Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

ТЕОРИИ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА 321

остается постоянной. Указания на присоединение AlaNH

или

GlyNH

к ферменту в

ходе

обратной реакции (атака уходящей

аминогруппой AcPhe-химотрипсина)

отсутствуют,

поскольку ки-

нетики

с насыщением не наблюдается. Эти группы реагируют

значительно быстрее аммиака (для NH

cai

/K.M = 8 М-

с~', а

для

GlyNH

и AlaNH

эта величина равна

2000

М~' с~' и

6000

М-'с"

соответственно) [32]. Энергия связывания остатков

аланина и глицина используется для уменьшения энергии акти-

вации стадии химического превращения. Это не связано с эф-

фектом индуцированного соответствия, поскольку

структура

кристаллического трипсина идентична

структуре

трипсина (и

ангидротрипсина, если не принимать в расчет отсутствия в нем

гидроксильной группы у

Ser-195)

в кристаллическом комплексе

с панкреатическим ингибитором трипсина (разрешение 1,4—

1,5 А).

Связывание субстрата также, по-видимому, не сопровожда-

ется его деформацией. Рентгеноструктурные исследования ком-

плекса трипсина и ингибитора осложняются деформацией инги-

битора в отсутствие фермента [33], однако исследования мето-

дом ЯМР присоединения небольших субстратов к химотрипсину

указывают на отсутствие деформации этих субстратов [34].

Использование энергии связывания уходящей группы, по-

видимому, может рассматриваться как пример стабилизации

переходного состояния. При связывании происходит лишь

небольшая деформация фермента или субстрата (возможно, эта

деформация и вообще отсутствует), однако уходящая группа не

вполне соответствует своему центру связывания до тех пор,"

пока

не образуется переходное состояние.

Специфическая

сольватация

переходного

состояния

—

роль

полипептидного

остова. Рентгеноструктурный анализ по-

зволил установить очень интересную особенность сериновых

протеаз: NH-группы белка

служат

сольватной оболочкой для

переходного состояния реакции. Это приводит к фундаменталь-

ному различию

между

простыми химическими реакциями в рас-

творе и реакциями, катализируемыми ферментами. Единствен-

ный

тип ориентации, который необходимо рассматривать для

реакций в растворе,— это взаимная ориентация реагентов, по-

скольку растворитель создает сольватную оболочку вокруг лю-

бого образующегося заряда. Для ферментативной же реакции

характерны определенные стереохимические отношения

между

реагирующими группами и группами, создающими сольватную

оболочку и являющимися частью этой же молекулы фермента

(рис.

10.11).

Очень важную роль при деформации и, следова-

тельно, в обеспечении специфичности играют водородные связи,

поскольку их энергия сильно зависит от расстояния (гл. 9).

Особая роль в этих процессах принадлежит полипептидному

322

ГЛАВА

остову,— жесткое расположение групп

делает

возможным уско-

рение

катализа за счет напряжения в

результате

ослабления

водородных связей с субстратом и образования более прочных

связей

с переходным состоянием. Высказывалось предположе-

ние,

что в

случае

химотрипсина и трипсина карбонильный кис-

лород подвергающейся химическому превращению амидной или

эфирной

группы субстрата, располагаясь

между

NH-группами

Ser-195

и Gly-193 полипептидного остова, образует прочную

водородную связь с

Ser-195

(гл. 1, а также гл. 12, разд. Б.1).

Рис.

10.11. Геометрические ограничения при ферментативном катализе, воз-

никающие

вследствие того, что катализатор (К) и сольватирующие группы

(NH)

являются составной частью фермента. Зачерненные конусы показывают

допустимые

углы

орбитального перекрывания при образовании водородных

связей;

d — межатомное расстояние.

Слева:

взаимодействие

между

молекулой

катализатора К и субстратом приводит к образованию отрицательного за-

ряда, вокруг которого образуется сольватная оболочка из молекул воды.

Справа:

расстояние

между

катализатором и донорами водородных связей

фиксировано

в связи с тем, что они являются частью фермента [2].

Связь

с Gly-193 слабая, однако по мере увеличения длины

двойной

связи

между

атомами

углерода

и кислорода в

ходе

реакции

и превращения ее в одинарную связь

между

атомом

кислорода и Gly-193 становится достаточно прочной [32]. По-

строение моделей для субтилизина приводит к аналогичному,

хотя и отличающемуся в деталях механизму [35]. Изначально

карбонильный

кислород не располагается

между

двумя

NH-группами

в фермент-субстратном комплексе, а занимает это

положение по мере образования тетраэдрического промежуточ-

ного соединения. Предполагается также, что водородная связь

между

N-ациламиногруппой субстрата и

Ser-214

образуется

только в тетраэдрическом промежуточном соединении.

Стоит отметить, что специфичность образования водородных

связей

между

ферментом и субстратом определяется в значи-

тельной степени

длиной

связи, а не взаимным расположением

участвующих

в ее образовании атомов, поскольку, как говори-

лось в предыдущей главе, энергия водородной связи сильно

ТЕОРИИ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА 323

зависит от расстояния, но очень слабо изменяется при отклоне-

нии

от линейного расположения атомов [2].

Механизм действия сериновых протеаз очень хорошо иллю-

стрирует смысл концепции стабилизации переходного состояния.

Примеры

реализации механизмов деформации и индуцирован-

ного соответствия обсуждаются в гл. 12 (последний механизм

рассмотрен на примере функционирования карбоксипептидазы,

папаина

и глюкозо-6-фосфат—изомеразы, а напряжение — на

примере папаина).

6. Природа напряжения. Напряжение

или

деформация?

Хотя в некоторых случаях напряжение представляет собой

истинную деформацию субстрата, зачастую оно вообще не со-

провождается искажением структуры последнего. Такая ситуа-

ция

возникает либо в том случае, когда

между

субстратом и

ферментом имеются неблагоприятные взаимодействия, устраня-

ющиеся в переходном состоянии, либо когда при образовании

переходного состояния возникает дополнительное взаимодей-

ствие, не реализующееся в фермент-субстратном комплексе.

В обоих случаях

существуют

силы, изменяющие

структуру

суб-

страта, с тем чтобы приблизить ее к

структуре

переходного

состояния.

Поскольку нековалентные взаимодействия довольно

слабые (за исключением вандерваальсовых сил отталкивания),

а ферменты и субстраты — достаточно гибкие молекулы, трудно

ожидать, что взаимодействие фермента с субстратом приведет к

деформации последнего. Может иметь место лишь поворот групп

субстрата относительно простых связей (как, например, при

конформационных

изменениях субстратов лизоцима), растяже-

ние

же этих связей или их деформация вряд ли возможны,

поскольку это

требует

больших энергетических затрат. Энергии

связывания

вполне достаточно для деформации субстрата, од-

нако

для использования этой энергии необходимо, чтобы ее

значение

существенно изменялось на очень коротком расстоя-

нии,

т. е. чтобы образовалась сильная связь. На основании

энергетических расчетов Левитт пришел к следующему выводу:

«Небольшие изменения конформации субстрата, приводящие к

существенным изменениям энергии напряжения, не

могут

быть

вызваны связыванием с ферментом» [8, 36]. Кроме того, он

предположил, что самые большие по величине силы, которые

принимают участие в деформации субстрата, не превышают

12кДж- (моль-А)-

[3 ккал- (моль-А)-'], что приводит к смеще-

нию

атомов на 1 А. Деформация может иметь место лишь в пре-

дельных

случаях,

и обычно напряжение определяется тонко

324

ГЛАВА

сбалансированным соотношением

между

выгодными и невыгод-

ными

взаимодействиями. Более вероятно, что деформируется не

субстрат,

а фермент, поскольку ферменты имеют менее жесткую

структуру.

Действительно, в данной главе приведено множество

примеров деформации фермента при связывании субстрата.

Возможно, некоторые из этих деформаций представляют собой

неблагоприятное следствие гибкости белков и невозможности

сформировать активный центр, в точности комплементарный

данному

субстрату.

Легкая доступность активного центра может

быть обеспечена низким значением энергии конформационного

перехода, при котором определенная часть активного центра

сближается с субстратом (как в

случае

пептидов и карбоксил-

пептидазы, а также NAD

и дегидрогеназ, гл. 12).

В физике и технике термин «деформация» (strain) имеет

вполне определенный смысл. Подразумевается, что

структура

объекта физически искажена. Другой, близкий термин «напря-

жение»

(stress)

означает, что объект находится в напряженном

состоянии,

но не разрушен. Используя эти точные физические

термины, можно сказать, что в фермент-субстратном комплексе

фермент, как правило, деформирован,

тогда

как

субстрат

нахо-

дится в состоянии напряжения.

Деформация и напряжение в ферментах

могут

вызываться

различными причинами. Как мы видели в данной главе и увидим

ниже (гл. 12), деформация и напряжение включают два про-

цесса: дестабилизацию субстрата и стабилизацию переходного

состояния.

Дестабилизация субстрата может сопровождаться

пространственной деформацией, когда

между

ферментом и суб-

стратом возникают неблагоприятные взаимодействия (пролин-

рацемаза, лизоцим), десольватацией фермента (удаление

двух

молекул воды от карбоксильной группы

Asp-52

в лизоциме),

десольватацией субстрата (например, пептида, теряющего ка-

кое-то количество молекул связанной воды). Стабилизация пе-

реходного состояния сопровождается возникновением таких ти-

пов связывания, которые

отсутствуют

случае

субстрата

(сериновые протеазы, цитидиндезаминазы), ослаблением про-

странственной деформации, повторной сольватацией фермента

или субстрата (или образованием электростатических связей) в

переходном состоянии.

7. Деформация —индуцированное соответствие —

непродуктивное связывание

Деформация вносит положительный вклад в катализ при

условии комплементарности фермента переходному состоянию

субстрата, увеличивая

и Км, что приводит к увеличению

ТЕОРИИ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА 325

скорости реакции. Индуцированное соответствие уменьшает эф-

фективность катализа, увеличивая Км без соответствующего

увеличения k

t по сравнению с ферментом, находящимся в

активной форме в отсутствие субстрата. Механизм непродук-

тивного связывания не затрагивает каталитического превраще-

ния

специфических субстратов, однако он приводит к появлению

дополнительных связывающих центров для конкурирующих

между

собой неспецифических субстратов. Эффективность ката-

лиза при этом может уменьшаться, если связывание неспецифи-

ческих субстратов препятствует присоединению к ферменту спе-

цифических субстратов. Поскольку ни один из указанных

меха-

низмов не обеспечивает никакой дополнительной специфичности,

для нерегуляторных ферментов наиболее важной из этих

трех

процессов должна быть деформация. Непродуктивное связыва-

ние

вообще может оказаться артефактом, свойственным лишь

системам in vitro, и не иметь никакого биологического значения

[2].

Приложение:

проблема накопления

промежуточных соединений [2]

Как

отмечалось в гл. 7, выявление промежуточных соедине-

ний

ферментативных реакций потребовало больших усилий. Бы-

ло установлено, что в физиологических условиях в

ходе

реакций

с участием многих наиболее распространенных гидролитических

ферментов и природных субстратов эти соединения не накапли-

ваются (табл. 10.5), в связи с чем механизм действия пепсина и

карбоксипептидазы до сих пор не удалось установить.

Накопление

промежуточных соединений при исследовании

механизма действия фермента часто наблюдают в тех

случаях,

когда используют синтетические субстраты, обладающие высо-

кой

реакционной способностью (например, эфиры при изучении

химотрипсина), или когда работают при необычных рН (напри-

мер, в кислой среде при исследовании щелочной фосфатазы).

Все это обусловлено причинами принципиального характера.

Естественное следствие принципа максимизации скорости путем

увеличения как

так и Км состоит в том, что накопление

промежуточных соединений уменьшает скорость реакции.Любое

накапливающееся промежуточное соединение уменьшает Км ре-

акции,

приводя к насыщению при более низких концентрациях

субстрата. Посмотрим на эту проблему с

другой

стороны. Если

промежуточное соединение накапливается, то это означает, что

константа скорости его исчезновения меньше константы скоро-

сти образования. Следовательно, скорость реакции ниже, чем

326

ГЛАВА

Таблица 10.5

Ферменты

и промежуточные соединения

Фермент

(класс)

Химотрипсин

(Сериновые протеазы)

Пепсин

(Кислые

протеазы)

Карбоксипептидаза

Папаин

(Тиоловые протеазы)

Эстераза

печени свиньи

(Эстеразы печени)

Ацетилхолинэстераза

(Холиновые эстеразы)

Кислая

фосфатаза

Лизоцим

(Гликозидазы)

Субстрат

Пептиды

Амиды

Алифатические

эфиры

Ацетилхолин

Фосфорные

моноэфиры

Полисахариды

Промежуточное

соединение

Ацилфермент

(?)

Аминофермент

(?)

Ацилфермент

Фосфорилфермент

Карбоний-ион

(эфир)

Накоп-

ление

—

б)

' Указано, происходит

(+)

или не

происходит

(—)

накопление фермент-содержащих

промежуточных соединении

случае

физиологических субстратов

при

насыщающих

кон-

центрациях субстратов.

Следует

отметить,

что

если физиологическая концентрация

суб-

страта ниже соответствующего значения

, то

промежуточное соединение

не

накапли-

вается

даже

при

насыщающих концентрациях.

б) Промежуточное соединение накапливается

случае

синтетической уходящей

группы (rt-нитрофенол)

реакции

участием глюкозидазы.

она

могла

бы

быть, если

бы

образование промежуточного соеди-

нения

было лимитирующей стадией.

Проблема накопления промежуточного соединения—наибо-

лее сложная проблема ферментативного катализа, поскольку

ферменты (например,

те из

них,

которые

участвуют

пищеваре-

нии)

должны «справляться»

периодически появляющимися

большими количествами субстратов. Если физиологическая

кон-

центрация

субстрата ниже

Км для

этой реакции,

то

промежу-

точное соединение

vivo

не

накапливается, поскольку фермент

находится преимущественно

несвязанном состоянии. Однако

условиях эксперимента, когда можно использовать высокие

концентрации

субстрата, промежуточное соединение иногда

удается накопить. Примером такого рода служит реакция

уча-

стием глицеральдегид-3-фосфат—дегидрогеназы.

Из

табл.

10.4

видно,

что

концентрация альдегида

vivo

ниже

Км.-

Однако

лабораторных условиях ацилфермент может накапли-

ваться, если используются насыщающие концентрации субстра-

та.

ТЕОРИИ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА 327

СПИСОК

ЛИТЕРАТУРЫ

1. Haldane J. В. S., Enzymes Longmans,

Green

and Co., p. 182 (1930).

Fersht

A. R.,

Proc.

R. Soc, B187, 397 (1974).

Fischer £., Ber. dt. Chem. Ges., 27, 2985 (1894).

Pauling L., Chem. Engng. News, 24, 1375 (1946), Am. Scient., 36, 51 (1948).

Wolfenden R., Accts. Chem. Res., 5, 10 (1972).

6. Leinhard G. E., Science, N. Y., 180, 149 (1973).

7. Secemski I. I., Lienhard G. E., J. biol. Chem., 249, 2932 (1974).

8. Levitt M. In: Peptides, polypeptides and proteins (ed. Blout E. R., Bo-

vey F. A., Goodman M., Lotan N.), John Wiley and Sons Inc., p. 99 (1974).

9. Leaback D. H., Biochem. biophys. Res. Coram, 32, 1025 (1968).

10.

Cardinale G. J., Abeles R. H., Biochemistry, 7, 3970 (1968).

11.

Keenan M. V., Alworth W. L., Biochem. biophys. Res. Comm., 57, 500

(1974).

12.

Cohen R. M., Wolfenden R., J. biol. Chem., 246, 7561 (1971).

13.

Fastrez /., Fersht A. R., Biochemistry, 12, 1067 (1973).

14.

Collins K. D., Stark G. R., J. biol. Chem., 246, 6599 (1971).

15.

Schlessinger /., Levitzki A., J. molec. Biol., 82, 547 (1974).

16.

Mannherz H. G., Schenck H., Goody R. S., Eur. J. Biochem., 48, 287 (1974).

17.

Kernohan J. C, Forrest W. W., Roughton F. J. W., Biochim. biophys. Acta,

67,

31 (1963).

18.

Albery W. J., Knowles J. R., Biochemistry, 15, 5627, 5631 (1976).

19.

Henderson R. H., J. molec. Biol., 54, 341 (1970).

20.

Thompson R. C, Biochemistry, 13, 5495 (1974).

21 Citri N., Adv. Enzymol., 37, 397 (1973).

22 Blake С. С. F., Johnson L. N., Mair G. A., North А. С. Т., Phillips D. C,

Sarma

V. R.,

Proc.

R. Soc, B167, 378 (1967).

23.

Warshel A., Levitt M., J.

molec.

Biol., 103, 227 (1976).

24.

Anderson W. F., Steitz T. A., J.

molec.

Biol., 92, 279 (1975).

25.

Colowick

S. P., The Enzymes, 9, 1 (1973).

26.

DelaFuente G., Lagunas R., Sols A., Eur. J. Biochem., 16, 226 (1970).

27.

DelaFuente G., Sols A., Eur. J. Biochem., 16, 234 (1970).

28.

Riihlmann A., Kukla D., Schwager P., Bartels K., Huber R., J.

molec.

Biol.,

77,

417 (1974).

29.

Huber R., Kukla D., Bode W., Schwager P., Bartels K-, Deisenhofer J.,

Steigemann W., J.

molec.

Biol., 89, 73 (1974).

30.

Sweet R. M., Wright H. Т., Janin J., Chothia С H., Blow D. M., Bioche-

mistry,

13, 4212 (1974).

31.

Bode W., Schwager P., Huber R., In:

Federation

European

Biochemical

Societies

Tenth

Meeting (ed. Desnuelle P.),

North

Holland/American Else-

vier, 40, 3 (1975).

32.

Fersht

A. R., Blow D. M., Fastrez J., Biochemistry, 12, 2035 (1973).

33.

Deisenhofer J., Steigemann W., Acta Cryst., B31, 238 (1975).

34.

Robillard G., Shaw £., Shulman R. G., Proc. natn. Acad. Sci., U. S. A., 71,

2623 (1974).

35.

Robertus J. D., Kraut J., Alden R. A., Birktoft J. J., Biochemistry, 11, 4293

(1972).

36.

Levitt M., Thesis Ph. D., University of Cambridge, p 270 (1972).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ

ЛИТЕРАТУРА

Jencks W. P., Adv. Enzymol., 43, 219 (1975).

Глава

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИОННАЯ

СПОСОБНОСТЬ

Специфичность — чрезвычайно многозначный и зачастую

неверно интерпретируемый термин. В энзимологии под ним

обычно понимают способность фермента узнавать определенный

субстрат

из нескольких конкурирующих за активный центр этого

фермента субстратов. Именно в этом смысле, например, говорят

о специфичности конкретной аминоацил-тРНК,—синтетазы по от-

ношению к конкретной аминокислоте и конкретной

тРНК.

Таков

смысл понятия «специфичность» в применении к биологическим

системам. При этом рассматривается ситуация, в которой за

фермент конкурируют два субстрата, и ставится задача опреде-

ления

относительной прочности связывания субстратов с данным

ферментом. В этом смысле специфичность является функцией

прочности связывания обоих субстратов и скорости катализа:

если какой-либо

субстрат,

реагируя с ферментом, имеет кон-

станту ftcat в 1000 раз меньше, чем

для интересующего нас

субстрата, но связывается в тысячу раз прочнее, эти два фактора

будут

компенсировать

друг

друга.

Вот почему важным кинети-

ческим параметром при определении специфичности является

отношение

fecat/Ам:

оно отражает оба фактора — скорость ре-

акции

и прочность связывания.

Термин «специфичность» используется также (по

существу

неверно) при описании активности фермента по отношению к

другому

субстрату

отсутствие

специфического субстрата. Та-

кая

ситуация часто имеет место в опытах in vitro. При этом

субстрат

называют

«плохим»,

если для него характерно либо

высокое значение Км, либо низкое /e

at. В биологических же

системах важны оба этих параметра.

Различие

между

двумя указанными значениями термина

«специфичность» очень важно для понимания сущности

меха-

низмов деформации, индуцированного соответствия и непродук-

тивного связывания в катализе. Как

будет

показано в послед-

ней

главе, эти факторы не влияют на биологическую специфич-

ность, поскольку они изменяют параметры k

t и Км таким

образом, что отношение fecat/Ям остается постоянным.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

И ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ 329

А. Ограничения, налагаемые на специфичность

Центральную проблему специфичности можно сформулиро-

вать так: каким образом фермент отличает специфический суб-

страт от

другого,

меньшего или равного ему по размеру (изо-

стерического)

субстрата?

Отличить больший по размеру суб-

страт от специфического субстрата нетрудно, поскольку полость

фермента, в которой происходит связывание, может быть доста-

точно велика, чтобы связать небольшой специфический

субстрат,

но

слишком мала, чтобы в нее поместилась более крупная моле-

кула конкурирующего субстрата. Однако небольшой по разме-

рам

субстрат

не встречает таких стерических препятствий.

В этом

случае

энергия связывания, используемая в катализе,

будет

меньше. Такие примеры были рассмотрены в разделе,

посвященном сериновым протеазам. Большие по размеру

производные ароматических аминокислот не

могут

связываться

небольшим связывающим карманом эластазы в отличие от

меньших по размерам производных аминокислот, способных

связываться и реагировать с химотрипсином. Однако, как об-

суждалось в начале предыдущей главы, реакции с участием

меньших по размеру субстратов характеризуются значительно

меньшими значениями параметров k

t и yfecat/Дм- Различить

субстраты не составляет

труда

и в том случае, если

между

ними

имеются существенные стереохимические различия. Как указы-

валось в конце гл. 2, при замене L-аминокислоты D-аминокис-

лотой происходит такая перестановка

двух

групп у хирального

атома

углерода,

что продуктивное связывание субстрата стано-

вится невозможным.

Гораздо

труднее

различить субстраты в реакциях, протекаю-

щих с участием аминоацил-тРНК—синтетаз — ферментов, кото-

рые должны с высокой точностью выбрать нужную аминокисло-

ту. Два примера такого рода — конкуренция

между

валином и

изолейцином за активный центр изолейцил-тРНК—синтетазы и

между

треонином и валином за активный центр ва-

лил-тРНК—синтетазы (рис. 11.1).

Валин, отличающийся от изолейцина отсутствием одной ме-

тиленовой группы, связывается сизолейцил-тРНК—синтетазой в

сотни раз слабее. Треонин, несмотря на то что он изостеричен

валину, связывается с валил-тРНК—синтетазой в

100—200

раз

слабее, поскольку в гидрофобный карман, обычно занимаемый

метиленовой группой валина, погружается теперь гидроксиль-

ная

группа.

Эту ситуацию можно проанализировать, воспользовавшись

теорией переходного состояния, как это сделано при рассмотре-

нии

комплементарности

между

ферментом и субстратом в пре-

дыдущей главе. Энергия активации данной реакции представ-

330

ГЛАВА 11

ляет собой

сумму

двух

составляющих; одна из них — энергия

активации для стадии химического превращения

субстрата,

другая

— энергия связывания фермента с субстратом. Если

меньший по размеру или изостерический

субстрат

отличается от

специфического

субстрата

отсутствием элемента R, который

Шолейцил

-тРНК—

синтетаза-

Валш-тРЖ-

синтетаза

Рис.

11.1. Полость в активном центре

изолейцил-тРНК

— синтетазы способна

связывать

валин, поскольку она связывает больший по размеру

изолейцин.

Активный

центр

валил-тРНК

— синтетазы не может «отторгнуть» треонин, так

как

он изостеричен валину.

имеет потенциальную энергию связывания

AAG

максимально

возможное различие в скорости реакции, обусловленное этим

стереохимическим фактором, равно

ехр(—AAG

/RT)

и не может

увеличиваться за счет деформации, индуцированного соответ-

ствия, ряда конформационных изменений, наличия дополни-

тельных стадий химических превращений или

двух

(или боль-

шего числа) одновременно функционирующих центров. Впервые

это было показано для частного случая — механизм Михаэли-

са — Ментен,— а затем обобщено на все

другие

механизмы. Как

мы увидим дальше, специфичность обусловлена связыванием

именно

переходного состояния.