Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 401

Вполне разумным с химической точки зрения является сле-

дующий механизм:

\ I / \ 1 /

С ^=^ О О

НО |

н-о »

HCOJ

(12.52)

\ I / \ I /

; н

,о

iv щ

н н

Любой механизм, в котором предполагается, что в роли суб-

страта в реакции выступает

НСОз,

требует,

чтобы на каком-то

этапе от фермента отщепился протон и высвободился в

среду.

На

схеме

(12.52)

этот процесс происходит на стадии IV

-*•

I. В рас-

творе, не обладающем необходимой буферной емкостью, ско-

рость переноса протона слишком мала, чтобы регенерировать

свободный фермент. Так, например, из данных табл. 4.2 видно,

что константа скорости переноса протона от основания с рКа =

7 на молекулу воды равна

2,5-10

с-

, а на гидроксил-ион при

концентрации

10~

М и рН

7—2,3-10

с~

;

эти величины значи-

тельно ниже числа оборотов 5-Ю

с-

при этом же рН. Данное

противоречие нельзя разрешить, предположив, что на стадии

III-»-IV ион цинка связывается не с молекулой воды, а с

ОН~-группой. Максимальное значение константы скорости вто-

рого порядка равно

~10

—10"

М-'с-

(гл. 4, часть 2), что при

концентрации

гидроксил-иона 10~

дает

для этой стадии при

рН

7 предельное значение константы скорости 10

— 10

с~'.

Аналогичные расчеты показывают, что недиссоциированная кис-

лота Н

СО

тоже не может служить субстратом в реакции де-

гидратации, поскольку ее концентрация при рН 7 низка по

сравнению с концентрацией НСО~ [216, 222]. Если бы

СО

служила субстратом, то ни поглощения протона, ни вы-

свобождения его в

среду

не происходило бы. Однако простой

расчет показывает, что такие значения констант скорости пере-

носа можно объяснить

даже

теми низкими концентрациями бу-

феров, которые обычно используются (см. табл. 4.2) [216, 223],

402

ГЛАВА

Недавно

это

положение было проверено

ходе

экспериментов

применением

растворов,

не

обладающих буферной емкостью:

скорость реакции дегидратации оказалась аномально низкой.

Добавление

10 мМ

буфера приводит

восстановлению макси-

мальной скорости

[224, 225].

Дополнение.

настоящее время установлена кристалличе-

ская

структура

комплекса карбоангидразы

человека

конку-

рентным

ингибитором

—

имидазолом [Kannan

К- К-,

Petef

М.,

Fridborg

К.,

Cid-Dresdener

H.,

Lovgren

S.,

FEBS Letts.,

73, 115

(1977)]. Этот находящийся

гидрофобном кармане имидазол

через атом азота связан координационной связью непосред-

ственно

ионом цинка. Наиболее интересно, по-видимому,

то,

что

он

является пятым лигандом цинка

и не

вытесняет связан-

ную

с ним

молекулу воды

или

ОН~-группу.

По

аналогии

этим

предполагается,

что

атом кислорода двуокиси

углерода

также

непосредственно присоединяется

атому цинка

и не

вытесняет

воду.

Таким образом,

цинк

не

только ориентирует молекулу

СО

поляризует

ее, но и

поставляет связанную

с ним

нуклео-

фильную молекулу воды:

(Glu-Шб)—С

О"--Н (Thr-199)

(12.52а)

—

Увеличение координационного числа цинка

до

пяти

при

связы-

вании

субстрата аналогично предполагаемому увеличению

ко-

ординационного

числа

для

алкогольдегидрогеназы

из

печени

лошади [схема

(12.4)]

[15].

Авторы

этой работы указывали,что

связанная

молекула воды образует водородную связь

гидро-

ксильной

группой остатка Thr-199, который

свою очередь

свя-

зан

водородной связью

карбоксильной группой Glu-106.

Это

заставляет взглянуть

на

проблему идентификации группы,

ионизирующейся

с рК

= 7, с

другой

стороны. Возможно, этой

группой является карбоксильная группа Glu-106,

p/C

которой

существенно возрастает

при

изменении окружения,

а не

связан-

ная

цинком молекула воды. Если

это так, то

нуклеофилом

СТРУКТУРА

И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 403

является не гидроксил-ион, как это изображено на

схеме

(12.52,а), а неионизированная молекула воды, активируемая

остатком Glu-106 по механизму общего основного катализа при

участии гидроксила остатка

Thr-199.

Ж.

Гликолитические

ферменты

Большинство

гликолитических ферментов получено в кри-

сталлическом виде, и их кристаллическая

структура

установле-

на.

Современное состояние рентгеноструктурных исследований в

этой

области было освещено Блэйком [226]. К сожалению, ами-

нокислотная

последовательность установлена только для

нескольких ферментов. Два из них — лактатдегидрогеназа и

глицеральдегид-3-фосфат—дегидрогеназа — были рассмотрены

ранее,

в разд. А. Здесь мы остановимся лишь на отдельных

интересных вопросах, связанных с некоторыми из этих фермен-

тов.

1. Триозофосфатизомераза

[227—229]

Триозофосфатизомераза весьма эффективно катализирует

взаимопревращения

D-глицеральдегид-З-фосфата и диоксиаце-

тонфосфата:

сн

он

Н—С—ОН

*=fc

С=О (12.53)

СН

ОРОГ

СН

ОРО

Кристаллическая

структура

фермента из мышц цыпленка была

установлена с разрешением 2,5 А [230—231]. Фермент является

симметричным димером с мол. весом 53 000, каждая из иден-

тичных цепей которого содержит 247 аминокислотных остатков.

Никаких

указаний на наличие какой-либо кооперативности

между

субъединицами в процессе катализа не зыявлено.

а.

Структура

фермент-субстратного

комплекса

Указанный

фермент предоставляет ученым редкую возмож-

ность прямо исследовать фермент-субстратный комплекс с по-

мощью рентгеноструктурного анализа. Катализируемая реакция

представляет собой простое равновесное взаимопревращение

субстрата и продукта, причем константа равновесия реакции

404

ГЛАВА

(~20)' такова, что равновесие сильно сдвинуто в сторону обра-

зования

диоксиацетонфосфата. Это позволило установить кри-

сталлическую

структуру

комплекса фермента с ацетонфосфатом

с разрешением 6 А, воспользовавшись разностным Фурье-мето-

дом;

субстрат

проникал внутрь кристаллов фермента с помощью

диффузии [230, 232]. Удалось не только локализовать некоторые

конформационные

изменения в ферменте, но и определить поло-

жение субстрата относительно

двух

кислотно-основных катали-

тических групп фермента и выяснить механизм реакции. Из

исследований фермента в растворе известно (см. ниже), что

реакция

протекает через образование промежуточного соедине-

ния

цис-ентола

[232, 234] с переносом протона при участии

одного основания, возможно, карбоксильной группы остатка

Glu-165 [235—237]. Согласно рентгеноструктурным данным,

карбоксильная

группа глутаминовой кислоты располагается на

одинаковом расстоянии от С-3- и С-2-атомов субстрата, что

обусловливает перенос протона

между

ними. Установлено так-

же, что имидазольное кольцо His-95 находится на равном рас-

стоянии

от карбоксильного и гидроксильного кислорода, что

также обеспечивает перенос протона от одного из этих атомов на

другой.

2. Эксперименты с использованием в качестве меток

дейтерия и трития и механизм действия ферментов,

катализирующих кето-альдольную изомеризацию

Одним из наиболее важных методов исследования механиз-

ма действия ферментов,

участвующих

в переносе водорода

между

двумя углеродными атомами, состоит в использовании

изотопов водорода. Эти эксперименты с каждым годом стано-

вятся

все сложнее, и, чтобы лучше в них разобраться, стоит

рассмотреть их в ретроспективном плане.

В растворе такие субстраты, как

альдегид

и кетон, частично гидрати-

рованы:

R\ R\ /ОН

;с=о + н

о ?=± \/

W Х)Н

При

25° С около 55% диоксиацетонфосфата и 3,3% глицеральдегид-3-фосфа-

та находятся в негидратированных кетоформах, которые и являются суб-

стратами в ферментативных реакциях. Константа равновесия для процесса

взаимопревращения негидратированных кетоформ равна поэтому 330, причем

преобладающей формой является негидратированная кетоформа диоксиаце-

тонфосфата [Trentham D. R., McMurray С. Н., Pogson С. I., Biochem. J. 114,

19 (1969); Reynolds S. J.,

Yates

D. W., Pogson C. I., Biochem. J., 122, 285

(1971)].

СТРУКТУРА

МЕХАНИЗМ

ДЕЙСТВИЯ

ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 405

а.

Обмен

протонов

со

средой:

ендиол

в качестве

промежуточного

соединения

[233, 238—240]

Первые эксперименты, проведенные в водных растворах,

обогащенных дейтерием или тритием, показали, что в продукты

реакций,

катализируемых маннозо-6-фосфат-, глюкозо-6-фос-

фат-, рибозо-5-фосфат- и триозофосфатизомеразами, стереоспе-

цифически

включается до одного моля изотопа.

\с^

н—с—он

Е.

(12.54)

н-с—он

•> с=о

R R

Всегда считалось, что результаты этих экспериментов исключа-

ют возможность прямого переноса гидрид-иона и указывают на

образование протонов, которые

могут

обмениваться со средой.

Было

высказано предположение, что в качестве промежуточного

соединения

образуется ендиол

RC(OH)=C(OH)H

[238].

б.

Выявление

внутримолекулярного

переноса

протона:

цис-ендиол

участие

переносе

только

основания

[234]

Следующим достижением было выявление того факта, что

помимо

обмена протона со средой, происходит внутримолеку-

лярный

перенос водорода (трития) между двумя углеродными

атомами:

Н Н

.о I I

с^

н—с—он т—с—он

E, Н

О | [

Т—С—ОН * С=О + (некоторое С=О

(12.55)

| количество) |

R R R

Проще

всего объяснить это явление следующим образом. Три-

тий,

связанный с С-2-атомом субстрата, переносится на катали-

зирующее основание; некоторое количество трития, прежде чем

перейти на С-1-углеродный атом, обменивается с протонами во-

ды, а остальная часть атомов включается в положение С-1 до

того, как успеет высвободиться в раствор. Из этого можно

сделать два важных вывода:

1. Перенос осуществляется только основанием (если, ска-

жем, основание «отбирало» бы протон от атома С-2, а отдель-

ный

остаток кислоты переносил свой протон на С-1, то никакого

переноса не происходило бы).

406

ГЛАВА

2. Поскольку в переносе протона

участвует

только основание,

протон

должен вновь присоединиться к ендиолу с той же сторо-

ны,

с которой был удален. Из рассмотрения стереохимии про-

дуктов

следует,

что ендиол является ц«с-изомером (гл.2,

разд. В). На этом основании Роуз предложил следующий

механизм [228, 248]:

T-i-C—

ОН

В:

—Н

с—он

В:

С=О

Т—С—ОН

(12.56)

В:

С=О

Н—С—ОН

Рис.

12.13. Энергетический профиль реакций, катализируемых триозофосфат-

изомеразой [244]. S — диоксиацетонфосфат, Z — ендиол, Р — глицеральдегид-

3-фосфат. Штрих-пунктирная линия относится к случаю, когда частота со-

ударений определяется диффузией. Энергетические барьеры для бимолекуляр-

ных реакций рассчитаны для концентрации реагентов 40 мкМ, что примерно

соответствует

концентрации диоксиацетонфосфата в клетке. Отметим, что Вы-

сота

всех

энергетических барьеров такая же (или немного больше), как и в

случае

ассоциации фермента и

субстрата.

Дальнейшее увеличение скорости в

результате

эволюции фермента невозможно. Этот фермент полностью

удовле-

творяет требованиям, предъявляемым к эволюционно совгршенному ферменту

(ГЛ.

10, разд. Б.2): значение fccat/Км близко к лимитируемому диффузией

пределу,

а Км много больше [S].

Основание

В в механизме действия триозофосфатизомеразы

представляет собой карбоксильную группу Glu-165. Роль

His-95 до конца не выяснена: его ионизация не выявляется из

рН-зависимости

&cat- (График зависимости k

\/Kn от рН для

СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

фермента из мышц цыпленка представляет собой колоколооб-

разную кривую, характеризующуюся рКа = 6 и 9,

тогда

как

рН-зависимость

изображается сигмоидной кривой, в кото-

рой

проявляется только более низкое значение рКа [241].

рН-зависимость

kcat/Км

для фермента, выделенного из дрож-

жей, также описывается сигмоидной кривой, отражающей

ионизацию

группы с более низким значением р/(

[242].

рН-зависимость

скорости химической модификации Glu-165 по-

казывает, что р/(а этого остатка равен 3,9 [242, 243]; см. гл. 5,

разд. Б.2.в и гл. 7, разд. Ж)

в.

Построение энергетического профиля для реакции [244]

Самое последнее достижение в исследовании указанных вы-

ше реакций с применением радиоактивных изотопов состоит в

исчерпывающем анализе обмена тритием

между

водой и про-

дуктом и остающимся субстратом в стационарных условиях,

обмена тритием

между

меченным тритием субстратом и раство-

ром и продуктом, а также первичных кинетических изотопных

эффектов

для скорости реакции. Из этих данных удалось опре-

делить все константы скорости для механизма

(12.56)

и постро-

ить энергетический профиль для реакции, катализируемой трио-

зофосфатизомеразой (рис. 12.13).

3. Глюкозо-6-фосфат—изомераза [228, 229]

Другой гликолитический фермент, D-глюкозо-б-фосфат—изо-

мераза, катализирует взаимопревращение

между

глюко-

зо-6-фосфатом и фруктозо-6-фосфатом. Кристаллическая струк-

тура

фермента, выделенного из мышцы свиньи, была установ-

лена с разрешением 3,5 А. Фермент является симметричным

димером с мол. весом 120 000 [245].

Последовательность реакций, катализируемых глюко-

зо-6-фосфат—изомеразой, более сложна, чем в

случае

триозо-

фосфатизомеразы.

В растворе сахара

существует

в виде цикли-

ческих полуацеталей, представляющих собой равновесную смесь

а- и р-аномеров (глюкозо-6-фосфат на 38% представлен сс-фор-

мой

и на 62% —реформой; для фруктозо-6-фосфата эти величи-

ны

составляют 20 и 80% соответственно) [228]. Субстрат, уча-

ствующий в реакции изомеризации, находится в раскрытой

форме [246—248]. В растворе эта форма присутствует лишь в

очень небольшом количестве, и, следовательно, первая стадия

реакции

представляет собой катализируемое ферментом рас-

крытие кольца. а-Аномер реагирует быстрее р-аномера, однако

оба они

участвуют

и образуются в

ходе

реакции.

408

ГЛАВА

-О

РОН

но

I— .

он

р-Д-глюкозо-

фосфат

сно

он

но-f-

OJPOHJC

-он

но

он

(12-57)

а-П-глюкозо-6-фоофш

-О

РОН

С^О\

ОН

но

сн,он

он

f-П-фруктозо-б-фосфат

сно

=о

НО—

-он

СН

ОРО

*^ч

но/он

он

(12.58)

a-D-

фруктозо-6-фосфат

Реакция

протекает следующим образом [228, 234]:

aG-6-P

«F-6-P

Н /

НО Н ОН Н I ^ОН

С.

цно-Ендиол

,с

R''

OH R

ОН R

с=о

(12.59)

,с

/ЗС-б-Р

***t

R'' 1

ОН

СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ

ФЕРМЕНТОВ

409

Фермент не превращает маннозо-6-фосфат в фруктозо-6-фос-

фат, а катализирует раскрытие кольца, в

результате

чего

а-аномер переходит в fj-аномер со скоростью, примерно равной

скорости изомеризации глюкозо-6-фосфата [249].

Производные маннозы отличаются от производных глюкозы

положением атома водорода и ОН-групп, связанных с С-2-ато-

мом. Вследствие этого, вероятно, атом водорода вытесняется из

основания,

которое катализирует образование цис-ендиола в хо-

де реакции (12.59).

Скорость реакции изомеризации зависит от присутствия ос-

новной

группы с р/Са = 6,8 и кислой группы с рКз = 9,3 в

свободном ферменте [250]. Исходя из данных по теплотам изо-

меризации было высказано предположение, что эти значения

рКа относятся к имидазольной и аммонийной боковым цепям

остатков гистидина и лизина соответственно [250]. Остаток глу-

таминовой кислоты модифицируется эпоксидом

1,2-ангид-

po-D-маннитол-б-фосфатом (гл. 7, разд. Ж) [251]. Все эти дан-

ные в совокупности с результатами кристаллографического ана-

лиза позволили сформулировать механизм действия фермента.

Интересно,

что при этом аминокислотная последовательность

глюкозо-6-фосфат—изомеразы все еще не установлена, и, следо-

вательно, боковые цепи аминокислот не

могут

быть четко иден-

тифицированы.

РСН

уА °\ОН

он но^|

$-о-Маннозо-6-фосфат

сно

но-

-он

—он

СН

ОРОГ

-O

POHjC

(12.60)

а-и-Маннозо-6-фосфат

Кристаллическая

структура

комплекса

между

ферментом и

эффективным

ингибитором арабинонат-5-фосфатом установлена

410

ГЛАВА

с-с

•А

ОРОГ

он

ОН

с-о

С°

кон

с=о

он

В:

с=о

с,-о

I:-

он

ОРО?

он

В:

Рис.

12.14.

Механизм действия глюкозо-6-фосфат— изомеразы, основанный

на

данных рентгеноструктурного анализа [252].

с разрешением 3,5 А [252]. Это соединение сходно с промежу-

точным соединением цис-ендиолом [схема

(12.61)]

и связывает-

ся

в 1000 раз прочнее субстрата [253].

ОРОГ

но

ОРОГ

но

он

О"

(12.61)

Арабинонт-5-фосфат

О"

цис-Ендиол

ОН