Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 391

катализа, поскольку а) при их ацетилировании фермент теряет

свою активность и б) остатки лизина находятся в положениях 7,

41 и 66 во

всех

20 (или около того) рибонуклеазах этого класса,

для которых установлена аминокислотная последовательность

[172]. Возможно, положительные заряды этих боковых цепей

стабилизируют промежуточное соединение, содержащее пяти-

валентный атом фосфора, которое образуется, когда гидро-

ксильная

группа атакует фосфат. Значения р/С

для His-12 и

His-119, измеренные с помощью ЯМР при

40°С,

оказались рав-

ными

5,8 и 6,2 соответственно [173]. При физиологическом рН

значительная часть гистидиновых остатков находится в таком

состоянии

ионизации, при котором возможен общий кислотно-

основный

катализ [схема (12.37)].

Показательным примером специфичности по принципу замка

ключа может служить связывание пиримидина с активным

центром [171]. Водородные связи с -гидроксильными группами

Ser-123

и Thr-45 и NH-группой, принадлежащей Thr-45,

могут

образовывать как урацил, так и цитозин [схема (12.40)]. Свя-

зывание производных аденозина, имеющих больший размер,

приводит к смещению фосфата относительно гистидиновых

остатков.

(Thr-45) |1 ^ ^ |(Thr-45)

Х„ 'н o-

>Ч

(Ser-123)' (Ser-ШГ Н

2. Стереохимия реакции замещения

(12.40)

Нуклеофильное замещение у атома фосфора в реакции этого

типа протекает как реакция присоединения—отщепления, в

которой

образуется промежуточное соединение, содержащее

пятивалентный

атом фосфора. Упомянутая реакция может осу-

ществляться двумя путями: по механизму (12.41), когда атаку-

ющий

нуклеофил присоединяется со стороны, противоположной

уходящей группе (in-line mechanism), или по механизму (12.42),

когда нуклеофил подходит со стороны уходящей группы

392

ГЛАВА

(adjacent mechanism)

[174, 175]. В

последнем случае реакция

имеет

еще

одну стадию.

°^'f-°

— RO-.P-OR' — RO-pf

+R4r (1241)

но

I но'i

° О" О

Ho'pOR

OR'

НО—Р—OR

o'V

(12.42)

Для тригонального бипирамидального атома фосфора должен

наблюдаться поворот заместителей,

что

обусловлено перемеще-

нием

уходящей группы

аксиальное положение [схема (12.43)].

Эта перегруппировка является следствием детального равнове-

сия:

нуклеофил атакует

по

аксиальному положению

и,

следова-

тельно, уходящая группа должна покинуть

это

положение

(поскольку

ходе

обратной реакции

она

должна атаковать

по

аксиальному положению).

Экваториальное

НО

-7Р\

OR'

Аксиальное

ОН

Экваториальное

(12.43)

Исследование фермент-субстратного комплекса позволило

высказать предположение

наличии механизма (12.41), которое

получило подтверждение

ходе

весьма элегантных химических

экспериментов

использованием оптически активного субстрата

уридин-2'-3'-циклофосфотиоата [ 176— 178]:

•нош

Атака

механиз

Wj/(12.40°\

|°

р*

Расщепляемая

связь

(12.44)

Атака

по механизму

(12.42)

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

393

Это соединение было получено в кристаллическом виде, а его

структура и абсолютная стереохимическая конфигурация

уста-

новлена с помощью рентгеноструктурного анализа. При инкуба-

ции

с рибонуклеазой в смеси метанол/вода образовывался ме-

тиловый эфир по механизму, обратному схеме (12.37). Это со-

единение было также закристаллизовано, а его абсолютная

стереохимическая конфигурация установлена методом рентгено-

структурного анализа [см.

схему

(12.45)].

носн

МеО:-

НОСН

МеО

(12.45)

Метиловый эфир образуется по механизму (12.41). При инкуба-

ции

его в водном растворе с рибонуклеазой образуется исходный

циклофосфотиоат

(12.44), что согласуется с принципом деталь-

ного равновесия, поскольку прямая и обратная реакции должны

протекать через одно и то же переходное состояние. Но это

прямо

показывает, что стадия циклизации сопровождается ата-

кой

по механизму (12.41): атака гидроксила рибозы по меха-

низму

(12.42)

при циклизации метилового эфира в реакции

(12.45)

должна была бы дать энантиомер циклофосфотиоата.

НОСН

Атака

по

механизму

(12.41)

О-Н

(12.46)

Атака

по

механизму

(12.42)

394

ГЛАВА

Г. Стафилококковая нуклеаза [179, 180]

Стафилококковая нуклеаза является фосфодиэстеразой, рас-

щепляющей ДНК и РНК с образованием З'-фосфомононуклео-

зидов.

НОСН

•

R'OPOf +

(ОН)

-О

РО (ОН)

(12.47)

Фермент имеет мол. вес 16 900 и образован единственной поли-

пептидной цепью, содержащей 149 аминокислотных остатков.

Структура стафилококковой нуклеазы и его комплекса с тими-

дин-3',5'-дифосфатом была установлена с разрешением 2,0 А

[181, 182], и, несмотря на это, механизм действия фермента не

известен. Вспомнив об

успехах,

достигнутых при исследовании

рибонуклеазы, и имея в виду все вышесказанное о стафилокок-

ковой нуклеазе, можно сделать вывод, что определение струк-

туры

фермента не означает, что мы автоматически устанавлива-

ем механизм его действия. И тем не менее данные о кристалли-

ческой

структуре

послужили основой при выяснении механизма

действия рассматриваемого фермента.

5'-фосфатная группа тимидин-3',5'-дифосфата в комплексе

фермента с ингибитором занимает, по-видимому, центр связы-

вания

фосфата диэфирного субстрата. Эта группа связана водо-

родными связями с положительно заряженными боковыми це-

пями

Arg-35

Arg-87,

что облегчает атаку нуклеофилом. Однако

вблизи расщепляемой связи не обнаружено никаких кислотно-

основных боковых цепей, хотя на расстоянии ~ 5 А от фосфатной

группы находится ион кальция, связанный с карбоксилатными

группами Asp-21,

Asp-40

и Glu-43. Известно, что ионы кальция

имеют важное значение для активности фермента. Возможно, в

реакции принимают участие связанные с металлом нуклеофиль-

ные гидроксил-ионы [схема

(12.48)]

[183, 184],

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 395

(Arg-35)

NH,

/ н

(Arg-87)

Н. V _.

(12.48)

Это предположение подтверждается в какой-то мере тем фак-

том, что

между

ионом кальция и фосфатной группой имеется

некоторая

электронная плотность, как видно на карте кристал-

лической структуры; кроме того, рН-оптимум ферментативной

активности весьма высок (график рН-зависимости

t/Kn

представляет собой колоколообразную кривую, положение мак-

симума которой определяется значениями р/С

8,4 и 9,2)

[186].

Все приведенные соображения носят

сугубо

предположитель-

ный

характер. Необходимо, кроме того, обратить внимание на

следующее обстоятельство: с комплексом

между

ферментом и

ингибитором связано два иона кальция [186], но в кристалличе-

ской

структуре

виден только один.

Д.

Лизоцим

[187—189]

Лизоцим

яичного белка — это небольшой фермент с

мол.

весом 14 500, состоящий из 129 аминокислотных остатков.

О лизоциме говорилось в конце гл. 1; отмечалось, что пионерские

работы по установлению кристаллической структуры этого фер-

мента стимулировали исследования ферментов в растворе. Ме-

ханизм действия лизоцима был построен исходя из данных о

структуре

активного центра с привлечением идей физической

органической химии [190, 191]. Механизм основан на следующих

положениях. Молекула лизоцима имеет шесть подцентров для

связывания

глюкопиранозных колец субстрата — А, В, С, D, Е и

расщепляемая связь располагается

между

подцентрами D и Е

поблизости от карбоксильных групп Glu-35 и

Asp-52;

это позво-

ляет предположить, что реакция протекает через образование

промежуточного карбоний-иона (точнее карбоксоний-иона), ко-

торый стабилизируется ионизированной карбоксильной группой

396 ^

ГЛАВА

остатка

Asp-52.

Высвобождение спирта катализируется по ме-

ханизму общего кислотного катализа неионизированной кар-

боксильной группой Glu-35. Кроме того, как обсуждалось в

гл. 10 (разд. А.5.6 и В.5.в), при связывании с подцентром D

кольцо сахара принимает свойственную карбоний-иону конфор-

мацию «софы»; для небольших полисахаридов деформации на

участке D не происходит вследствие связывания их с центрами

ABC. Рассмотрим, каким образом все эти положения (за ис-

ключением, пожалуй, роли деформации при связывании с под-

центром D) были проверены экспериментально. (Конформация

глюкопиранозного кольца, связанного с подцентром D, вначале

была названа конформацией «полукресла», однако точнее назы-

вать ее «софой»

[192].)

NHAc

-O

C-(Asp-52)

сн,он

"О

С—(Glu-35)

HOR'

~О

С—(Asp-52)

NHAe

{12.49)

1. Карбоний-ион

Механизм с участием карбоний-иона реализуется путем пря-

мой атаки субстрата водой или путем нуклеофильной атаки

остатком

Asp-52

углеродного атома С-1 с образованием проме-

жуточного соединения, которое по своей природе является эфи-

ром. Простая реакция замещения исключается, поскольку про-

текает с сохранением конфигурации (гл. 7, разд. В.З) [193—

195]. Образование карбоний-иона, т. е. выполнение механизма

SNI,

подтверждается данными о вторичных изотопных эффектах

в опытах с использованием субстратов, меченных в положении

С-1 дейтерием или тритием [196, 197]. Так, например, k

для

соединений, представленных на

схеме

(12.50), составляет 1,11, в

то время как для реакции с образованием карбоний-иона эта

СТРУКТУРА

МЕХАНИЗМ

ДЕЙСТВИЯ

ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

397

величина равна 1,14, а для реакции бимолекулярного замеще-

ния (SN2)

В простых химических моделях — 1,03.

сн,он

но

сн,он

ОРИ

но

он

(12.50)

2. Электростатический и общий кислотный катализ

рН-зависимость

\IKm показывает, что скорость реакции,

катализируемой лизоцимом, определяется состоянием ионизации

кислоты с р/Са ~6 и основания с рКа ~ 4 в свободном ферменте

[198]. Остаток

Asp-52

можно специфически блокировать по-

средством этерификации его триэтоксонийфторборатом (реак-

ция,

протекающая лишь при наличии ионизированной карбок-

сильной

группы). Различие в кривых титрования для модифи-

цированного

и нативного белка показывает, что значение

рАа

Asp-52

равно 4,5,

тогда

как для Glu-35 оно составляет 5,9

[199]. Таким образом,*" скорость реакции зависит от состояния

ионизации

этих

двух

остатков в соответствии с рассмотренным

выше механизмом действия лизоцима.

Результаты, полученные при исследовании обратной реакции,

указывают на наличие механизма общего кислотного катализа с

участием

Glu-35. Установлено, что скорость реакции спиртов с

карбоний-ионом

фактически не зависит от их р/С

. Этот факт

позволяет предположить, что имеет место катализируемая по

механизму общего основного катализа атака карбоний-иона

спиртом,

и, следовательно, согласно принципу детального рав-

новесия,

высвобождение алкоголят-иона из гликозида ускоряет-

ся

по механизму общего кислотного катализа [200].

Описывая

впервые механизм действия лизоцима, Верной

[191] подчеркивал, что наиболее важным фактором катализа

является электростатическая стабилизация карбоксоний-иона

остатком

Asp-52.

Проведенные недавно теоретические исследо-

вания,

в которых впервые принималась во внимание диэлектри-

ческая постоянная белка,

свидетельствуют

о том, что в резуль-

тате

электростатической стабилизации энергия активации для

стадии химического превращения, характеризующейся констан-

той

at,

уменьшается на 37,6 кДж-моль-

(9 ккал-моль-

)

[201J.

Этот вывод получил экспериментальное подтверждение

398

ГЛАВА

Такое сильное уменьшение энергии активации показывает, что

химическое превращение карбоксильной группы

Asp-52

—СНгОН-группу приводит к потере ферментативной активности

[202].

3. Энергии связывания с подцентрами

Первоначально предполагалось, что нековалентные взаимо-

действия

между

ферментом и сахарным кольцом на подцентре D

приводят к

тому,

что

сахар

переходит

в конформацию

«софы»,

свойственную карбоний-иону. Предпринимались попытки оце-

нить энергию связывания с этим подцентром

путем

выделения

соответствующей составляющей из суммарной энергии связыва-

ния,

полученной из кинетических данных и экспериментов по

связыванию [187, 189]. Некоторые

результаты

этих исследова-

ний

представлены в табл. 12.3.

Хотя

приведенные значения не

Таблица

12.3

Энергия

связывания

различных

остатков

подцентрами

лизоцима

яичного

белка

Подцентр

NAG=

вая кислота.

Связываемый

остаток

NAQ

NAM

NAG

NAM

NAG

Эыергия связывания

кДж-моль"

-8

— 12

-16

-20

+ 12

— 16

—8

ккал.моль '

-3

—4

-5

—4

Ч-ацетилглюкозамин, ХАМ=№ацетилмурамо-

отличаются высокой точностью,

ясно,

что взаимодействие NAM

с подцентром D сопровождается их взаимным отталкиванием.

Кроме того, поскольку установлено, что (NAQ)

связывается

примерно одинаково с подцентрами А, В, С и А, В, С, D,

никакого

выигрыша в энергии при связывании NAG с подцент-

ром D нет [203]. Место связывания небольших

субстратов

было

определено по их взаимодействию со специфическими соедине-

ниями-зондами,

например с красителем бибрихским алым [204]

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 399

ионом лантанида [203], которые связывались в расщелине;

было показано, что указанные субстраты связываются в основ-

ном

непродуктивно. На первый взгляд это служит веским дово-

дом в пользу механизма деформации. Однако Левитт [205],

пересмотрев эти данные (гл. 10, разд.

В.4.в)

и проделав

соответствующие расчеты, пришел к выводу, что вероятность

деформации сахарного кольца при связывании с подцентром D

очень мала [201, 205]. Кроме того, было показано, что аналоги

переходного состояния, имеющие химически модифицированное

сахарное кольцо, структурно аналогичное карбоний-иону, свя-

зываются не более чем в 100 раз прочнее субстратов, у которых

это

кольцо не модифицировано (гл. 10, разд. А.5) [203, 206].

Далее, предполагается, что слабое связывание сахарного кольца

с подцентром D обусловлено вытеснением этим кольцом

двух

молекул воды, связанных с карбоксильной группой

Asp-52.

Сле-

довательно, связывание с подцентром является скорее «электро-

статическим», чем механическим. (В любом случае, как подчер-

кивалось в гл. 10, более прочное связывание переходного состо-

яния

не означает, что связанный

субстрат

деформирован.)

Данные,

полученные в

результате

рентгеноструктурных ис-

следований лизоцима и его комплексов с ингибиторами, не

только выдержали испытание временем, но и получили четкое

подтверждение при исследовании в растворах (но в этом

случае

основное

внимание уделялось электростатической компоненте

механизма напряжения, а не компоненте, обусловленной дефор-

мацией)

Наконец,

следует

отметить, что, как установлено, связывание

небольших субстратов является двухстадийным процессом, со-

провождающимся изомеризацией фермент-субстратного комп-

лекса [207, 208]. В чем состоит это так называемое конформа-

ционное

изменение и как соотносится с описанной выше схе-

мой

— неясно; можно предположить, что оно связано с неболь-

шими

структурными изменениями, наблюдающимися при свя-

зывании

(NAG)

в кристаллическом ферменте.

Е. Карбоангидраза [209, 210]

Карбоангидраза катализирует гидратацию двуокиси углеро-

да и дегидратацию бикарбоната:

СО

+ Н

О ?=+

НСОз+Н

(12.51)

Кристаллическая

структура

изоферментов В и С человека была

установлена с высоким разрешением [211, 212]. Обе формы

являются металлоферментами, содержащими один моль цинка,

прочно

связанного с единственной полипептидной цепью с мол.

400

ГЛАВА

весом 29 000. Полипептидная цепь более активной С-формы сот

стоит из 259 аминокислотных остатков — на один меньше, чем у

В-формы [213, 214]. Аминокислотные последовательности этих

двух

изоферментов совпадают на 60%, а их третичные структуры

очень сходны. Лигандами иона

являются имидазольные

кольца

трех

остатков гистидина, расположенных на дне полости

активного центра на расстоянии около 12 А от поверхности

молекулы фермента. Четвертым лигандом служит, по-видимому,

молекула воды или гидроксил-ион (в зависимости от рН) [211,

212].

Изофермент

С является чрезвычайно эффективным катали-

затором. Для реакции гидратации

равна 10

-1

, а /См для

СО

— 8,3 мМ, в то время как для реакции дегидратации

cat

6-10

а /См для НСОз равна 32мМ [215]. Каталити-

ческая активность фермента определяется состоянием иониза-

ции

группы с р/Са = 7 в свободном ферменте [215]. Реакция

гидратации зависит от доли этих групп, находящихся в основной

форме,

а реакция дегидратации — от доли этих же групп, нахо-

дящихся в кислой форме. Число оборотов для указанных реак-

ций

значительно выше констант скорости переноса протонов

между

водой и группой с р/С

= 7 (приблизительно 2-Ю

с~';

табл. 4.2). В нефизиологических реакциях эти ферменты ката-

лизируют также гидратацию альдегидов и гидролиз эфиров.

Предметом исследований в данной области являются в по-

следнее время три вопроса: а) что представляет собой ионизи-

рующаяся группа с рКа = 7, от которой зависит активность

фермента? б) какова природа субстрата, связываемого в реак-

ции

дегидратации

(НСОз.

или Н

СО

)? в) совместимы ли высо-

кие

числа оборотов со скоростями переноса протона?

В рамках классического механизма считается, что при высо-

ком

рН связанный с цинком нуклеофильный гидроксил-ион об-

разуется за счет связывания с этим атомом молекулы воды с

рКа

= 7 [210, 216]. Известно, что связанный с цинком гидро-

ксил-ион

является нуклеофилом и ионизируется в этой области

(гл. 2, разд. Б.7.6). Было высказано множество

других

предпо-

ложений на этот счет [217—219], но единственными группами в

активном

центре, которые

могут

иметь указанный р/С

, являются

гистидины. Однако исследование процесса ионизации остатков

гистидина с помощью ЯМР выявило несоответствие

между

ак-

тивностью фермента и состоянием их ионизации [220]. К тому

же результаты измерений ядерных квадрупольных взаимодей-

ствий в ферменте, где

цинк

замещен на кадмий, указывают на

ионизацию

связанной с металлом молекулы воды с таким же

рКа, какое было найдено из рН-зависимости активности фер-

мента [221],