Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

ТЕОРИИ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО

КАТАЛИЗА

311

ответствии

со

сделанным ранее выводом Олбери

Ноулса отно-

сительно второго фермента

[18].

Отметим

еще

один важный момент:

для

термодинамически

невыгодной реакции величина

kcat/Км.

не

может достичь опре-

деляемого диффузией предельного значения.

Это

следует

из

уравнения Холдейна

(гл. 3,

разд.

3),

согласно которому

кон-

станта равновесия

для

реакции

растворе дается отношением

величин

kcatlK/л

для

прямой

обратной реакций. Ясно,

что

kcat/KiA

для

термодинамически, невыгодной реакции

не

может

достичь определяемого диффузией значения, поскольку

этом

случае

отношение ^cat/Км

для

обратной реакции, являющейся

термодинамически выгодной, должно было

бы

быть больше

определяемого диффузией предела, чтобы

не

нарушалось урав-

нение

Холдейна.

Для

невыгодной реакции верхний предел

kcat/Км.

равен определяемому диффузией значению, умножен-

ному

на

термодинамически невыгодную константу равновесия

этой

реакции.

гл. 3,

разд.

А.З,

указывалось,

что,

когда k

t/K.M достигает

определяемого диффузией значения, имеет место механизм

Бриггса

—

Холдейна,

а не

Михаэлиса

—

Ментен. Таким обра-

зом,

чем

дальше продвинулся фермент

на

пути эволюции

отношении

максимизации скорости,

тем

большее значение

при-

обретает механизм Бриггса

—

Холдейна.

В. Молекулярные механизмы использования

энергии

связывания

Итак,

мы

обсудили

общих

чертах,

какие каталитические

преимущества

дает

комплементарность фермента переходному

состоянию субстрата

высокое значение /См,

увидели,

что эта

ситуация реализуется

на

практике. Рассмотрим теперь, какие

механизмы используются

для

достижения этой цели.

1. Деформация

Концепция

деформации принадлежит Холдейну

Полингу

[1,

4] и

состоит

в том, что

активный центр фермента структурно

комплементарен

не

самому

субстрату,

переходному состоянию.

При

связывании

ферментом

субстрате

возникают напряже-

ния

или

деформации. Говоря словами Холдейна,

«в

модели

Фишера

замка

ключа ключ

не

совсем подходит

замку,

подвергается

замке некоторой деформации»

(рис.

10.5).

В настоящее время

эта

концепция применяется

модифициро-

ванном

виде

как

концепция

стабилизации

переходного

состоя-

ния:

дело

не в

деформации субстрата,

а в том, что

переходное

312

ГЛАВА 10

состояние субстрата взаимодействует

ферментом лучше,

чем

сам

субстрат,

поэтому полная энергия связывания

не

реализу-

ется

до тех пор,

пока

не

сформируется переходное состояние.

Рис.

10.5.

Схематическое изображение процесса деформации

по

Холдейну.

Центр

связывания фермента растягивает молекулу

субстрата

так, что ее

структура

приближается

структуре

продукта

сжимает молекулу продукта,

так

что ее

структура

приближается

свою очередь

структуре

субстрата.

2. Индуцированное соответствие

Как

было показано

в гл. 8,

теория индуцированного соответ-

ствия хорошо объясняет некоторые явления, наблюдаемые

случае

аллостерических ферментов.

Эта

теория была предложе-

на

ранее

для

объяснения субстратной специфичности

для про-

стых (неаллостерических) ферментов. Предполагается,

что в от-

сутствие субстрата фермент структурно

не

комплементарен

пе-

реходному состоянию. Однако, поскольку молекула фермента

довольно гибкая,

субстрат

имеет жесткую

структуру,

при

образовании фермент-субстратного комплекса каталитические

группы

на

ферменте ориентируются оптимальным

для

катализа

образом:

это

означает,

что

фермент становится комплементар-

ным

переходному состоянию только после связывания субстрата.

В классическом варианте концепции деформации считается,

что

/См

возрастает

за

счет

той

составляющей энергии связыва-

ния,

которая отвечает

за

деформацию субстрата,

а в

теории

индуцированного соответствия

— за

счет той составляющей

энер-

гии

связывания, которая отвечает

за

деформацию фермента.

а. Отрицательные стороны механизма индуцированного

соответствия

случае

неаллостерических ферментов

В теории напряжений величина

kcat/Кк

максимальна,

по-

скольку

недеформированный

фермент комплементарен

недефор-

мированному

переходному состоянию. Индуцированное соответ-

ствие понижает

kcat/Км,

так как

недеформированному переход-

ному состоянию комплементарен

деформированный

фермент

kcatlKm

уменьшается

за

счет того,

что

часть энергии

расходует-

ся

на

деформацию фермента.

ТЕОРИИ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО

КАТАЛИЗА

313

Рассмотрим процесс связывания субстрата с ферментом по

механизму индуцированного соответствия с

других

позиций.

Разделим этот процесс на воображаемые стадии. Предположим,

что

между

неактивной формой фермента

преобладающей

рассматриваемой системе

([Е

1п

]:=:[Е]о),

и активной формой

(Eact)

у которой каталитические группы ориентированы нуж*

ным

образом,

существует

равновесие:

act <

act

к'

Рассматривая /См в этой

схеме

как простые константы диссо-

циации

и приняв К = [Eact]/[Em], можно показать, что

[E]

[S]*

r/(l + JQ

vvia)

obs

*»• (10.14)

Поскольку

/C< 1,

(W*M)

b.-*(W*M)-

(10.15)

Наблюдаемое значение

kcat/Км.

существенно меньше, чем

для случая, когда весь фермент находится в активной конфор-

мации.

Если

К'

~Э>

1, т. е. фактически весь фермент при связывании

с субстратом находится в активной форме, уравнение

(10.13)

можно упростить. В этом

случае

(*cat)

ob3

*cat

(10.16)

(*м)

оЬз

= *м/*-

(10.17)

&cat имеет такое же значение, как и в случае, когда весь

фермент находится в активной конформации, а параметр /См

значительно выше.

Индуцированное

соответствие увеличивает /См без увеличе-

ния

fecat, и, следовательно, отношение

kcat/K/л

уменьшается, что

приводит к уменьшению эффективности катализа.

Уравнение

(10.15)

показывает, что величина k

t/KiA такова,

как

если бы в активной конформации постоянно находилась

небольшая часть фермента. Это справедливо для

всех

субстра-

тов, поскольку К от природы субстрата не зависит.

314

ГЛАВА 10

3. Непродуктивное связывание

Хотя

при

непродуктивном связывании константа

/См не уве-

личивается, целесообразно рассмотреть здесь этот механизм,

поскольку

он

приводит

эффектам, качественно аналогичным

Расщепление

Рис.

10.6.

Непродуктивное связывание субстратов лизоцимом. Небольшие

субстраты способны присоединяться

любой стороны вдоль вытянутого

ак-

тивного центра лизоцима,

не

связываясь

подцентром,

где

происходит рас*

щепление,

из-за

его

более низкого сродства.

Продуктивное

ввязывание

преобладает

случае

гидрофобных анилидое

сн

AcNH-CH-C-NH

ш&:

ШШШЙШ. Непродуктивное

связываний

i Ifi'^j ьь •

бладает

случав гидро-

ых анилидов

Рис.

10.7.

Неправильное связывание анилидов, содержащих аномальный

гид-

рофобный

остаток,

гидрофобным центром связывания химотрипсина.

эффектам,

возникающим

при

напряжении

или

индуцированном

соответствии. Вначале

эта

теория была привлечена

для

объяс-

нения

более высокой реакционной способности больших

по раз-

мерам специфических

субстратов

по

сравнению

меньшими

неспецифическими субстратами. Предполагалось,

что

помимо

ТЕОРИИ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО

КАТАЛИЗА

315

продуктивного связывания в активном центре возможны другие,

непродуктивные способы связывания, когда небольшие субстра-

ты связываются, но не подвергаются каталитическому превра-

щению

(рис. 10.6).

Примером

такого рода может служить связывание полиса-

харидов с лизоцимом. Для осуществления реакции необходимо,

чтобы из шести центров связывания — А, В, С, D, E, F—моле-

кула субстрата заняла центры D и Е. При связывании с центром

возникает некоторое напряжение, так что увеличение суммар-

ной

энергии связывания при этом не происходит. Тримеры и

тетрамеры связываются непродуктивно с центрами А, В, С и А,

В, С, D соответственно. Однако в

случае

гексамера выигрыш в

энергии

связывания при занятии центров Е и F обеспечивает

продуктивное связывание его с центрами А, В, С, D, E, F.

Наряду с этим «многовариантным» непродуктивным связы-

ванием

возможна ситуация, когда

субстрат

связывается с ак-

тивным центром, но в неправильной ориентации (рис. 10.7). Эта

идея была предложена для объяснения низкой скорости деаци-

лирования

ацилхимотрипсинов [19].

4. Независимость специфичности фермента

от напряжения, индуцированного соответствия

непродуктивного связывания

Специфичность

фермента, заключающаяся в его способности

распознавать один из конкурирующих субстратов, не зависит от

того, какой из

трех

перечисленных выше механизмов имеет ме-

сто.

Подробно этот вопрос обсуждается в гл. 11, но по

существу

все дело здесь в том, что специфичность зависит от

kat/Км.,

напряжение

и непродуктивное связывание не влияют на эту

величину [уравнения

(10.10)

и (3.36)]. Из уравнения

(10.15)

видно,

что индуцированное соответствие просто изменяет пара-

метр Acat/^См для активной конформации фермента в равной

мере по отношению ко всем субстратам (т. е. в К раз).

5. Экспериментальное подтверждение существования

напряжения

и индуцированного соответствия

природа этих явлений

а.

Стационарная

кинетика

Хотя данные стационарной кинетики обычно интерпретируют

рамках одного из указанных выше механизмов, какой именно

из

них реализуется — решить трудно, и выбор всецело зависит

от воли экспериментатора. Как правило, при этом сравнивают

316

ГЛАВА

величины

kcat/Км

для нескольких серий субстратов (как в

табл. 10.1 и 10.2), чтобы убедиться, что специфичность проявля-

ется в увеличении

а не в уменьшении Км- В таком

случае

экспериментатор получает четкие указания на выполнимость

какого-то одного из механизмов, но, как уже отмечалось, не

может определить, какого именно. Дело в том, что все три

механизма приводят к одному и тому же

результату:

энергия

связывания

превращается в энергию активации для химической

стадии. Рассмотрим этот момент несколько более подробно.

Деформация:

дополнительные группы в больших по размеру

субстратах

участвуют

в деформации субстрата, а не в связыва-

нии.

(В рамках теории стабилизации переходного состояния это

Расщепление

АА

"™"

лл ^^ лл "^ АА

АА

*•"•" АЛ

Sfj

Sj S3 Sg Sf

Рис

10.8. Подцентры связывания эластазы.

положение формулируется так: «Дополнительная энергия свя-

зывания

не реализуется до тех пор, пока не образуется пере-

ходное состояние».)

Индуцированное

соответствие:

дополнительные группы в

больших по размеру специфичных

субстратах

участвуют

деформации фермента. Меньшие по размеру неспецифичные

субстраты присоединяются преимущественно к неактивной фор-

ме фермента. Это приводит к уменьшению

ввиду уменьше-

ния

продуктивного связывания, однако соответственно уменьша-

ется и Км, поскольку энергия связывания не используется для

превращения

неактивной конформации в активную.

Непродуктивное

связывание:

большие по размеру субстраты

связываются только продуктивно, а меньшие, обладая способ-

ностью к слабому продуктивному связыванию, связываются еще

непродуктивно, уменьшая Км- Соответственно уменьшается и

Несмотря

на то что на основании данных стационарной ки-

нетики,

сравнивая

-Км, различить механизмы деформации

индуцированного соответствия невозможно, иногда удается

получить дополнительную информацию, позволяющую сделать

выбор

между

этими двумя механизмами. Одним из характерных

примеров такого рода является исследование эластазы [20].

Параметр

для гидролиза AcProAlaProAla-NH

в сотни раз

больше, чем для гидролиза AcAlaProAla-NH

(табл. 10.1). Объ-

яснить

это различие непродуктивным связыванием не удается,

ТЕОРИИ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО

КАТАЛИЗА

317

поскольку наличие последовательности

AlaProAla

должно

было

бы обеспечить продуктивное связывание. Сравнение связывания

субстратов и аналогов переходного состояния указывает на то,

что остатки в подцентрах S5 — S4 дестабилизируют группу

—CONH

энергия гидролиза которой составляет

~8 кДж-моль-

(2 ккал-моль-

),относительно переходного со-

стояния.

Аналоги переходного состояния, в которых группа

—СОЫНг

замещена на

—СНО,

образуют тетраэдрический ад-

дукт

с Ser-195, моделируя подобное тетраэдрическому проме-

жуточному соединению переходное состояние гидролитической

реакции.

Связывание этих аналогов усиливается при занятии

подцентров S5 и S4. Ответить a priori на вопрос, чем обусловле-

на

взаимная дестабилизация между подцентрами

S4—Ss

и амид-

ной

группой субстрата — передающимся через белок конформа-

ционным

изменением или неблагоприятным взаимодействием,

уменьшающимся при образовании переходного состояния,—

невозможно.

б. Предстационарная

кинетика

эксперименты

по

связыванию

Известно

довольно много примеров, когда добавление к

ферментам субстратов и ингибиторов сопровождается измене-

нием

флуоресценции и кругового дихроизма, что свидетельству-

ет об индуцируемых в ферментах конформационных изменениях

[21].

Во многих случаях эти процессы исследованы методами

изучения быстрых реакций. Однако полученные данные, как

правило,

нельзя объяснить в рамках какого-либо конкретного

механизма.

в.

Рентгеноструктурный

анализ

Наиболее обширная информация получена при исследовании

кристаллических ферментов методом рентгеноструктурного ана-

лиза.

Лизоцим:

механизм

напряжения?

При гидролизе лизо-

цимом

полисахаридов кольцо сахара, связанного с подцентром

превращается в карбоний-ион, меняя свою конформацию с

«кресла»

на

«софу»

(гл. 1 и гл. 10, разд. А.4.6). Построение

моделей для этой системы подтвердило, что субстрат, связыва-

ющийся

с подцентром D, вынужден принять конформацию «со-

фы» вследствие неблагоприятных взаимодействия с ферментом,

т. е. в данном случае действует классический механизм дефор-

мации

[22]. Позднее Левитт еще раз проанализировал связыва-

ние

лизоцима с (NAG) 6, использовав более точные координаты

атомов этого фермента и проведя весьма сложные расчеты его

взаимодействия с субстратом вместо построения проволочных

318

ГЛАВА

моделей [8, 23]. Координаты фермента и субстрата оптимизи-

ровались путем выражения длин всех связей, углов между свя-

зями,

торсионных углов и расстояний между несвязанными ато-

-42

-30

Рис.

10.9. Зависимость энергии связывания (ДО) сахарного кольца с подцен-

тром D лизоцима для субстратов (NAG)

с искусственно фиксированной

структурой от величины торсионного

угла

Оч

/ — суммарное изменение

свободной энергии при связывании; 2 — вклад торсионных напряжений;

— вклад

угловых

напряжений; 4 — вклад нековалентных взаимодействий

(см.

текст). Для конформации

«кресла»

угол

—60°,

а для полу-

кресла—0

[8].

мами в виде эмпирических энергетических функций и миними-

зации

энергии с помощью ЭВМ. Результаты, полученные для

D-подцентра и присоединяющегося к нему сахарного кольца,

представлены на рис. 10.9. Использованы три типа приближения.

Первое (•) предполагает, что субстрат обладает гибкостью и

подгоняется к жесткому ферменту. Согласно второму (А),

гибкостью обладают и фермент, и субстрат и оба они

участвуют

в достижении наилучшего соответствия. Третье приближение

ТЕОРИИ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО

КАТАЛИЗА 319

(•) основано на допущении, что фермент обладает лишь

незначительной гибкостью. Как видно из рисунка, наиболее

благоприятной во всех случаях является ситуация, отраженная в

левой части рисунка, когда субстрат имеет конформацию кресла.

Это подтверждает представление о том, что субстрат, связыва-

ясь

с подцентром D, имеет форму кресла и не изменяет свою

конформацию на

«софу»

вплоть до образования карбоний-иона

(или

переходного состояния). Классический механизм деформа-

ции

субстрата, по-видимому, вряд ли имеет место, хотя исследо-

вания

с помощью аналогов переходного состояния указывают

на

возможность стабилизации переходного состояния.

Гексокиназа:

индуцированное

соответствие.

Имеются ве-

ские данные в пользу того, что в гексокиназе дрожжей, которая

фосфорилирует глюкозу с участием концевого фосфата молеку-

лы АТР, достигается индуцированное соответствие между фер-

ментом и субстратом. Согласно данным рентгеноструктурного

анализа, связывание как сахара, так и нуклеотида вызывает

существенные изменения в третичной структуре фермента. Кро-

ме того, присоединение нуклеотида к одной из форм фермента

облегчается связыванием сахара [24, 25]. Эти результаты со-

гласуются с результатами более ранних исследований АТРазной

активности этого фермента в растворе в отсутствие глюкозы.

Гексокиназа фосфорилирует глюкозу в положении 6 с

max

= 800 мкмоль-мин-

на 1 мг белка и Км для АТР 0,1 мМ.

В отсутствие глюкозы АТР гидролизуется с

max

0,02 мкмоль-мин"-

на 1 мг белка и Км = 4,0мМ. Добавление

ликсозы, которая не может фосфорилироваться вследствие ут-

раты оксиметильной группы в положении 6, приводит к увели-

чению

Утах

для реакции с участием АТРазы в 18 раз; при этом

величина Км для АТР уменьшается в 40 раз, т. е. до значения

/См,

характерного дая фосфорилирования глюкозы [26, 27].

Ксилоза вызывает изменения в кристаллической структуре фер-

мента, аналогичные изменениям, индуцируемым глюкозой

(рис.

10.10).

носн

он

Л °\ он А °\он

Jx?

„Кон

о^\

он

р-П-глюкоза р-П-ксилоза fi-B- шксоза

Сериновые

протеазы: стабилизация

переходного

состоя-

ния. Химотрипсин и сериновые протеазы относятся к числу на-

320

ГЛАВА

иболее изученных ферментов благодаря использованию рентге-

ноструктурного анализа с высоким разрешением для исследова-

ния

этих ферментов и их комплексов с природными полипептид-

ными

ингибиторами, моделирующими субстраты (гл. 1) [28—

31].

Каталитическую активность химотрипсина можно подавить

Рис.

10.10.

Изменение конформации гексокиназы, индуцируемое присоедине-

нием

глюкозы. Сплошная линия — а-углеродный полипептидный остов изо-

фермента А, закристаллизованного в присутствии глюкозы. Пунктирная ли-

ния

— полипептидный остов той части изофермента В, которая имеет

другую

структуру

при кристаллизации в отсутствие глюкозы. (Bennett W. S.,

Steitz Т. А., неопубликованные данные; Fedn. Proc.

Abstr.,

1977.)

с помощью химического превращения нуклеофильного

Ser-195

дегидроаланин путем удаления гидроксильной группы и атома

водорода. В остальном

структура

ангидрофермента остается

прежней,

и его можно использовать для изучения связывания

субстрата.

Четко показано, что гидролиз пептидов протекает по

меха-

низму деформации [32]. Кристаллографические данные указы-

вают на наличие центра связывания для уходящей группы пеп-

тидного субстрата. Величина

са

\1Км

для гидролиза

AcPhe-NH

AcPheGly-NH

и AcPheAla-NH

значительно возра-

стает по мере увеличения размера уходящей группы, пока она не

займет весь центр связывания (табл. 10.1), однако это увеличе-

ние

всецело обусловлено увеличением

величина же /См