Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

И ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИОННАЯ

СПОСОБНОСТЬ

341

Таблица

11.1

Корреляция

между

частотой

мутации

экзонуклеазной

активностью

ДНК-полимеразы

фага Т4 [11]

Штамм

L56

L98

74D

L42

L141

Фенотип

Высокая

частота

мута-

ций

То

же

Дикий

тип

Низкая

частота

мутаций

То

же

Количество

гидролизованкого

dTTP

Количество

включенного (1ТМР

0,005

0,01

0,04

1,6

отдельным ферментом, так как ошибку можно исправить по

завершении

полимеризации. Поскольку в

случае

синтеза белков

такая

роскошь непозволительна, гидролитическая функция воз-

лагается на синтетазу, так что исправление ошибки должно

произойти

до того, как неправильно ацилированная

тРНК

поки-

нет этот фермент [13].

«Кинетическое корректирование»

Основное условие функционирования корректирующего ме-

ханизма состоит в том, что в

ходе

реакции должно образовы-

ваться легко гидролизующееся промежуточное соединение или

продукт.

Корректирование

осуществляется введением в реакционный

путь ответвления, обеспечивающего гидролиз нежелательных

соединений.

Как мы видели, в реакции аминоацилирования

тРНК

с участием аминоацил-тРНК—синтетазы в этом процессе

участвует

особый гидролитический центр фермента, где гидро-

лизуется неправильно ацилированная

тРНК,

а возможно, и

предшественник аминоациладенилата.

Хопфилд [14] предложил специфический химический

меха

низм,

который в принципе может использоваться для коррек-

ции,—-кинетическое

корректирование. Отличительной чертой это-

го механизма является отсутствие у фермента гидролитического

центра; нежелательные промежуточные соединения диффунди-

руют

в раствор, где подвергаются неферментативному гидро-

лизу. Принципы действия кинетического корректирования можно

проиллюстрировать, рассмотрев гипотетический процесс амино-

ацилирования

тРНК

[схема

(11.16)]

(хотя, как было показано

выше,

в этом

случае

на самом

деле

имеет место не кинетическое

342

ГЛАВА

корректирование,

а механизм «двойного

сита»

с участием осо-

бого гидролитического центра):

АТР PPi

V_>

к-,

Е.АА — •

Е.АА-АМГ

•

АА'ТРНК

(11.16)

Е+АА

Е+АА-АМР

^ •

АА+АМР

При гидролизе АТР образуется высокоэнергетическое промежу-

точное соединение — аминоациладенилат. Фермент-содержащее

промежуточное соединение может либо реагировать с

тРНК

образованием продуктов, либо диффундировать в раствор и

гидролизоваться. Если имеет место кинетическое корректирова-

ние,

ошибочное промежуточное соединение (например, комплекс

валиладенилата с изолейцил-тРНК.—синтетазой) диффундирует

раствор и гидролизуется быстрее, чем успевает прореагиро-

вать с образованием продуктов, т.е.

<?C&-4.

Для «правильного»

промежуточного соединения &з > fe_

и имеет место образование

продуктов. Следовательно, более прочное связывание специфи-

ческого субстрата используется дважды: первый раз при

связывании

субстрата с образованием комплекса Михаэлиса и

второй — при связывании промежуточного соединения. Таким

образом, если избирательность для первой стадии обозначить

через /, то при условии, что для второй стадии она может

достичь того же значения, мы получаем в итоге избирательность

. Однако чтобы избирательность на второй стадии достигла

максимального значения, /, для

правильного

субстрата

дол-

жно быть меньше £_

, так что эффективность его образования

будет

низкой. Эти ограничения не распространяются на

меха-

низмы

двойного сита (рис. 11.4), поскольку из-за наличия у

фермента отдельного гидролитического центра структурное раз-

личие

между

двумя субстратами может использоваться на

двух

этапах. Так, например, при удалении валина с помощью изолей-

цил-тРНК—синтетазы

преимущественное связывание изолей-

цина

(а не валина) с центром аминоацилирования обусловлива-

ется тем, что изолейцин больше по размерам, чем валин.

другой

стороны, благодаря меньшим размерам валин

легче

связывается с центром, где происходит деградация, связывание

же изолейцина с этим центром стерически затруднено. В

меха-

низме

кинетического корректирования различия

между

двумя

субстратами также используются дважды. Пока четких данных

выполнимости этого механизма нет, однако в принципе он

весьма интересен и правдоподобен.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

И ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИОННАЯ

СПОСОБНОСТЬ

343

СПИСОК

ЛИТЕРАТУРЫ

1. Loftfield R. В.,

Vanderjagt

M. A., Biochem. J., 128, 1353 (1972).

2. Baldwin A. N.,

Berg

P., J. biol. Chem., 241, 831 (1966).

Fersht

A. R., Kaethner M., Biochemistry, 15, 3342 (1976).

4. Raunio P.,

Rosenqvist

#., Acta chem. Scand., 24, 2737 (1970).

Fersht

A. R., Biochemistry, 16, 1025 (1977).

Kornberg

A., DNA synthesis, Freeman W. H. and Co., (1974). [Имеется

перевод:

Корнберг А. Синтез ДНК. — М.: Мир, 1977.]

7. Hall Z. W., Lehman I. R., J. molec. Biol., 36, 321 (1968).

8. Battula N., Loeb L. A., J. biol. Chem., 249, 408 (1974); 250, 4405 (1975).

Brutlag

D.,

Kornberg

A., J. biol. Chem., 247, 241 (1972).

10.

Koessel

H., Roychoudhury R., J. biol. Chem., 249, 4094 (1974).

11.

Muzyczka N., Poland R. L, Bessman M. J., J. biol. Chem., 247, 7116 (1972).

12. Lindahl Т.,

Proc.

natn.

Acad. Sci., U.S.A., 71, 3649 (1974).

13.

Ninio J., Biochimie, 57, 587 (1975).

14.

Hopfield

J. J.,

Proc.

natn.

Acad. Sci., U. S. A., 71, 4135 (1974).

Глава

СТРУКТУРА

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

В этой главе

мы

рассмотрим механизм действия большинства

ферментов,

кристаллическая

структура

которых установлена

высоким

разрешением.

Особое внимание уделено вопросу

о том, как

совместное

использование данных кинетических

структурных исследова-

ний

позволяет достаточно полно описать механизм реакций,

также

тому,

что

дало изучение ферментативного катализа

для

развития представлений

механизме

химического

катализа.

Кроме

того,

этой главе рассмотрены некоторые эксперимен-

тальные подходы, используемые

энзимологии.

сожалению,

мы

не

касаемся здесь многих весьма интересных

по

своим свой-

ствам ферментов, поскольку

их

кристаллическая

структура

все

еще

не

установлена. Охватить

такой небольшой

по

объему

книге

все

ферменты невозможно

— их

число превышает

1500,—

мы

включили

данную

главу

только

те из них, для

которых

можно связать трехмерную

структуру

механизмом действия

фермента.

Детали механизма действия большинства этих ферментов

более

или

менее известны. Установлено, например, наличие

положение каталитических групп

последовательность химиче-

ских превращений

ходе

реакции (хотя

и не для

всех

случаев).

Лучше

всего изучены реакции, протекающие

образованием

промежуточных соединений, которые можно выделить

и оха-

рактеризовать.

Это не

только

дает

представление

механизме

химических превращений,

но и

позволяет сразу получить

важ-

ную информацию

положении субстрата относительно катали-

тических групп фермента.

Основной

задачей структурного исследования является опре-

деление структуры фермент-субстратного комплекса.

Без

этого

невозможно уяснить себе детали ферментативного процесса

(например,

определить, деформируются

ли в

ходе

реакции

фер-

мент

субстрат)

точно установить положение субстрата отно-

сительно каталитических групп. Сама

по

себе

структура

фер-

мента

дает

только основу, позволяющую строить различные

ги-

СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 345

потезы. К сожалению, как уже отмечалось в гл. 1, установить

структуру

продуктивных комплексов

между

ферментом и суб-

стратом, как правило, не удается, а потому приходится исполь-

зовать соединения, являющиеся аналогами субстратов, и прибе-

гать к построению моделей. Недостаток данного подхода состо-

ит в том, что можно не заметить такие эффекты, как напряжения

деформации. Иногда (например, в

случае

рибонуклеазы)

структура

аналога очень близка к

структуре

природного суб-

страта. В редких случаях (для трипсина и триозофосфатизоме-

разы) положение равновесия

между

субстратом и продуктом

таково,

что оно позволяет установить

структуру

продуктивного

комплекса.

Очень важно иметь в виду следующее. Интерпретируя свои

экспериментальные данные, исследователи нередко переоцени-

вают их надежность и

делают

необоснованные выводы. Так,

например,

при анализе рентгеностг ктурных данных один ис-

следователь может придавать большое значение каким-то изме-

нениям

на карте электронной плотности, а

другой

рассматривать

их как артефакт. Наихудшие интерпретаторы из

всех

— это те,

кто интерпретируют интерпретацию

других.

В подготовке данной главы существенную помощь мне ока-

зали мои коллеги, позволившие привести свои неопубликован-

ные

данные. В связи с этим

хотел

бы выразить благодарность

следующим ученым (их фамилии приведены в алфавитном по-

рядке):

Брёндёну С.-И.,

Дутлеру

X. и Плэппу Б. (алкогольдегид-

рогеназа);

Байсекеру Г. и Уонакотту А. (глицеральдегид-3-фос-

фат—дегидрогеназа); Петско Г. (эластаза); Андреевой Н. С.Ан-

тонову В. К- и Гофману Т. (пепсин); Ноулсу Р. и Филлипсу Д.

(триозофосфатизомераза);

Уотсону X. (фосфоглицеромутаза).

А. Дегидрогеназы

Дегидрогеназы, которые мы рассмотрим в данном разделе,

катализируют окисление спиртов до карбонильных соединений.

В роли коферментов для них выступают либо

NAD+,

либо

NADP+.

Комплекс фермента и кофермента называется

голофер-

ментом,

тогда

как свободный фермент именуется апоферментом.

Некоторые дегидрогеназы специфичны лишь к одному из этих

коферментов,

когда как

другие

используют оба. Реакции, ката-

лизируемые дегидрогеназами, легко обратимы, так что карбо-

нильные

соединения

могут

быть легко восстановлены с помощью

NADH

или NADPH. Скорости как прямых, так и обратных реак-

ций

очень просто измерить по появлению или исчезновению

восстановленного кофермента, который имеет характерный

спектр поглощения в ультрафиолетовой области с максимумом

346

ГЛАВА

при

X = 340 нм. Кроме того, восстановленные коферменты при

освещении

их светом с длиной волны 340 нм флуоресцируют, что

дает

еще более чувствительный способ их регистрации.

Химическая сторона процесса восстановления NAD+ была

изучена в

ходе

весьма элегантных экспериментов [1]. Окисление

спирта сопровождается отщеплением

двух

атомов водорода.

Один из них переносится непосредственно в положение 4

нико-

тинамидного кольца

NAD+,

другой

высвобождается в виде про-

тона [2, 3]. Обычно считают, что водород переносится в виде

.он

-CONH,

н. н

CONH,

f Н

(12.1)

гидрид-иона Н~ (однако не исключено, что образуется промежу-

точное соединение, являющееся радикалом). Этот перенос сте-

реоспецифичен.

Использование дейтерированных субстратов по-

зволило установить, что одни дегидрогеназы переносят водород

на

одну сторону никотинамидного кольца, а

другие

— на проти-

воположную [схема (12.2)]. Исходя из этого ферменты подраз-

деляются на два класса — А и В (табл. 12.1) (см. также гл. 2,

разд. 3).

CONH,

N—R

,N—R

(12.2)

Структура некоторых дегидрогеназ установлена. Эти фер-

менты,

их физические и кинетические свойства подробно рас-

смотрены в работах [4—8]. Приведенные данные позволяют

сделать некоторые выводы. Как говорилось в конце гл. 1, в

субъединицах фермента можно выделить два домена: катали-

тический

домен,

структура

которого существенно различается

для разных дегидрогеназ, и домен, связывающий нуклеотид и

характеризующийся тем, что его полипептидная цепь уложена

одинаковым для

всех

дегидрогеназ образом. Детали структуры

этого домена варьируют от фермента к ферменту, однако во

всех

случаях кофермент присоединяется в развернутой конформации

(рис.

12.1). Наиболее важное изменение касается способа рас-

положения

никотинамидного кольца: для ферментов разных

классов (А и В) оно обращено к

субстрату

разными сторонами.

СТРУКТУРА

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

347

Таблица

12.1

Стереоспецифичность коферментов некоторых дегидрогеназ

Дегидрогеназы

Глутаматдегидрогеназа

Глюкозо-6-фосфат—де-

-гидрогеназа

3-глицерофосфат—деги-

дрогеназа

Глицеральдегид-3-фос-

фат—дегидрогеназа

Малатдегидрогеназа

(растворимая)

Алкогольдегидрогеназа

Лактатдегидрогеназа

Изоцитратдегидрогеназа

Необходимый

кофермент

NAD

или

NADP

NAD

NADP

Стереоспецифичность

(класс)

Рис.

12.1.

Связывание

NAD+

глицеральдегид-3-фосфат

—

дегидрогеназой

иа

Bacillus

stearothermophilus

[58].

348

ГЛАВА

1. Алкогольдегидрогеназы [5]

Алкогольдегидрогеназы — это цинксодержащие металло-

ферменты,

окисляющие широкий круг алифатических и арома-

тических спиртов до соответствующих альдегидов и кетонов и

использующие в качестве кофермента NAD+ [см.

схему

(12.11)].

Наиболее детально изучены две алкогольдегидрогеназы: из

дрожжей и из печени лошади. Кристаллическая

структура

апо-

голоферментов из печени лошади была установлена с разре-

шением

2,4 [9] и 4,5 А соответственно. Молекула этого фермента

представляет собой симметричный димер, состоящий из

двух

идентичных цепей с мол. весом 40 000. Каждая цепь содержит

один

центр связывания NAD+ и два центра связывания

Непосредственное участие в катализе принимает только один из

ионов

цинка. Дрожжевая алкогольдегидрогеназа представляет

собой тетрамер с мол. весом 145 008, каждая цепь которого

связывает одну молекулу NAD+ и один ион

Несмотря на

отмеченные различия, предварительные данные по аминокис-

лотной последовательности свидетельствуют о высокой гомоло-

гичности этих

двух

ферментов. Предполагается, что механизм

ферментативной реакции для обоих ферментов в принципе оди-

наков,

хотя лимитирующая стадия, рН-зависимость скорости

реакции

и графики Гаммета

могут

различаться.

а.

Структура

активного

центра

алкогольдегидрогеназы

печени

[5]

Ион

находится на дне гидрофобного кармана, образо-

ванного в месте соединения каталитического и связывающего

нуклеотид доменов. Лигандами атома цинка являются атомы

серы аминокислотных остатков

Cys-46

Cys-174

и атом азота

остатка His-67. Четвертым лигандом служит способная к

иони-

зации

молекула воды, связанная водородной связью с гидро-

ксильной

группой остатка Ser-48, который в свою очередь обра-

зует

водородную связь с His-51. Из рН-зависимости связывания

NAD+

[10] и прямого определения количества высвобождаю-

щихся протонов при связывании NAD+ [11]

следует,

что р/(

функциональной

группы апофермента равен 9,6,

тогда

как в

голоферменте эта величина составляет ~7,6. Кристаллографи-

ческие исследования позволяют предположить, что ионизирует-

ся

связанная с цинком молекула воды. Никотинамидное кольцо

прочно

связывается в непосредственной близости от иона цинка

на

дне гидрофобного кармана.

б.

Структура

фермент-субстратного

комплекса

Структура реакционноспособных тройных комплексов фер-

мент—NAD+—

спирт и фермент — NADH — альдегид (или ке-

СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

349

Ращелина,

в которой

происходит

связы-

вание

ЫЛП*

(His-67)

—S(Cys-46)

„Карман"в

кото

происходит

связи

вание

субстрата

Рис.

12.2. Схематическое изображение активного центра алкогольдегидрогена*

зы из печени лошади. (С любезного разрешения C.-I. Branden.)

(His-51)

Рис.

12.3. Модель продуктивного тройного комплекса алкогольдегидрогеназы

из

печени лошади. Предполагается, что ионизированный спирт замещает свя-

занную с цинком молекулу воды, изображенную на рис. 12.2. (С любезного

разрешения C.-I. Branden.)

350

ГЛАВА

тон) была определена не прямым способом, а с помощью по-

строения моделей. Проведенные исследования позволяют сде-

лать вывод, что атом кислорода спирта или

альдегида

(кетона)

непосредственно присоединен к иону цинка, а гидрофобная бо-

ковая цепь связывается с гидрофобной

«полостью»

кармана [5].

Эта гипотеза подтверждается проведенными недавно с по-

мощью построения моделей исследованиями взаимозависимости

структуры

и реакционной способности для ряда замещенных

производных циклогексанов [12], спектроскопическими данны-

ми

[13] и данными по связыванию [14], показывающими, что

карбонильная группа присоединяется непосредственно к поло-

жительно заряженному или кислотному центру (при введении

заместителей, являющихся донорами электронов, в спектре аль-

дегида

происходят соответствующие изменения, а связывание

замещенных бензальдегидов становится более прочным).

Координационное

число для иона

и состояние ионизации

спирта в тройном комплексе точно не известны. Согласно одной

гипотезе, спирт замещает присоединенную к цинку

молекулу

воды или гидроксил-ион и связывается в виде ионизированного

алкоголят-иона [5]:

NAD

с ^ NADAl ^С

(12.3)

R R R

По

мнению

других

авторов [15], недиссоциированный спирт

присоединяется к иону

без замещения молекулы воды;

координационное число цинка возрастает до 5.

Модель тройного комплекса построена исходя из

следующих

межатомных расстояний: расстояние

между

ионом

С-1-атомом спирта равно 3,3 А: расстояние от

до центра

никотинамидного кольца — 4,5 А; расстояние

между

С-1-атомом

спирта и С-4-атомом никотинамидного кольца составляет 3,5 А

[12],

в.

Кинетический

механизм

Исследования дегидрогеназы из печени лошади, проведен-

ные с использованием методов стационарной кинетики и мето-

дом остановленной струи, рассматриваются теперь как классиче-

ские экспериментальные работы. Они позволили установить, что

окисление спиртов представляет собой упорядоченный процесс,