Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

КООПЕРАТИВНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ ЛИГАНДОВ 271

образовании солевых мостиков, выше, чем обычно, из-за при-

сутствия карбоксилат-ионов (гл. 4). Разрушение мостиков со-

провождается уменьшением р/Са и высвобождением протонов.

Вызывает удивление, почему связывание с кислородом со-

провождается столь сильными структурными изменениями в ге-

моглобине. Дело в том, что природа создала остроумный триг-

герный механизм. Ион

в дезоксигемоглобине находится в

высокоспиновом

состоянии, и его радиус слишком велик, чтобы

ион

мог располагаться в плоскости порфиринового кольца гема

(рис.

8.12).

При связывании О

ион

переходит в низкоспи-

новое состояние, и его радиус уменьшается на 13%- Теперь

может занять энергетически выгодное положение в плоскости

порфиринового

кольца и перемещается приблизительно на 0,6 А.

Это вызывает перемещение гистидина, связанного с

что

сопровождается конформационными изменениями молекулы ге-

моглобина [3, 26].

СПИСОК

ЛИТЕРАТУРЫ

Adair

G. S., J. biol. Chem., 63, 529 (1925).

Monod

J.,

Changeux

J.-P.,

Jacob

F., J. molec. Biol., 6, 306 (1963).

Perutz

M. F., Nature, Lond., 228, 726 (1970).

Monod

/., Wyman J.,

Changeux

J.-P.,

J. molec. Biol., 12, 88 (1965).

Koshland

D. E., Jr., Nemethy G.,

Filmer

D., Biochemistry, 5, 365 (1966).

Eigen

M., Nobel Symposium, 5, 333 (1967).

Herzfield

J., Stanley H. E., J. molec. Biol., 82, 231 (1974).

8. Levitzki A.,

Stallcup

W. В.,

Koshland

D. E., Jr., Biochemistry, 10, 3371

(1971).

MacQuarrie

R. A.,

Bernhard

S. A., Biochemistry, 10,

2456

(1971).

10.

Irwin

M. J.,

Nyborg

J.,

Reid

B. R.,

Blow

D. M., J. molec. Biol., 105, 577

11.

Biesecker

G.,

Harris

J. /.,

Thierry

J. C, Walker J. E.,

Wonacott

A. J., Na-

ture,

Lond., 266, 328 (1977).

12.

Fersht

A. R., Mulvey R. S.,

Koch

G. L. E., Biochemistry, 14, 13 (1975).

13.

Bosshard

H. R.,

Koch

G. L. E.,

Hartley

B. S., Eur. J. Biochem., 53, 493

(1975).

14.

Conway

A.,

Koshland

D. E., Jr., Biochemistry, 7, 4011 (1968).

15.

Schlessinger

J., Levitzki A., J. molec. Biol., 82, 547 (1974).

16.

Fersht

A. R., неопубл. данные.

17. Hill R., Proc. R. Soc, B100, 419 (1925).

18. Rubin M. M.,

Changeux

J. P., J. molec. Biol., 21, 265 (1966).

19.

Edelstein

S., Nature, Lond., 230, 224 (1971).

20.

Kirschner

K.,

Gallego

E.,

Schuster

/.,

Goodall

D., J. molec. Biol., 58, 29

(1971).

21.

Perutz

M. F., Nature, Lond., 228, 734 (1970).

22.

Arnone

A., Nature, Lond., 237, 146 (1972).

23.

Arnone

A.,

Perutz

M. F., Nature, Lond., 249, 34 (1974).

24.

Chothia

C, Wodak S.,

Janln

/., Proc. natn. Acad. Sci., U. S A 73,

3793

(1976).

25.

Bohr

Hasselbach

K. A.,

Krogh

A., Skand. Arch. Physiol., 16, 402 (1904).

26.

Hoard

J. L., In: Hemes and homoproteins (eds, Chance В., Estabrook R. W.,

Yonetani Т.), Academic Press, p. 9 (1966).

Глава

СИЛЫ,

ДЕЙСТВУЮЩИЕ

МЕЖДУ МОЛЕКУЛАМИ,

ЭНЕРГИЯ ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

Важной особенностью ферментативного катализа является

то,

что фермент

связывает

субстрат

и реакция протекает в пре-

делах

фермент-субстратного комплекса. Чтобы

глубже

понять

причины,

обусловливающие прочность и специфичность этого

связывания,

мы рассмотрим взаимодействие

между

несвязан-

ными

атомами, применив эмпирический и феноменологический

подход. В частности, мы уделим большое внимание значению

энергии

взаимодействия. Нековалентные взаимодействия важны

не

только потому, что они ответственны за связывание. Как мы

увидим ниже (гл. 10), вместо того чтобы давать непосредствен-

ный

вклад в энергию связывания, эти взаимодействия понижают

энергию активации стадии химического превращения субстрата,

а кроме того играют важную роль в поддержании структуры

белка.

очевидным нековалентным взаимодействиям

между

ато-

мами относится электростатическое взаимодействие

между

за-

ряженными

группами. Но притягиваются

друг

другу

даже

неполярные

молекулы. На наличие такого взаимодействия как

на

одну из причин отклонения газов от идеальности указывал

столетие назад Ван-дер-Ваальс. Некоторые из взаимодействий

между

нейтральными молекулами газа хорошо изучены, и сей-

час известно несколько «соединений Ван-дер-Ваальса». Напри-

мер,

энергия связи

между

атомами в димерах благородных

газов Ne

, Аг

и Хе

равна 0,2; 0,92 и 2,2 кДж-моль-

(0,05; 0,22

0,53 икал-моль-

) соответственно [1].

А.

Нековалентные

взаимодействия

между

атомами

1. Электростатические взаимодействия

Все действующие

между

атомами и молекулами силы по

своей природе являются электростатическими,

даже

если речь

идет о неполярных молекулах. Однако мы сохраним название

ЭНЕРГИЯ

ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

273

«электростатическое» лишь

за

теми вазимодействиями, которые

имеют место

между

заряженными атомами

молекулами

или

между

диполями.

Из

всех

взаимодействий они изучены наиболее

хорошо,

и тем не

менее

их

количественная оценка зачастую

затруднена из-за невозможности точно определить диэлектри-

ческую проницаемость среды. Этот вопрос обсуждался

в гл. 2,

где указывалось,

что

энергия взаимодействия

между

двумя

положительно заряженными атомами азота

[530 кДж

(130 ккал)]

при

перенесении

их из

вакуума

воду

уменьшается

16 раз.

Окружающая водная среда поляризуется заряженны-

ми

атомами,

что

ведет

возникновению нейтрализующего поля.

Проведенные недавно расчеты показали,

что

эффективная

диэ-

лектрическая проницаемость

активном центре лизоцима равна

[2].

Существуют следующие типы электростатических взаимо-

действий:

а. Взаимодействие

между

ионами; энергия взаимодействия

обратно пропорциональна

г.

б.

Взаимодействие

между

постоянными диполями; энергия

взаимодействия обратно пропорциональна

в.

Взаимодействие

между

ионом

индуцируемым

им

диполем;

энергия

обратно пропорциональна

г.

Взаимодействие

между

постоянным диполем

индуцируе-

мым

им

диполем; энергия взаимодействия обратно пропор-

циональна

2. Неполярные взаимодействия (вандерваальсовы,

или

дисперсионные силы)

На

рис. 9.1

приведены типичные кривые потенциальной

энер-

гии

для

взаимодействия

двух

атомов. Характерной особенно-

стью этих кривых является резкое увеличение энергии отталки-

вания

при

сближении атомов

до

расстояния,

при

котором начи-

нается перекрывание

их

электронных облаков. Энергия взаимо-

действия изменяется обратно пропорционально двенадцатой

степени расстояния.

На эти

взаимодействия накладывается

энергия

притяжения, обусловленная главным образом

диспер-

сионными силами

Лондона.

Она

изменяется обратно пропорцио-

нально

шестой степени расстояния. Полная потенциальная

энер-

гия

определяется выражением

= А/г

В/г

(9.1)

В табл.

9.1

приведены некоторые полуэмпирические значения

параметров

А и В,

вычисленные

из

физико-химических данных;

эти

значения используются

при

расчете энергий взаимодей-

ствия.

274

ГЛАВА

Энергия взаимодействия

между

диполями обратно пропор-

циональна шестой степени расстояния. Дисперсионные силы

притяжения обусловлены взаимным индуцированием в молеку-

лах электростатических диполей. Хотя неполярная молекула не

0,4

аз

0,2

0,1

0,0

0,1 -

Вандерваальсово

межатомное

расстояние

Рис.

9.1. Энергия взаимодействия

между

двумя атомами водорода и двумя

(тетраэдрическими) атомами

углерода

в молекуле белка (по данным

табл. 9.1).

имеет постоянного дипольного момента, она обладает

мгновен-

ным дипольным моментом из-за локальных флуктуации элект-

ронной

плотности. Поскольку энергия зависит от индуцируемого

дипольного момента, важным фактором, определяющим силу

взаимодействия

между

любыми двумя атомами, является их

поляризуемость.

Межатомное расстояние, при котором энергия взаимодей-

ствия минимальна, является наиболее вероятным межатомным

ЭНЕРГИЯ

ФЕРМЁНТ-СУБСТРАТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

Взаимодействие

•••н

0-0=

•••N

•С

...с

б>

А.

ккал-моль~

-А~

4,609

•

1,537-10

2,963 •

2,284

•

2,399

•

В,

ккал'моль"

18,52

178,62

1,272

•

787,7

2,083 •

'•А-

275

Таблица

9.1

Значения

констант

А я В,

входящих

уравнение

(9.1)

а)

) Представленные полуэмпирические данные нолучены

из

известных

физико-химических свойств углеводородов, аминокислот

кристаллических

аминов

[2].

*>)

Атом

углерода карбонильной

или

карбоксильной группы.

расстоянием

называется вандерваальсовым

(van der

Waals'

contact

distance). Каждый атом имеет характерный вандер-

ваальсов радиус.

силу аддитивности оптимальное расстояние

Таблица

9.2

Вандерваальсовы

радиусы

для

некоторых

атомов

групп

Атом

или

группа

(гидроксил)

(карбонил)

О" (карбоксил)

(амид)

NHj

(аммоний)

(имидазолий)

СН

(тетраэдрический)

(тригональный)

СН

(в ароматических сое-

динениях)

Вандерваальсов

радиус,

1,2

1,5

1,5 «

1,5

1,55

1,65

б)

в)

1,55

1,85

»'

в)

1,7

б), в)

1,8

1,4

1,7

1,8

2,1

г)

1,8

г)

Минимальный

радиус,

1.3

1,5

1,45

1.5

) Минимальный радиус

белке; Levitt

M., J.

molec. Biol.,

82, 393

(1974),

> Bond!

A., J.

phys. Chem.,

68. 441

(1965); Brant D.

A.,

Flory

P. J., J. Am

chem.

Soc, 87, 2791

(1965).

)

Это

значение получено

учетом размеров присоединенного атома

водорода.

Warshel

A.,

Levitt

M., J.

molec. Biol.,

103, 227

(1976);

эти

значения

близки

значениям, отвечающим минимуму потенциальной энергии—в

пре-

дыдущей колонке приведены несколько меньшие величины.

276

ГЛАВА

между

двумя атомами равно сумме их вандерваальсовых ради-

усов. В табл. 9.2 приведены значения вандерваальсовых радиу-

сов,

полученные из данных рентгеноструктурного анализа. Кро-

ме того, здесь же приведены минимальные значения радиусов,

полученные из кривой потенциальной энергии и из данных по

гибкости белков. В табл. 9.3 приведены энергии взаимодействия

между

некоторыми атомами, находящимися на оптимальном

расстоянии

друг

от

друга.

Таблица

9.3

Энергия

дисперсионного

(вандерваальсова)

взаимодействия

между

различными

атомами

при

оптимальном

расстоянии

между

ними

[2]

Взаимодействующие

атомы

Н---Н

=0-0=

N---N

С---С

г* а)

Энергия

кДж-моль—

0,0778

0,217

0,572

0,284

1,891

ккал-моль

0,0186

0,0519

0,1366

0,0679

0,4519

)

Атом

углерода

карбонильной

или

карбоксиль-

ной

группы.

Хотя вандерваальсовы силы довольно слабые, они, суммиру-

ясь

по всей молекуле, вносят значительный вклад в связывание.

Так,

например, согласно данным по теплотам сублимации, вклад

связывание каждой метильной группы в кристаллическом

угле-

водороде составляет 8,4 кДж-моль-

(2 ккал-моль-

), а для

СН-групп кристаллического бензола эта величина равна

6,7 кДж-моль-

(1,6 ккал-моль-

) [3]. По расчетам энергия

вандерваальсова взаимодействия

между

подцентром D актив-

ного центра лизоцима и расположенным в нем глюкопира-

нозным

кольцом составляет около

—58,5

кДж-моль-

(—14 ккал-моль-

) [2].

3. Водородная связь

В биологических системах роль водородной связи чрезвы-

чайно

велика. Эта связь образуется

между

двумя электроотри-

цательными атомами (одним из которых обычно является кис-

лород), связанными с одним и тем же протоном. В интересую-

щих нас системах водородные связи асимметричны — расстоя-

ЭНЕРГИЯ ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

277

ние

между протоном

атомом,

которому

он

формально

присоединен, соответствует длине нормальной ковалентной

свя-

зи,

расстояние

до

другого

атома несколько меньше длины

вандерваальсова контакта. Оптимальным

для

водородной связи

является линейное расположение атомов, однако отклонение

от

линейности приводит лишь

небольшому проигрышу

энергии.

При

образовании водородной связи между >]МН-группой

карбонильным кислородом

кристаллическом амиде расстояние

O...N обычно составляет

2,85—3,00

А, а

расстояние О...Н

— от

1,85 до 2,00 А [4, 5].

Изменение потенциальной энергии

изме-

нением расстояния между атомами

N и О

носит такой

же ха-

рактер,

что и

изменение энергии

для

атомов

Н—Н и С—С

(рис.

9.1);

минимальное расстояние,

на

которое сближаются

эти

атомы, составляет

2,4—2,5

А. При

образовании водородной

свя-

зи

НгО ...

Н—ОН расстояние между атомами кислорода

со-

Таблща

9.4

Энергии

дисперсионного

электростатического

взаимодействия

Кристалл

Бензол

и-Гексан

к-Пентан

Перилен

Фенантрен

Адипамид (четыре

водородные связи)

Формамид (две водо-

родные связи)

Малонамид (четыре

водородные связи)

Оксамид (четыре во-

дородные связи)

Сукцинамид (четыре

водородные связи)

Мочевина (три водо-

родные связи)

некоторых

кристаллах

Расчитанные энергии

дисперсионное

взаимодействие

моль

-42

-54

-42

-119

-85

-86

—24

-52

-45

-65

-28

моль

ккал>

-9,9

-12,9

—

10,0

-28,4

-20,3

—20,6

-5,7

-12,3

—

10,8

-15,5

—6,7

электростатическое

взаимодействие

)

моль

-5,4

—2,5

—4,2

—77

-43

-81

-60

-76

-65

моль

ккал-

—

1,3

—0,6

—

1,0

—

18,4

-10,3

—

19,4

—

14,4

—

18,2

—

15,6

Наблюдаемая

теплота

сублимации

моль

—44,8

—50,2

—43,9

-125,5

-91,8

-73,2

— 120,5

-118,0

-135,2

—92,8

ккал-

-10,7

-12,0

—

10,5

—30

-21,7

—

-17,5

-28,8

-28,2

—32,3

-22,2

а) Электростатическое взаимодействие обусловлено водородными связями. Энергии

рассчитаны

из

эмпирических энергетических функций

(см.

табл.

9.3).

Levitt

M.,

Lifson

личное сообщение.

278

ГЛАВА

ставляет 2,76 А, а расстояние

между

атомами О и

Н—1,77

А.

Согласно многочисленным оценкам, энергия водородных

связей

лежит в диапазоне 12—38кДж-моль~' (3—9 ккал-моль-

)

[4, 6]. Так, для связи

NH...0

между

двумя амидными группами

эта энергия, рассчитанная по данным табл. 9.4, составляет

21 кДж-моль-' (5 ккал-моль-

) [3]. Связи, характеризующиеся

такой

энергией, имеют особое значение, поскольку они доста-

точно стабильны, чтобы обеспечить связывание, и в то же время

прочность их невелика, что обусловливает быструю диссоциа-

цию.

Если энергия активации, необходимая для разрыва связи,

целиком

определяется прочностью этой связи, то ее можно рас-

считать, воспользовавшись теорией переходного состояния, со-

гласно которой связи с энергией 12,5, 25,0 и 37,5 кДж-моль-

(3,

6 и 9 ккал-моль-

) разрываются с константами скорости

4-Ю

, 3-10

и 2-10

с"

соответственно.

NH-группы

полипептидного остова фермента не только уча-

ствуют

в связывании субстрата, но и играют роль сольватной

оболочки для отрицательных зарядов, образующихся в пере-

ходном состоянии. В частности, в гл. 1 указывалось, что в

сериновых протеазах имеется центр связывания карбонильного

кислорода субстратов, состоящий из

двух

NH-rpynn полипеп-

тидного остова. В переходном состоянии кислород приобретает

отрицательный заряд и стабилизируется дипольными момента-

ми

амидных групп.

4. Гидрофобная связь [7, 8]

Понятие

«гидрофобные силы» используется при описании

тенденции

неполярных соединений, например углеводородов,

переходить из водной фазы в органический растворитель. Этот

эффект

обусловлен не столько прямым взаимодействием

между

растворителем и растворенными молекулами, сколько пере-

стройкой

системы водородных связей в воде в

результате

при-

сутствия гидрофобного соединения. Чтобы сохранить число во-

дородных связей, каждая из которых имеет энергию

~25 кДж-моль-

(6 ккал-моль-'), молекулы воды распола-

гаются вокруг неполярной молекулы. Поэтому гидрофобное со-

единение не вызывает больших изменений энтальпии раствори-

теля, но приводит к уменьшению его энтропии из-за увеличения

локальной

упорядоченности.

Вода

стремится вновь увеличить

свою энтропию, вследствие чего гидрофобная молекула вытес-

няется

в гидрофобную область белка.

Удобный способ оценки гидрофобности соединения состоит в

измерении

распределения его

между

органической и водной

фазами

при встряхивании в смеси нерастворимого в воде орга-

нического растворителя (как правило, н-октанола) с водой.

ЭНЕРГИЯ

ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

279

Распределение растворенного вещества

между

двумя фазами

зависит от исхода конкуренции

между

гидрофобными участками

молекулы, стремящимися слиться с органической фазой, и по-

лярными участками, которые стремятся перейти в водную фазу

с образованием сольватной оболочки.

а.

Гидрофобность

малых

групп:

уравнение

Ганча

[9, 10]

Исследуя распределение замещенных соединений

между

н-

октанолом и водой, Ганч с сотрудниками установил, что многие

заместители вносят постоянный и аддитивный вклад в гидро-

фобность растворенного соединения. Если отношение раствори-

мости исходного соединения в органической фазе к растворимо-

сти его в водной фазе обозначить через Ро, а аналогичное отно*

Таблица 9.5

Значения

я для

некоторых

групп

Группа

СНз—

СНзСН

—

СНз (СН

)

—

СНз (СН

)

—

СНз (СН

)

СНзч

~)сн—

СН

2Чх

PhCH

—

—ОН

)

—NHCOCH^

—ОСОСН*>

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

1,3

1,8

2,63

-1,16

-1,21

-0,27

Энергия

Гиббса для переноса

данной

группь

из н-октанола

воду

КДЖ'МОЛЬ~'

2,85

5,71

8,56

11,41

14,26

7,42

2,45

15,00

—6,62

—6,90

-1,54

ккал.моль

0,68

1,36

2,05

2,73

3,41

1,77

10,27

3,59

-1,58

-1,65

-0,37

' Относительно атома водорода.

> Hansch С, Coats E., J. Pharm. Scl., 59, 731 (1970).

' Связаны с алифатическими соединениями.

280

ГЛАВА

шение

для замещенного соединения — через Р, то константа

гидрофобности я

будет

равна

= lg(P/P

). (9.2)

В табл. 9.5 приведены значения я для некоторых групп. Отме-

тим несколько важных моментов.

1. Значения л для групп, не являющихся сильными донора-

ми

или акцепторами электронов, фактически постоянны и не

зависят от характера группы, к которой они присоединены. Бо-

лее того, имеет место аддитивность: так, для метиленовой груп-

пы

значение л равно 0,5 и присоединение каждой последующей

группы увеличивает значение этой величины на 0,5. Изменение

логарифма на 0,5 единицы соответствует изменению свободной

энергии

Гиббса на 2,84 кДж-моль-' (0,68 ккал-моль-

). (В дан-

ном

контексте замещение водорода на метильную группу равно-

сильно

добавлению метиленовой группы, поскольку этот процесс

можно рассматривать как встраивание метиленовой группы

между

атомом водорода и остальной частью молекулы.)

2. Поведение групп, которые

могут

присоединяться к бен-

зольному кольцу (например, нитро- и аминогрупп), зависит от

других

связанных с кольцом групп.

б.

Гидрофобность

изменяется

изменением

площади

поверхности

[11—14]

Существует эмпирическая зависимость

между

площадью по-

верхности гидрофобной боковой цепи аминокислоты и энергией

Гиббса для переноса этой цепи из водной фазы в органический

растворитель. 1 А

поверхности соответствует гидрофобной

энергии

80—100

Дж-моль"

(20—25

кал-моль-

). (Площадь по-

верхности группы определяется исходя из суммы вандервааль-

совых радиусов воды и внешних атомов этой группы.)

Корреляцию

между

площадью поверхности и гидрофобно-

стью можно объяснить, исходя из простой модели, в которой

рассматривается энергия образования в воде полости. Поверх-

ностное натяжение воды равно 72 дин-см-

, поэтому для обра-

зования

полости с площадью поверхности 1 А

необходимо за-

тратить энергию 72-Ю-

эрг, или

7,2-10-

Дж

(1,72-10"

кал).

Умножение этой величины на число

Авогадро

дает

435 Дж-А^-моль-

(104 кал-А-

-моль"

). Итак, образование в

воде полости, которую могла бы занять гидрофобная группа,

обходится в 435 Дж-А~

-моль-'. Эта величина может быть

несколько

больше из-за увеличения дисперсионной энергии вза-

имодействия воды с растворенным веществом при заполнении

полости и изменяется с изменением площади поверхности.