Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ

ДЕЙСТВИЯ

ОТДЕЛЬНЫХ

ФЕРМЕНТОВ

351

первой стадией которого является связывание кофермента, а

лимитирующей стадией — диссоциация комплекса фермент —

NADH

[10, 16, 17]. И теория переходного состояния, и данные

стационарной

кинетики показывают, что образующийся комп-

лекс фермент—NAD+ изомеризуется [17, 18]. Что касается

обратной реакции, то при восстановлении ароматических альде-

гидов лимитирующей стадией является стадия диссоциации

комплекса

между

ферментом и спиртом [17, 19],

тогда

как вос-

становление ацетальдегида лимитируется химической стадией

(перенос

гидрид-иона).

Комплексы

между

ферментом и продуктом для алкогольде-

гидрогеназы дрожжей диссоциируют довольно быстро, так что

лимитирующими являются стадии химического превращения

[20].

Это позволяет измерить кинетические изотопные эффекты

для указанных стадий с помощью стационарной кинетики.

Установлено, что окисление дейтерированных спиртов RCD

восстановление бензальдегидов дейтерированным NADH (т. е.

NADD)

протекают значительно медленнее соответствующих ре-

акций

с участием немеченых соединений

(&H/&D

= 3—5) [14,

20].

Это показывает, что перенос гидрид-иона (или дейтерид-

иона)

осуществляется в

ходе

лимитирующей стадии реакции.

Измерение

константы скорости переноса гидрид-иона в

случае

алкогольдегидрогеназы печени лошади с помощью предстацио-

нарной

кинетики выявило наличие аналогичных изотопных эф-

фектов

[21, 22].

Основной

момент, остающийся неясным для рассматривае-

мого механизма, касается координационного числа иона

состояния

ионизации его лигандов. Соответствующие данные

были получены при исследовании зависимости реакционной спо-

собности фермента от его структуры и рН-зависимости скорости

реакции.

Установлено, что k

t для реакции окисления спиртов

алкогольдегидрогеназой дрожжей и

для реакции восста-

новления

бензальдегидов алкогольдегидрогеназой печени слабо

зависят от способности реагирующих атомов принимать или

отдавать электроны [14, 15, 20, 23, 24]. Возможно, это обуслов-

лено тем, что перенос гидрид-иона осуществляется по механизму

общего кислотно-основного катализа (т. е. образующийся при

переносе гидрид-иона заряд нейтрализуется синхронным пере-

носом

протона от кислородного атома субстрата или на этот

атом).

Однако никакой боковой цепи, которая находилась бы

достаточно близко к

субстрату,

чтобы выполнять каталитиче-

скую функцию, не обнаружено. Было высказано предположение,

что карбонильная группа субстрата присоединяется не к самому

иону цинка, а к связанной с ним молекуле воды [25]. Хотя это

согласуется с предположением о наличии общего кислотно-основ-

ного катализа, в котором связанная с цинком вода играет роль

352

ГЛАВА

общей кислоты, а связанный с цинком гидроксил-ион — общего

основания,

геометрия указанного комплекса, по-видимому, про-

тиворечит данным рентгеноструктурного анализа [26]. Согласно

другой

гипотезе, связанная с цинком молекула воды выполняет

роль катализатора, а

субстрат

присоединяется координационной

связью непосредственно к атому цинка. При этом предполагает-

ся,

что связывание субстрата с цинком не приводит к вытесне-

нию

молекулы воды, а увеличивает координационное число цин-

ка

до пяти [уравнение

(12.4)]

[15].

/->А NAD-

NAD

Для выяснения состояния ионизации каталитической группы

была исследована рН-зависимость скорости ферментативной ре-

акции.

При окислении n-метилбензилового спирта, катализируе-

мом алькогольдегидрогеназой дрожжей, k

m возрастает при

увеличении рН и определяется состоянием ионизации осно'вной

формы

группы с р/Са = 8,25,

тогда

как при восстановлении

ацетальдегида параметр

kcat/Км.

возрастает при уменьшении

рН

и определяется состоянием ионизации кислой формы группы

с р/(

=8,25 [27]. Это не противоречит механизму (12.4), по-

скольку связанные с цинком молекулы воды в модельных со-

единениях ионизируются именно в этой области рН [28]. Значи-

тельно

труднее

интерпретировать рН-зависимость k

t для ре-

акций,

катализируемых нативной алкогольдегидрогеназой из

печени

лошади. Скорость восстановления альдегидов мало из-

меняется

в диапазоне рН от 6 до 10 [15], что можно рассматри-

вать как довод в пользу выполнения механизма

(12.3)

[29].

Если

имеет место механизм (12.4), то р/С

связанной с цинком

молекулы воды в тройном комплексе с NADH и альдегидом

должен быть относительно высоким, а рК

связанного с цинком

гидроксильного иона в тройном комплексе с NAD+ и альдеги-

дом— относительно низким [15]. Аналогичным образом, если

справедлив механизм (12.3), то связанный с цинком алкоголят-

ион

должен иметь необычно низкое значение р/(

Вопрос о том, обладают ли реакционной способностью все

активные центры молекулы алкогольдегидрогеназы или полови-

на

их, остается открытым. Хотя этот фермент связывает два

моля

NAD+ с одинаковым сродством, считается, что в катализе

участвует

только один активный центр.

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 353

2. L-лактатдегидрогеназа [4, 6, 32]

L-лактатдегидрогеназа катализирует обратимое окисление

L-лактата до пирувата с использованием в качестве кофермента

NAD+:

СНз СНз

-OH +

NAD

=f=fc

C=O +

NADH

+ H

(12.5)

I I

COJ СОГ

H—С—С

•>2

Этот фермент, выделенный из многих источников, представ-

ляет собой тетрамер с мол. весом 140 000. Он может существо*

вать в

двух

формах: Н

, преобладающей в сердечной мышце, и

, преобладающей в скелетной мышце [33, 34]. Эти формы

называются

изоферментами

— разными молекулярными форма-

ми

одного и того же фермента. Аминокислотный состав форм

М.4 и Н

существенно различается; кинетические свойства изо-

ферментов также неодинаковы. Несмотря на это, свойства цент-

ров ассоциации субъединиц весьма близки, поскольку вероят-

ность образования таких гибридных форм, как М

Н, М

Нг и МН

определяется чисто статистическими факторами [35]. В

ходе

каталитической реакции субъединицы

никак

не взаимодейству-

ют

между

собой, так что кинетические свойства, например,

формы

М и смеси форм Н

и М

в соотношении 3 : 1 идентичны.

Кристаллическая

структура

апофермента, выделенного из аку-

лы,

была установлена с разрешением 2,0 А, а его комплекса с

аддуктом NAD—пируват — с разрешением 2,8 А [36]. Молеку-

ла фермента симметрична, а субъединицы структурно эквива-

лентны.

а.

Структура

фермент-субстратного

комплекса

Структура тройных комплексов была определена из кри-

сталлографических исследований [37] связывания

аддукта

NAD—пируват, который можно рассматривать как аналог свя-

занных ковалентной связью пирувата и NADH [38]:

со;

354

ГЛАВА

Скорее всего активные тройные комплексы имеют следую-

щую конформацию:

(12.7)

Карбоксильная

группа субстрата образует ионную связь с боко-

вой

цепью

Arg-171.

Гидроксильная группа лактата связана во-

дородной связью с непротонированным имидазольным кольцом

His-195, в то время как карбонильная группа пирувата образует

водородную связь с протонированным имидазолом. His-195 не

только

участвует

в ориентации субстрата, но и действует как

кислотно-основный

катализатор, стабилизируя отрицательный

заряд, который образуется на кислородном атоме пирувата в

ходе

реакции, и способствуя отщеплению протона от лактата

при

окислении.

Аддукт

NAD—пируват образуется из NAD+ и

енольной

формы

пирувата в присутствии фермента [39]' (в обычной реак-

ции

субстратом является /сего-таутомер [40]). Предполагается,

См. также Сугробова Н. П., Курганов Б. И., Яковлев В. А., Молек.

биология

716—722

(1974); Burgner J. W.,

Ainslie

G. R., Jr., Cleland W. W.,

Ray W. J., Jr., Biochemistry 17,

1646—1653

(1978); Burgner J. W., Ray W. J,

Jr., Biochemistry 17,

1654—1661

(1978); Wilton D. C, Biochem. J. 177, 951—-

957 (1979). —

Прим.

ред.

СТРУКТУРА

МЕХАНИЗМ

ДЕЙСТВИЯ

ОТДЕЛЬНЫХ

ФЕРМЕНТОВ

355

что как и при окислении лактата, в роли катализатора в этой

реакции

выступает His-195:

(HiS-195)

(12.8)

б. Кинетический механизм [6, 41]

Лактатдегидрогеназа связывает лактат или пируват только в

присутствии кофермента [42]. Следовательно, имеет место упо-

рядоченный

механизм, причем первым связывается кофермент.

Об этом же

свидетельствуют

кристаллографические данные:

присоединение

кофермента индуцирует конформационное изме-

нение,

при котором аминокислотные остатки в цепи от 98 до

114 перемещаются на относительно большое расстояние, при-

ближаясь к активному центру в тройном комплексе [36, 37].

Применение

методов исследования быстрых реакций показыва-

ет, что этот механизм несколько отличается от механизма дей-

ствия алкогольдегидрогеназы из печени лошади, но лимитирую-

щей

стадией в обоих

случаях

является диссоциация комплекса

E.NADH

[41, 43]. В

случае

алкогольдегидрогеназы скорость

высвобождения альдегида из тройного комплекса

E.RCHO.NAD

выше скорости переноса гидрид-иона, так что эти

два тройных комплекса никогда не находятся в равновесии.

Однако в реакциях, катализируемых лактатдегидрогеназой, пе-

ренос гидрид-иона происходит очень быстро, а пируват высво-

бождается медленно, и тройные комплексы находятся в равно-

весии.

При нейтральных рН равновесие сдвинуто в сторону

образования

лактата и

NAD+.

При смешивании лактата с голо-

ферментом при рН 7 в течение первой миллисекунды 20% свя-

занного

NAD+ восстанавливается до NADH в соответствии с

положением быстро устанавливающегося равновесия

между

E.NAD+.Лактат

и E.NADH.Пируват. По мере высвобождения

пирувата равновесие смещается в сторону образования продук-

тов, так что восстанавливаются все четыре связанные молекулы

NAD+.

Затем происходит более медленное отщепление NADH,

366

ГЛАВА

являющееся лимитирующей стадией

стационарном состоянии:

Быстро

Медленно

E.NAD+.Лактат

-» E.NADH.Пируват ->- >

Пируват

Самая

медленная стадия

-^> E.NADH

^ * Е.

(12.9)

NADH

Такое поведение можно

по

ошибке объяснить

тем, что

реакци*

онной

способностью обладает половина активных центров

в мо-

лекуле, однако

все

четыре центра, по-видимому, являются неза-

висимыми

[6, 41, 43].

Связывание коферментов также происхо*

дит независимо

каждым центром.

Играющий

большую роль

катализе остаток

His-195

обла-

дает

необычной реакционной способностью

отношении диэтил-

пирокарбоната.

Это

дает

возможность определить

р/С

(=6,7)

как

апо-, так и

голофермента непосредственно

из

рН-зависимо-

сти скорости модификации

[44].

Имеются данные

о том, что

лактат предпочтительно связывается

голоферментом, несущим

неионизированный

гистидин,

тогда

как

пируват

— с

комплексом

E.NADH,

гистидин которого протонирован.

3. Малатдегидрогеназа

[7]

Малатдегидрогеназа катализирует обратимое окисление

ма-

лата

до

оксалоацетата

использованием

качестве кофермента

NAD+:

СО

COJ

Н—С—OH

NAD

ч=±

C=O

NADH

(12.10)

COJ

СН

СО

Кристаллическая

структура

растворимого (цитоплазматическо-

го) фермента установлена

разрешением

2,5 А [45].

Карта

электронной

плотности

еще не

соотнесена

аминокислотной

последовательностью,

но, как

указывалось

в гл. 1,

укладка

по-

липептидной

цепи фермента

принципе аналогична укладке

цепи

лактатдегидрогеназы, хотя малатдегидрогеназа является

всего лишь димером

с мол.

весом

70 000.

Вероятно, механизм

действия обоих ферментов одинаков, поскольку малатдегидро-

геназа также содержит важный

для

катализа остаток гистиди-

на,

который может модифицироваться диэтилпирокарбонатом

[46].

Два

моля NADH

(или

NAD+)

связываются

одинаковым

сродством

[47].

Кажущаяся отрицательная кооперативность

при

связывании

кофермента, обнаруженная

для

одного

из

препара-

тов фермента, может быть обусловлена

тем, что на

самом

деле

препарате присутствовали

две

формы

[48, 49].

СТРУКТУРА

МЕХАНИЗМ

ДЕЙСТВИЯ

ОТДЕЛЬНЫХ

ФЕРМЕНТОВ 357

Глицеральдегид-3-фосфат—дегидрогеназа

[50]

Глицеральдегид-3-фосфат—дегидрогеназа, тетрамерный фер-

мент с мол. весом 150 000, состоит из четырех идентичных цепей;

он

катализирует обратимое окислительное фосфорилирование

глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата с использо*

ванием

в качестве кофермента

NAD+:

Н—С—ОН

NAD

НРОГ

^=fc

Н—С—OH

NADH

+ H* (12.11)

CHjOPOf CHjOPOf

Эта реакция протекает через несколько стадий. Адекватность

механизма окислительного фосфорилирования [реакции

(12.12)

—(12.16)], предложенного в 1953 г. [51], подтвержда-

ется всесторонними исследованиями с привлечением данных

предстационарной [52] и стационарной [53] кинетики;

ОН

NAD

.E—

+ RCHO

*=*=

NAD

.E—S—C—R

(12.12)

NAD

.E—S—C—R

*=±

NADH.E—S—С

+ Н

(12.13)

NADH.E—

S—C"^

=<=-

E—

S—o/ +

NADH

(12 14)

E—

S—QT

+NAD

^=fc

NAD

.E—S—C*^

(12.15)

/ОРОГ

NAD+.E—

S—С

+НРОГ

ч=±

NAD

.E—SH

+ RC (12.16)

В ферменте имеется реакционноспособныи остаток цистеина,

который легко ацилируется ацилфосфатами с образованием тио-

эфира

[обратное направление реакции

(12.16)]

[54]. Первая ста-

дия

в приведенной последовательности реакций состоит в обра-

зовании

полутиоацеталя

между

цистеином и субстратом. На

этой

стадии происходит превращение карбонильной группы,

трудно поддающейся прямому окислению, в спиртовую группу,

легко дегидрирующуюся обычным путем [реакция (12.13)].

358

ГЛАВА

Образовавшийся в

ходе

реакции

(12.13)

тиоэфир взаимодей-

ствует

с ортофосфатом, давая ацилфосфат (12.16). Однако

перенос ацильной группы происходит очень медленно до тех пор,

пока

NAD+ не присоединится к ферменту [55, 56]. Поэтому

обязательным этапом в последовательности приведенных выше

реакций

является замещение NADH на NAD+ в

ходе

реакций

(12.14)

и (12.15). Интересно, что диссоциация комплекса ацил-

фермента с NADH

(12.14)

при насыщающих концентрациях

реагента и высоком рН является лимитирующей стадией данной

последовательности реакций [55]. Следствием замещения

NADH

на NAD+ до высвобождения ацилфосфата является то,

что свободный апофермент не принимает участие в реакции.

Кроме

того, поскольку ацилирование фермента дифосфатом ак-

тивируется

NAD+,

голофермент инициирует восстановительное

дефосфорилирование 1,3-дифосфоглицерата.

Комплексы

Михаэлиса голофермента с альдегидом или ди-

фосфоглицератом и ацилфермента с ортофосфатом в эту

схему

не

включены, поскольку их константы диссоциации слишком

высоки,

чтобы могло происходить накопление комплексов.

а.

Структура

фермент-субстратных

комплексов

Кристаллическая

структура

голоферментов, выделенных из

омара [57] и

Bacillus

sterothermophilus

[58], была установлена

с разрешением 2,9 и 2,7 А соответственно, а

структура

голофер-

мента человека [59] и бактериального апофермента [58] — с

низким

разрешением. Структура фермент-субстратных комплек-

сов определена с помощью построения моделей для фермента,

выделенного из омара, и бактериального фермента [57, 58].

Далее мы

всюду

будем

рассматривать данные, касающиеся

только бактериального фермента.

В активном центре бактериального фермента, полученного в

кристаллической форме из раствора сульфата аммония, выявле-

ны

два центра связывания сульфат-ионов (рис. 12.1) [60]. Ра-

зумную с точки зрения химии и стереохимии

схему

реакции

можно построить, предположив, что один из этих

двух

центров

представляет собой центр связывания фосфатного остатка суб-

страта, а

другой

— центр связывания фосфатного остатка, при-

нимающего участие в реакции деацилирования (12.16). Когда

3-фосфат образует водородные связи с гидроксильной группой

Thr-179, положительно заряженной боковой цепью

Arg-231

2'-гидроксильной группой рибозного кольца, присоединенного к

никотинамиду

NAD+,

альдегидная группа субстрата может об-

разовывать с остатком

Cys-149

полутиоацеталь (рис.

12.1).

За-

тем гидроксильная группа субстрата в положении С-2 может

образовать водородную связь с Ser-148, а гидроксильная группа

СТРУКТУРА

МЕХАНИЗМ

ДЕЙСТВИЯ

ОТДЕЛЬНЫХ

ФЕРМЕНТОВ

359

положении С-1 —с атомом азота остатка His-176. В результа-

те субстрат

будет

расположен таким образом, что атом водоро-

да, присоединенный к атому С-1, окажется на расстоянии менее

3 А от атома С-4 никотинамидного кольца. При таком способе

связывания

реакция дегидрирования может протекать так, как

это

было описано выше (окисление лактатдегидрогеназы), с

His-176 в качестве общего основного катализатора (12.17).

AHis-nS)

(12.17)

(ClfS-149)—S

Н—С—О—Н

о •

Переходное состояние при атаке тиоэфира ортофосфатом

может стабилизироваться за счет образования водородных свя-

зей

между атакующим фосфатом и гидроксильными группами

остатков Ser-148, Thr-150 и гидроксилом при С-2-атоме субстра-

та, а также между атомами азота амидных групп

Cys-149

Thr-150. Наличие специфического центра связывания фосфата

объясняет тот факт, что тиозфир фосфорилируется быстрее,

нежели гидролизуется.

Атом

серы полуацеталя находится до-

статочно близко к С-атому никотинамидного кольца

NAD+,

что-

бы поляризоваться под действием его положительного заряда.

Возможно, с этим связана активация реакции переноса ацила

при

связывании

NAD+.

б.

Характер

симметрии

фермента

кооперативность

при

связывании

лигандов

Единого мнения о характере симметрии дегидрогеназы, ко-

оперативное™ при связывании лигандов, а также о том, обла-

дают ли реакционной способностью все активные центры или

половина

их, не существует [61—68]. Связывание NAD+ с фер-

ментом является четко выраженным кооперативным процес-

сом;

при связывании NAD+ с ферментом из мышц кролика и

бактериальным ферментом обнаруживается сильная отрицатель-

ная

кооперативность [61, 65], хотя при некоторых температурах

360

ГЛАВА

присоединение

NAD+ к дегидрогеиазе дрожжей характеризует-

ся

положительной кооперативностью [69]. С

другой

стороны,

присоединение

глицеральдегид-3-фосфата ко всем четырем

субъединицам происходит независимо [68]. Наличие реакцион-

ной

способности у половины активных центров установлено

только в

случае

искусственных субстратов; например,

1,3-ди-

фосфоглицерат ацилирует все четыре реакционноспособных

остатка цистеина с одной и той же константой скорости [55, 63,

65, 68]. На основании данных ряда кинетических работ и ре-

зультатов исследования связывания было высказано предполо-

жение,

что эта дегидрогеназа

существует

в виде «димера диме-

ров», состоящего из

двух

пар структурно различающихся

субъединиц [67, 70]. Анализ карты электронной плотности кри-

сталлического голофермента из омара, полученной при высоком

разрешении,

подтверждает эту точку зрения [57], однако более

поздние исследования бактериального фермента четко показы-

вают, что все четыре субъединицы структурно идентичны и дан-

ный

фермент имеет симметрию 222 [58]. Бактериальный апо-

фермент обладает такой же симметрией, хотя исследования

проводились только при низком разрешении [58]. Сравнитель-

ный

анализ свойств бактериальных апо- и голоферментов пока-

зывает, что связывание NAD+ вызывает существенное смещение

домена, на котором связывается кофермент, и это приводит к

уменьшению объема молекулы. Структурные предпосылки отри-

цательной кооперативности пока не выявлены.

5. Общие замечания относительно дегидрогеназ

Структурные исследования позволили дать ясное и вполне

разумное с химической точки зрения описание стереохимических

каталитических условий протекания реакции переноса гидрид-

иона.

трех

из рассмотренных примеров присутствует кислотно-

основный

катализатор, который образует водородную связь с

карбонильной

или спиртовой группой субстрата, способствует

его правильной ориентации и стабилизирует переходное состоя-

ние

[схема (12.18)].

NAD

NAD'

•+—н''Т

(12.18)

ПС

NADH