, А и В, то,

поскольку

[A]/dt

= v

= (ft

cat

/tf

)

[E] [A] (3.42)

= (*

cat

/tf

)

[E] [B], (3.43)

(3.44)

Отсюда

следует

важный вывод: специфичность, т. е. выбор

ферментом только одного из

двух

конкурирующих субстратов,

определяется отношением k

t/KiA, а не параметром /См как

таковым. Поскольку йса^Лм не зависит от непродуктивного

связывания или накопления промежуточных соединений, эти

факторы не влияют на специфичность (гл. 11).

Обратимость:

уравнение

Холдейна

[10]

1. Равновесие в растворе

=*=*

Р,

(3.45)

[P]/[S]

/*r

(3.46)

Фермент не может изменить константу равновесия для взаи-

мопревращений свободных субстрата и фермента в растворе. Это

означает, что величины

kcat/Кгл

для прямой и обратной реакций

связаны определенным соотношением. В частности, в равнове-

сии,

когда скорости образования Р и S равны,

(3.44)

дает

(*cat/*M)

[Е] [S] =

м1

/К

)

[Е] [Р],

(3.47)

ОСНОВНЫЕ

УРАВНЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ КИНЕТИКИ 125

так

что

(3.48)

Выведенное соотношение известно как уравнение Холдейна, ко-

торое этот ученый получил в 1930 г.

2. Равновесие на поверхности молекулы фермента

Уравнение Холдейна не связывает константу равновесия для

реакции

взаимопревращения ES и ЕР с константой равновесия

процесса

S+tP

в растворе. Константы равновесия для процес-

сов,

протекающих с участием связанных с ферментом реаген-

тов, часто весьма существенно отличаются от констант равно-

весия

реакций

между

теми же реагентами в растворе. Обуслов-

лено это несколькими причинами:

«Напряжение».

Геометрия активного центра может быть

такова, что, например, Р связывается более прочно, чем S. Для

положение равновесия на поверхности фермента

будет

бо-

лее благоприятным, чем в растворе.

«Непродуктивное

связывание».

Если

существуют

иные,

отличные от каталитически продуктивного способы связывания

субстрата S ферментом, то положение равновесия

будет

бла-

гоприятствовать образованию ES.

«Энтропия».

В том случае, когда «Р» представлен моле-

кулами

двух

видов, т. е.

S ч=* Р + Р',

(3.49)

константа равновесия для раствора содержит член, отражаю-

щий

выигрыш в энтропии при образовании

двух

молекул из

одной.

Однако если с поверхностью фермента связываются как

Р,

так и Р', т. е.

ES *=£ ЕРР',

(3.50)

то соответствующая константа равновесия этого энтропийного

члена содержать не

будет.

Пример

сильного различия

между

константами равновесия

для раствора и при связывании субстрата с поверхностью фер-

мента приведен в гл. 7, разд. Д. Константа равновесия для

реакции

гидролиза, когда АТР находится в равновесии с АДР и

ортофосфатом на поверхности молекулы миозина (Si), равна

лишь

9, в то время как для раствора константа равновесия

составляет

—10

И.

Невыполнимость

уравнения

Михаэлиса — Ментен

Помимо

таких тривиальных причин, как невозможность про-

вести измерение начальной скорости реакции, применимость

126

ГЛАВА 3

уравнения Михаэлиса

—

Ментен ограничена

еще

двумя основ-

ными

факторами.

Первый

из

них

—

ингибирование избытком субстрата.

При

связывании

ферментом второй молекулы субстрата образуется

каталитически неактивный комплекс

Если

для

простого

механизма Михаэлиса

—

Ментен

вторую

константу диссоциации

обозначить через /Cs

, мы

получим

При

низких концентрациях

уравнение скорости,

как

обыч-

но,

имеет

вид v

=[E]o[S]k

at/Ks-

Однако

по

мере увеличения

[S]

достигает максимального значения

затем начинает

па-

дать.

Второй фактор

—

активация избытком субстрата: образую-

щийся

комплекс

ES2

более активен,

чем ES.

К.

Мультисубстратные системы

До

сих пор мы

рассматривали ферменты, которые взаимо-

действуют

только

одним субстратом. Однако большинство

ферментов связывают

два

субстрата.

Так,

например, дегидроге-

назы связывают NAD+

субстрат,

который должен быть окис-

лен.

Многие положения, справедливые

для

односубстратных

си-

стем, применимы

и к

мультисубстратным системам. Однако

найти общее решение уравнений

для

таких случаев довольно

сложно,

и эта

задача выходит

за

рамки данной монографии.

Недавно вышли четыре книги, почти целиком посвященные

де-

тальному анализу стационарной кинетики мультисубстратных

систем;

этим книгам

мы и

отсылаем заинтересованного чита-

теля [11 —14]. Весьма полезно ознакомиться также

превос-

ходными краткими обзорами Клеланда

[15] и

Диила

[16].

Для

нас же

наибольший интерес представляет

тот

факт,

что

большинство реакций подчиняется кинетике Михаэлиса

—

Мен-

тен

при

такой постановке опыта, когда концентрация одного

субстрата поддерживается постоянной,

концентрация

другого

меняется. Более того,

на

практике обычно встречается весьма

ограниченный набор механизмов. Ниже

мы

только перечислим

некоторые

из них

(самые распространенные)

приведем основ-

ные термины.

Реакции,

которых

все

субстраты связываются ферментом

до того,

как

образуется первый продукт, называются

последо-

вательными.

Если один

или

несколько продуктов высвобожда-

ются

до

присоединения

всех

субстратов, такой механизм назы-

ОСНОВНЫЕ

УРАВНЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ

КИНЕТИКИ

127

вается механизмом типа

пинг-понг.

Последовательные механиз-

мы называют

упорядоченными,

если связывание субстратов

высвобождение продуктов происходят

строго определенном

порядке.

Если

же

этот порядок

отсутствует,

то

механизм назы-

вают

неупорядоченным.

Термин

быстро

устанавливающееся

равновесие

используют

в тех

случаях,

когда химические стадии

являются более медленными,

чем

стадии связывания реагентов.

Ниже

приведено несколько примеров рассмотренных механиз-

мов.

1. Неупорядоченный последовательный механизм

ЕА

к// \\в

(\ )/

ЕАВ

52)

ЕВ

Комплекс

ЕАВ

называют

тройным,

или

центральным.

2. Упорядоченный механизм

ц=£ ЕА +=£ ЕАВ —>-

(3.53)

Упорядоченные механизмы часто имеют место

реакциях,

катализируемых ЫАО+-зависимыми дегидрогеназами, причем

первым связывается кофермент.

Это

можно объяснить

тем, что

связывание динуклеотида вызывает конформационное измене-

ние,

увеличивающее сродство фермента

другому

субстрату

(гл.

12).

3. Механизм Теорелла

—

Чанса

Примером

упорядоченного механизма является механизм

Теорелла

—

Чанса, когда

ходе

реакции

не

происходит накопле-

ния

тройного комплекса

(как это

установлено

случае

алко-

гольдегидрогеназы

из

печени лошади):

ЕА

-^^-> EQ.

(3.54)

(Для реакции, катализируемой алкогольдегидрогеназои печени,

— это

ацетальдегид,

Q —

NADH.)

4. Механизм типа пинг-понг (механизм

замещением

фермента,

или

механизм двухтактного замещения)

Реакции,

которой фермент взаимодействует

одним

суб-

стратом

образованием химически модифицированного

фер-

128

ГЛАВА

мента

высвобождением одного продукта,

затем вновь реаги-

рует

со

вторым субстратом:

+ А

=*=£

Е-А

Ч=^ Е—P

Q, (3.55)

Е—Р

?=ь

Е—Р-В

—>

Е+Р—В,

(3.56)

соответствует характерное семейство прямых

на

графике

Лай-

нуивера

—

Бэрка (рис.

3.6).

f/v

\Уееличение[в]

I/ISJ

Рис.

3.6.

Параллельные прямые

на

графике двойных обратных координат,

характерные

для

механизма типа пинг-понг.

При

увеличении концентрации

второго

субстрата

указанной последовательности

msx

возрастает,

как и

Км для

первого

субстрата.

Параметр

Vmax/Км

—

величина, обратная тангенсу

наклона прямых,

—

остается постоянной.

Примером

реакции, протекающей

по

механизму типа пинг-

понг,

является реакция, катализируемая переносящим фосфат

ферментом (например, фосфоглицеромутазой), который фосфо-

рилируется одним субстратом

образованием фосфорилфер-

мента

(Е—Р),

затем переносит фосфорильную группу

на вто-

рой

субстрат:

Е—N

•

ROPO^"

Е—N—

R'OH

E-N

(3.57)

В реакции (3.57)

случае фосфоглицеромутазы

представляет

собой имидазол боковой цепи остатка гистидина

(гл. 12,

разд.

Ж,3).

Другой пример

—

перенос ацильной группы

от аце-

тилкофермента

А на

сульфанилимид

или

другие амины, катали-

ОСНОВНЫЕ

УРАВНЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ

КИНЕТИКИ

129

зируемый ацетил-СоА: ариламин—ацетилтрансферазой

Е—SH

+ CH

COSCoA з=*

RNH

*=*

Е—SH-CH

COSCoA ^-> Е—S—СОСНз -^—> Е—SH +

RNHCOCH

HSCoA

(3.58)

ходе

этой реакции почти наверняка образуется ацилтиофер-

мент, в котором ацилируется сульфгидрильная группа остатка

цистеина

117].

Во многих отношениях кинетика реакций, протекающих по

механизму типа пинг-понг, является наиболее информативной (в

отношении

механизма реакции), поскольку в этом случае мы

получаем данные об образовании промежуточного соединения с

ковалентными

связями. Тот факт, что реакция подчиняется ки-

нетике,

характерной для механизма типа пинг-понг, часто ис-

пользуется как доказательство образования подобного проме-

жуточного соединения, но, поскольку характерные семейства

параллельных прямых на графике двойных обратных координат

(рис.

3.6)

могут

дать и другие кинетические механизмы, к этому

утверждению всегда

следует

относиться с осторожностью.

Данные стационарной кинетики

могут

использоваться для

дифференциации

рассмотренных выше механизмов. При со-

ответствующих условиях они позволяют определить порядок

присоединения

субстратов и высвобождения продуктов. В связи

с этим используемый в стационарной кинетике термин

«меха-

низм» часто обозначает просто последовательность присоедине-

ния

субстратов и высвобождения продуктов.

СПИСОК

ЛИТЕРАТУРЫ

1. Michaelis L, Menten M. L, Biochem. Z., 49, 333 (1913).

Briggs

G. £.,

Haldane

J. B. S., Biochem. J., 19, 338 (1925).

Chance

В., J. biol. Chem., 151, 553 (1943).

Peller

Alberty

R. A., J. Am. chem. Soc, 81, 5907 (1959).

5. Lineweaver H., Burk £>., J. Am. chem. Soc, 56, 658 (1934).

Eadie

G. S., J. biol. Chem., 146, 85 (1942).

Hofstee

В. Н. J.,

Nature,

Lond., 184, 1296 (1959).

Dowd

J. E.,

Riggs

D. S., J. biol. Chem., 249, 863 (1965).

9. Atkins G. L, Nimmo I. A., Biochem. J., 149, 775 (1975).

10.

Haldane J. B. S., Enzymes, Longmans (1930).

11.

Fromm

H. J., Initial rate enzyme kinetics, Springer (1975).

12.

Wong J.

T.-F.,

Kinetcis of enzyme mechanisms, Academic Press (1975).

13.

Segel

I. H., Enzyme kinetics,

Wiley

(1975).

14.

Cornish-Bowden

A., Principles of enzyme kinetics,

Butterworths

(1976).

[Имеется

перевод: Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики.—

М.:

Мир,

1979.]

15.

Cleland

W. W., The Enzymes, 2, 1 (1970).

16.

Dalziel

K., The Enzymes, 10, 2 (1975).

17. Jencks W. P.,

Gresser

M.,

Valenzuela

M. S., Huneeus F. C, J. biol. Chem.

247,

3756

(1972).

Глава

ИЗМЕРЕНИЕ

КОНСТАНТ СКОРОСТИ

ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

ПОРЯДОК ИХ ВЕЛИЧИН

Часть 1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ:

КИНЕТИКА

ПЕРЕХОДНЫХ

ПРОЦЕССОВ

Кинетические

исследования ферментативных реакций, проте-

кающих в стационарных условиях, обычно позволяют опреде-

лить только два параметра: константу Михаэлиса Км, которая

может быть равна константе диссоциации фермент-субстратного

комплекса,

в одних случаях представляющую собой

микроскопическую константу скорости, а в

других

— комбина-

цию

констант скорости для нескольких стадий. В распоряжении

исследователя имеется ряд приемов, которые при

случае

можно

использовать для выявления промежуточных соединений и

даже

для измерения индивидуальных констант скорости, однако это

удается сделать далеко не всегда и зависит от механизма реак-

ции.

(Несколько примеров такого рода

будут

рассмотрены в

гл. 7.) Чтобы найти константы скорости отдельных стадий и

обнаружить «короткоживущие» промежуточные соединения,

необходимо измерить скорость приближения системы к стацио-

нарному состоянию. Индивидуальные константы скорости

могут

быть измерены за промежуток времени, в течение которого

устанавливается это состояние.

Поскольку

значения ftcat лежат в интервале 1—10

с-

, изме-

рения

следует

проводить за время от 1 до 10~

с. Для этого

требуется либо аппаратура для быстрого смешивания и после-

дующего

наблюдения за ферментом и субстратом, либо особые,

совершенно новые методы. Кроме того, поскольку наблюдаемые

события происходят на самом ферменте, этот фермент должен

присутствовать в количествах, сравнимых с количеством суб-

страта. Создание приборов для исследования быстрых реакциий и

разработка методов выделения больших количеств белка в чи-

стом виде произвели настоящую революцию в ферментативной

кинетике.

Ниже

мы рассмотрим два метода исследования быстрых ре-

акций.

Первый из них — метод

быстрого

смешивания

реагентов,

который

позволяет смешать два раствора за доли миллисекун-