Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ71

(2.37)

+Е—NH

+ CH

COCH

^- Е—N=C

В пользу образования такого промежуточного соединения

свидетельствует тот факт, что при добавлении к комплексу с

субстратом боргидрида натрия происходит необратимое ингиби-

рование фермента. Известно, что боргидрид восстанавливает

шиффовы

основания, а в гидролизате ингибированного белка

обнаружен изопропиллизин.

СН,

Е—Ш

+СНЗСОСН

СОГ

• Е—NH==C

-И£»

Е—NH

C—CH,

сн,

(2.38)

СНз

COJ

СНз—С—NH

(CH

)

Активация углеродного атома шиффова основания происхо-

дит в

результате

переноса гидрид-иона от боргидрида.

(2.39)

б.

Альдолаза

[40, 41]

Альдольная конденсация и обратная реакция расщепления,

катализируемые альдолазой, протекают с образованием шиф-

фова

основания. Механизм реакции расщепления аналогичен ме-

ханизму действия ацетоацетатдекарбоксилазы — в обоих случаях

ГЛАВА 2

отщепляется протонированный имин.

ходе

реакции конденса-

ции

выявляется

другая

функция шиффова основания

—

актива-

ция

углеродного атома через образование енамина.

сн

-он

н-йн-он

СН

-О-/?)

СН

-О-@

"C^NH

-E

Л\

но^/н

40)

н-с-он

0*0

но—с—н

N—E

н—с—он

Промежуточное соединение можно обнаружить

так,

как

ука-

зано выше.

2. Пиридоксальфосфат;

электрофильный катализ

[37, 42]

Рассмотренные выше реакции лежат

основе ряда важных

метаболических превращений, протекающих

участием кофер-

мента пиридоксальфосфата [схема (2.41)].

-О-Р_0-СН

(2.40

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

Пиридоксальфосфат конденсируется с аминокислотами, обра-

зуя шиффово основание [схема (2.42)],

(2.42)

В шиффовом основании пиридиновое кольцо оттягивает на себя

электроны, эффективно стабилизируя отрицательный заряд.

Любая из групп, окружающих хиральный атом

углерода

аминокислоты, может отщепиться, образуя анион, стабилизиру-

емый шиффовым основанием и пиридиновым кольцом.

а. Отщепление а-водородного атома

Отщепление а-водородного атома приводит к образованию

ключевого промежуточного соединения, которое в дальнейшем

может претерпевать различные превращения.

(2.43)

Рацемизация.

Последующее присоединение к аминокис-

лоте протона может привести к рацемизации, если это присое-

динение происходит нестереоспецифично.

Трансаминирование.

Присоединение протона к карбо-

нильному атому

углерода

пиридоксаля приводит к образованию

соединения, представляющего собой шиффово основание сс-кето-

кислоты и пиридоксамина. Гидролиз шиффова основания

дает

сс-кетокислоту и пиридоксамин, который может реагировать с

другой

а-кетокислотой в обратной последовательности.

ГЛАВА

(2.44)

Суммарная реакция имеет

вид

R'CH(NH*)CO

R"COCO

^=±

R'COCOJ

"CH(NH£)CC>2. (2.45)

$-Декарбоксилирование.

Если аминокислота

— это ас-

(2.46)

со?

Пиридоксаль+СН

—СН

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

партат,

то

второе соединение

на

схеме

(2.44)

представляет собой

аналог шиффова основания

реакции, катализируемой ацето-

ацетатдекарбоксилазой,

может легко декарбоксилироваться.

(См.

уравнение (2.46)).

Взаимопревращения боковых

цепей.

Если

RX —

легко

уходящая группа (тиоловая, гидроксильная

или

индольная),

ее

отщепление может происходить

по

следующей схеме:

RX-pCH,

СО

+Н

СО

<J ~\ / •

(2.47)

Таким образом протекают взаимопревращения

или

расщепле-

ние

серина, треонина, цистеина, триптофана, цистатионина,

также серинфосфата

треонинфосфата.

б.

а-Декарбоксилирование

Декарбоксилирование облегчается

при

наличии оттягиваю-

щей электроны группы:

(2.48)

Декарбоксилированный продукт присоединяет протон либо

углеродному

атому карбонильной группы аминокислоты

с по-

следующим гидролизом

образованием амина

пиридоксаля,

либо

углеродному

атому карбонильной группы пиридоксаля

76 ^ ^

ГЛАВА

с последующим гидролизом и образованием альдегида и пирид*

оксамина:

RCH,

но

RCH

ПирндоКССЦЬ

(2.49)

R H

ой

II -^

ЪСЯО

Пирфшлшн

(2.50)

3. Тиаминпирофосфат: электрофильный катализ

Тиаминпирофосфат [схема (2.51)]—еще один кофермент,

который образует с субстратом ковалентную связь и стабилизи-

рует

отрицательный заряд.

с—s

С=С—СН

СН

-О—Р—

О—Р—О" (2.51)

Положительный заряд на атоме азота облегчает ионизацию

атома С-2 с помощью электростатической стабилизации. Этот

ионизированный

атом углерода является мощным нуклеофилом.

\ // ^=^ Я // +Н

(2.52)

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

Атом

азота может быть стабилизирован и делокализацией

отрицательного заряда на продукте взаимодействия тиамина с

многими соединениями, например в оксиэтилтиаминфосфате

[уравнение (2.53)]—форме кофермента, довольно распро-

страненной in

vivo.

(2.53)

СНз

~ " ' " "

Сочетание этих реакций приводит к декарбоксилированию

пирувата по следующей схеме:

со

(2-54)

СНзСНО

Аналогичным образом расщепляются и

другие

углерод-угле-

родные связи, образуемые карбонильной группой.

Оксиэтилтиаминпирофосфаты — мощные нуклеофилы и мо-

гут присоединяться к карбонильным соединениям с образовани-

ем

углерод-углеродных

связей. Характерным примером реакций,

ходе

которых образуются и разрываются углерод-углеродные

связи,

являются реакции, катализируемые транскетолазой. Этот

фермент содержит прочно связанный тиаминпирофосфат

обратимо переносит диоксиэтильную группу от

D-ксилулозо-б-фосфата на D-рибозо-б-фосфат с образованием

ГЛАВА

О-седогептулозо-7-фосфата и D-глицеральдегид-З-фосфата

[уравнения (2.55) и (2.56)]:

НОСНа

НОСН

+| RCHO

<—cf

V — но-Lcf у — носн,

но-с-н

но-Ьсн

"9~Я и

\ I S—У

R ОН

ОН

(

-55)

ГО НОСНа

, НО СН

2 +

он

| (2.56)

0=0

-^NN

HO—G-H

Оксиэтилтиаминпирофосфат

является нуклеофилом и по от-

ношению

к тиольной группе восстановленной липоевой кислоты.

Образующийся полутиоацеталь разлагается с образованием

тиоэфира.

(2.57)

ХИМИЧЕСКИЙ

КАТАЛИЗ

4. Нуклеофильный катализ

нуклеофильным группам ферментов, которые чаще всего

участвуют

в катализе, относятся гидроксильная группа серина

(сериновые протеазы, холинэстеразы, эстеразы, липазы, кислая

щелочная фосфатазы) и тиоловая группа цистеина (глицер-

альдегид-3-фосфат—дегидрогеназа, тиоловые протеазы: папаин,

фицин

и бромелаин и т. д.). Имидазол гистидина обычно явля-

ется кислотно-основным катализатором, который увеличивает

нуклеофильность гидроксильных и тиоловых групп, но при пере-

носе фосфата в реакциях фосфорилирования он иногда

высту-

пает в роли нуклеофила.

Таблица

2.4

Нуклеофильные

группы

ферментов

Нуклеофил

—ОН

(серии)

ОН"

(связанная с ато-

мом цинка)

—SH (цистеин)

—COJ (аспартат)

—NH2

(ЛИЗИН)

Имидазол (гисти-

дин)

—ОН

(тирозин)

Фермент

Сериновые протеазы

Кислотные и щелочные фос-

фатазы, фосфоглюкомутаза

Карбоангидраза

Тиоловые протеазы, глицер-

альдегид-3-фосфат—дегидро-

геназа

Пепсин

АТРаза (K

/Na

, Ca

)

Ацетоацетатдекарбоксилаза,

альдолаза, пиридоксалиевые

ферменты

Фосфоглицеромутаза, сукци-

нил-СоА—синтетаза, нуклео-

зиддифосфокиназа, гистон-

фосфокиназа

Глутаматсинтетаза

Промежуточное

соединение

Ацилфермент

Фосфорилфермент

—

Ацилфермент

Фосфорилфермент

Шиффово

основание

Фосфорилфермент

Аденилфермент

Гидролиз пептидов этими протеазами — пример классиче-

ского нуклеофильного катализа. Относительно инертный пептид

превращается в значительно более реакционноспособный эфир

или тиоэфир (ацилфермент), который затем быстро гидролизу-

ется. Использование гидроксила серина вместо осуществления

прямой

атаки

субстрата

молекулой воды

дает

ряд преимуществ.

Спирты часто являются лучшими нуклеофилами, чем вода, как в

случае

общего основного катализа, так и при прямой нуклео-

фильной

атаке; реакция с остатком серина является внутримо-

лекулярной и, следовательно, энтропийно более выгодной; реа-

гирующие гидроксильные группы серина фиксированы более

жестко, чем в

случае

связанной молекулы воды.

ГЛАВА

Г.

Зависимость

реакционной

способности

реагентов

от их

структуры

Один из наиболее плодотворных подходов при исследовании

механизмов органических реакций состоит в сопоставлении из-

менения

реакционной способности реагентов с изменением их

структуры. Эти исследования дали ценную информацию об

электронной

структуре

переходных состояний и факторах, опре-

деляющих реакционную способность, и позволили установить,

чем является конкретная группа — хорошим нуклеофилом или

хорошей уходящей группой. При исследовании зависимости ре-

акционной

способности от структуры выявляют влияние измене-

ний

структуре

субстрата на его взаимодействие с ферментом, а

не

на изменения электронной структуры переходного состояния.

Из

подобных исследований обычно трудно получить информа-

цию

о требованиях, предъявляемых в ферментативной реакции к

электронной

структуре

субстрата, поскольку в

субстрат

могут

быть внесены лишь минимальные изменения, а индуктивные эф-

фекты,

обусловленные введением заместителей, часто замаски-

рованы эффектами, обусловленными связыванием. Однако по-

лученные данные оказались неоценимыми для выяснения

меха-

низмов

ферментативных реакций.

Нуклеофильная

атака карбонильной группы

Исследования

зависимости реакционной способности от

структуры позволили получить представление о распределении

заряда в переходном состоянии с помощью анализа влияния

оттягивающих и отдающих электроны заместителей на скорость

реакции.

Например, было установлено, что скорость нуклео

фильной

атаки эфиров возрастает а) при оттягивании электро-

нов

ацильным фрагментом эфира (CHCl2CO

Et значительно бо-

лее реакционноспособен, чем CH

CO2Et); б) при оттягивании

электронов

уходящей группой (n-нитрофенилацетат более реак-

ционноспособен,

чем фенилацетат); в) при увеличении основно-

сти нуклеофила, т. е. при передаче электронов на нуклеофил

(гидроксил-ион

более реакционноспособен, чем ацетат-ион). Ис-

пользуя положение теории переходного состояния, заключаю-

щееся в том, что скорость реакции зависит от разности энергий

переходного и основного состояний, мы можем сделать вывод,

что в данной реакции отрицательный заряд субстрата увеличи-

вается, поскольку скорость реакции возрастает при оттягивании

электронов,

а заряд нуклеофила уменьшается, поскольку ско-

рость реакции увеличивается при отдаче электронов (т. е. при

отталкивании электрона). При этом реакция может протекать