Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

241

с одинаковой скоростью, либо диссоциация происходит после

завершения лимитирующей стадии. Если бы высвобождение,

скажем, ADP было медленным и являлось лимитирующим, то вы-

свобождение Р носило бы двухстадийный характер, и наоборот.

ходе

специальных экспериментов была определена константа

скорости диссоциации комплекса Si.ADP; она оказалась равной

1,4 с~'.

ТиоИР

быстро связывается со свободным Si, что сопро-

вождается спектральными изменениями. При смешивании из-

бытка тио1ТР с комплексом Si.ADP образование

SI.THOITP

лимитируется диссоциацией Si.ADP и, следовательно, скорость

диссоциации Si.ADP определяется просто.

3. Двухстадийные процессы связывания АТР и ADP,

выявляемые методом остановленной

струи

[65]

с регистрацией флуоресценции триптофана

При

низких концентрациях АТР связывается с Si с

кажу-

щейся константой скорости второго порядка, равной

400-

[Начальный

наклон

М''С'

0,5

[АТР], мМ

Рис.

7.10. Константы скорости процесса увеличения интенсивности флуорес-

ценции

фрагмента S

при смешивании с АТР, взятой в различных концентра-

циях; смешивание проводилось в устройстве, применяемом в

методе

останов-

ленной

струи

[65].

1,8-10

М-'с-

. Это на два порядка ниже константы скорости

лимитируемой диффузией реакции и указывает на то, что, воз-

можно, связывание происходит в две стадии. Измерения при

242

ГЛАВА 7

более высоких концентрациях подтверждают

это

предположе-

ние

(рис.

7.10).

Показано,

что

имеется начальная, быстрая ста*

дия,

находящаяся

за

пределами разрешения метода останов-

ленной

струи, сопровождающаяся изомеризацией

со

скоростью

400

-1

Константы

k\/k~\ можно определить

из

концентра-

ционной

зависимости констант скорости

так, как

описано

в гл. 4.

Аналогичные данные были получены

и при

исследовании

свя-

зывания

ADP. При

низких концентрациях константа скорости

второго порядка

для

связывания

ADP

равна

1,5-

при

высоких скорость выходит

на

плато

становится равной 400с-

что свидетельствует

наличии стадии изомеризации, характе-

ризующейся константой

k-e.

Константа

/г_

слишком мала, чтобы

ее

можно было прямо

измерить.

опытах

по

катализируемому фрагментом

синтезу

[

Р]АТР

[

Р]ортофосфата

для нее

были получены значе-

ния

3- Ю-

с-

и 2- Ю-

с-

[66, 67].

4. Равновесие

между

М*.АТР

M**.ADP.P

Эта стадия исследовалась

помощью смешивания избытка

фермента

[у

Р]АТР

измерения концентраций [у

Р]АТР

[

Р] ортофосфата методом остановленной струи

[63].

Равнове-

сие

на

поверхности фермента быстро устанавливается

медлен-

но

нарушается

по

мере того,

как

M**.ADP. [

P]P изомеризу-

ется

образованием M\ADP[

P]P

со

скоростью

0,06 c~'.

5. Измерение светорассеяния

При

полимеризации актина

(мол. вес 42 000)

образуются

крупные агрегаты. Каждый мономер может связать один моль

фрагмента

S! (мол. вес 115

000),

образующийся

результате

актомиозиновый комплекс (акто-Si) имеет приблизительно

в три

раза большую массу. Этот процесс сопровождается увеличением

мутности раствора, поскольку светорассеяние связано

массой

полимера. Стимулируемое

АТР

высвобождение

Sj из

комплекса

можно исследовать, наблюдая

за уменьшением

мутности

рас-

твора.

Для

этого прменяют метод остановленной струи

регист-

рацией оптической плотности. Более чувствительным, однако,

является метод регистрации флуоресценции, поскольку

этом

случае

измерения проводятся

под

прямым

углом

падающему

световому пучку

(гл. 6) [69]«

КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

243

Е. Фосфофруктокиназа: определение аномерной

специфичности методом остановленной струи,

замороженной струи и с помощью использования

субстратов с фиксированной конфигурацией

Фосфофруктокиназа катализирует фосфорилирование фрук-

тозо-6-фосфата до фруктозо-1,6-дифосата. В растворе

субстрат

существует

в виде смеси

двух

аномеров — а(20%) и р(80%),

переходящих один в

другой

через образование открытой кето-

формы.

D-фруктозо-б-фосфат + АТР

0-фруктозо-1,6-дифосфат

+ ADP.

(7.21)

РОСН

сн

он

сн

он

Т~0%)

"О

РОСН

:н

он

(7.22)

а-Аномвр

(~20%)

Применение

методов исследования быстрых реакций, позволяю-

щих измерить скорость взаимопревращений аномеров, показало,

что фермент специфичен к р-аномеру. К такому же выводу

привело и определение активности фермента по отношению к

активности модельных субстратов, фиксированных в одной из

этих конфигураций. При использовании достаточных количеств

фермента, позволяющих фосфорилировать весь активный ано-

мер прежде, чем

между

а- и р-формами установится новое рав-

новесие, выявилось, что 80% данного субстрата реагирует быст-

ро,

а остальные

20%—с

константой скорости аномеризации

этого субстрата. Кинетика процесса исследовалась методом за-

мороженной струи с применением [у

Р]АТР [70] и с помощую

спектрофотометрического анализа реакции

(7.19)

171]. Исполь-

зовались также данные стационарной кинетики с применением

244

ГЛАВА

следующих

субстратов

[72]:

о-

НО^-Ч-ОН,

-СН

ОН) У„.

=100%, К

0,043

НМ

он

а$--о-фруктозо-Ь-фосфат

-O

POCH

«•О

НО

он"

%5-ангидро-т>-маннитол-\-фосфат

(фиксированный

р,-конфигурации)

'О

РОСН

СН

ОН

1&-ангидро-П-

глюцитолЛ-фосфат

{фиксированный

а-конфигурации)

(Конкурентный

ишибитор)

2,5-ангидро-О-маннитол-1-фосфат может находиться только

в одной фиксированной конфигурации, аналогичной конфигура-

ции

р-аномера D-фруктозы. В этом соединении в положении

отсутствует

ОН-группа и оно не способно принять конфигура-

цию,

аналогичную конфигурации сс-аномера, поскольку кольцо

не может раскрыться. С

другой

стороны, производное глюцитола

всегда

имеет конфигурацию, аналогичную конфигурации сс-ано-

мера. Из анализа значений

и /См (или Ki) видно, что,

хотя

с ферментом связываются оба соединения, только р-аномер свя-

зывается продуктивно и фосфорилируется.

Ж.

Аффинные метки [73]

Аффинная метка или, иначе говоря, необратимый ингибитор

активного центра, представляет собой химически активное со-

единение, близкое по своей

структуре

субстрату.

Это соедине-

ние

специфически связывается с активным центром фермента и

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

245

образует ковалентные связи с аминокислотными остатками бел-

ка

[74—76]. Аффинные метки очень полезны для идентифика-

ции

аминокислотных остатков,

участвующих

в катализе, и при

определении р/С

из рН-зависимости скорости модификации.

E + I *J± ЕЛ —^ E-I.

(7.23)

Реакция

аффинной метки с ферментом начинается с образо-

вания

обратимо связанного комплекса фремент—ингибитор, да-

лее

следует

стадия ковалентной модификации фермента и, сле-

довательно, необратимое ингибирование. Эта схема аналогична

механизму Михаэлиса — Ментен, а потому при возрастании

концентрации

ингибитора должно наблюдаться насыщение. Ре-

шение кинетического уравнения для этого случая приведено в

гл. 4 [уравнение (4.71)]. Для простого случая неравновесного

связывания,

за которым

следует

медленная стадия химического

превращения, справедливо уравнение

Поскольку связывание

«субстрата»

с ферментом является спе-

цифичным,

скорость химической реакции, протекающей в преде-

лах фермент-«субстратного» комплекса, чаще всего достаточно

высока благодаря энтропийному преимуществу ее над простой

бимолекулярной реакцией в растворе. Следовательно, соедине-

ния,

которые обычно обладают низкой реакционной способ-

ностью,

могут

стать очень реакционноспособными аффинными

метками.

Таблица

7.11

Высокая

реакционная

способность

аффинных

модификаторов

а)

Реакция

Cbz-L-фенилаланинхлорметилкетон + химотрип-

син

(алкилирование

His-57)

Cbz-L-фенилаланинхлорметилкетон + ацетилги-

стидин

Константа скорости

второго

порядка,

М-'с-

4,5

•

10~

Shaw

N..

Ruscica

J.,

Archs Biochem. Biophys.,

145,

484

(1971).

Принцип

данного метода очень хорошо иллюстрируется од-

ним

из первых экспериментов по применению аффинных ме-

ток— исследованием реакции тозил-Ь-фенилаланинхлорметил-

кетона (ТРСК) с химотрипсином [74].

ТРСК

сходен с такими

246

ГЛАВА

субстратами, как метиловый эфир тозил-Ь-фенилаланина, но

содержит хлорметилкетонную

группу,

являющуюся алкилирую-

щим агентом. Известно, что галоидметилкетоны

реагируют

тиолами и имидазолами. Процесс необратимого ингибирования

химотрипсина

ТРСК

имеет

следующие

особенности 173, 74]:

СН^СН

ОМе

O=S=O

ТРСК

а. Скорость инактивации фермента подавляется обратимы-

ми

ингибиторами или субстратами фермента.

б. График зависимости относительной скорости ингибиро-

вания

от рН при низких концентрациях ингибитора ([I]<C/Ci)

имеет вид колоколообразной кривой с такими же значениями

р/Са, какие были найдены из рН-зависимости

kcat/Кгл

случае

гидролиза субстратов.

в. С помощью ингибитора, меченного радиоактивным

угле'

родом, показано, что инактивированный фермент связывает

один моль ингибитора на один моль активных центров.

г. Согласно более поздним данным, кривая зависимости

скорости инактивации от концентрации ингибитора

выходит

на

плато при достаточно высоких концентрациях последнего

(«/См* «0,3 мМ) [77]. (Проведенные позже исследования пока-

зали, что модифицируемой аминокислотой в активном центре

является His-57).

Все эти свойства в совокупности являются тестом на выяв*

ние

аффинной метки, модифицирующей в активном центре

груп-

пу, ионизация которой контролирует активность фермента. На-

личие кинетики с насыщением (п. г) показывает, что метка об-

разует

комплекс с ферментом,

хотя

это можно и не обнаружить,

если К\ лежит в области концентраций, при которых ингибитор

не растворяется. Конкурентное ингибирование

субстратом

(п. а)

подтверждает,

что связывание происходит в активном центре.

Стехиометрическое соотношение 1 : 1 означает, что эта модифи-

кация

является избирательной. Ценные данные позволяет полу-

чить анализ рН-зависимости различных параметров. Как отме-

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

247

чалось в гл. 5, рН-зависимость

Утах//(м

или

tlKM

дает

р/Са

тех групп в свободном ферменте, которые

участвуют

в катализе

связывании субстрата. Аналогичным образом из рН-зависи-

мости параметра ki/Ki (или относительной скорости реакции

при

[I]

<C^(i,

поскольку в этих условиях скорость пропорцио-

нальна

kilKi), мы получаем р/Са тех групп в свободном фер-

менте, которые

участвуют

в связывании и в реакции с ингибито-

ром.

Следовательно, рН-зависимости fe

at//CM и kJKi должны

дать идентичные наборы значений р/Са, если аффинной меткой

модифицируются те же группы, что и участвующие в катализе.

Аналогично тому как из рН-зависимости

мы получаем р/С

фермент-субстратного комплекса, рН-зависимость k

дает

зна-

чения

р/Са комплекса фермент — ингибитор (с оговорками, ука-

занными

в гл. 5).

Ферменты всегда таят в себе много неожиданного для

энзи-

молога. Так, например (см. гл. 12, разд. Е.2), аффинная метка

1,2-ангидро-О-маннитол-6-фосфат присоединяется к остатку

глутаминовой кислоты в глюкозо-6-фосфатизомеразе [78].

СНг^гл

СНО

-ОН

но-

-он

СН

ОРО;

\Ъангидро-Ъ-маннитол-

фосфат

-ОН

-он

СН

ОРОГ

Глюкозо-Ь-

фосфат

Установлено, что в этом

случае

имеет место кинетика с насы-

щением,

субстраты препятствуют модификации, стехиометрия

инактивации

равна 1 : 1, а рН-зависимость k\

дает

значения р/С

для комплексов фермента с ингибитором, близкие к р/С

фер-

мент-субстратного комплекса. Однако результаты кристаллог-

рафического анализа позволяют предположить, что модифици-

ровалась не та группа, которую имели в

виду,

другое

участву-

ющее в катализе основание (гл. 12, разд. Е.2) [79]. Если все

обстоит именно так, то неожиданный

результат

интереснее

ожидаемого, поскольку тем самым обнаружена важная, не из-

вестная ранее каталитическая группа.

Еще один показательный пример использования аффинных

меток связан с исследованием пепсина [см. уравнения (12.29) и

(12.30)]. Этот фермент содержит два

участвующих

в катализе

248

ГЛАВА

остатка аспарагиновой кислоты, из которых ионизирован только

один.

Ионизированная карбоксильная группа взаимодействуете

эпоксидом, поскольку последний вступает в реакцию, конечно, с

нуклеофильной группой. Неионизированная карбоксильная

группа взаимодействует с диазоацетильным производным эфира

аминокислоты (7.25).

Си

CHCONHCH(R)CO

Cu"CHCONHCH(R)CO

(7.25)

Эта реакция катализируется ионами меди, что, вероятно, обус-

ловлено образованием комплекса карбена с медью [80]. Изве-

стно,

что карбен, у которого на внешней оболочке находится

только шесть электронов, присоединяется к неионизированным

карбоксильным группам по связи О—Н.

Еще один интересный

подход

состоит в использовании фото-

чувствительных

аффинных

меток [81, 82] — соединений, устойчи-

вых в темноте, но активизирующихся в

результате

фотолиза, и

способных обратимо присоединяться к ферменту. Обычно в ка-

Таблща

7.12

Некоторые

аффинные

метки

Фермент

Триозофосфатизомераза

Лизоцим

Изолейцил-тРНК-синте-

таза

Аффинная метка

1СН

ССН

ОРО*"

СН

СНСН

ОРО*"

сн

он

^о

J—o осн

снсн

ШАс

ВгСН

СО-Пе-тРНК

Пе

Субстрат

НОСН

ССН

ОРО^"

НССН(ОН)СН

ОРО^

СН

ОН

Кон

NHAc

Пе-тРНК

Пе

> Hartmann F. С, Blochem. biophys. Res. Commun., 33,

888(1968);

Watey

S. G., Mil-

ler J. C, Rose I. A., O'Connell E. L., Nature, Lond., 227, 181 (1970); Thomas E. W., McEl-

vy J. P., Sharon N.. Nature, Lond., 222, 485 (1969); Santi O. V., Merchant W.. Blochem. biop-

hys. Res. Commun., 6J, 370 (1973).

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 249

честве таких реагентов используются диазосоединения или ази-

ды, при фотолизе которых образуются соответственно высокоре-

акционноспособные

карбены или нитрены:

»- RC( (7.26)

ftv

R—N

*• R—N:

(7.27)

Фоточувствительные аффинные метки оказались очень по-

лезными

при картировании аминокислотных остатков в актив-

ных центрах ферментов и в центрах связывания белков (напри-

мер,

антител). Для кинетических исследований более удобны

обычные аффинные метки, поскольку они специфичны в отноше-

нии

основных и нуклеофильных групп, которым в катализе при-

надлежит главная роль, и позволяют получить информацию о

р/Са

модифицируемых групп.

В настоящее время синтезированы сотни аффинных меток; в

основе большинства из них лежат галоидметилкетоны или

эпок-

сиды. Перечень меток ежегодно приводится в периодических

сообщениях для специалистов «Аминокислоты, пептиды и бел-

ки», издаваемых Химическим обществом Великобритании.

СПИСОК

ЛИТЕРАТУРЫ

1. Hartley В. S., МЪу В. A., Biochem. J., 56, 288 (1954).

Gutfreund

Н., Discuss. Faraday Soc, 20, 167 (1955).

Gutfreund

H., Sturtevant J. M., Biochem. J., 63, 656 (1956).

4. Himoe A., Brandt K. G., DeSa R. J., Hess G. P., J. biol. Chem., 244, 3483

(1969).

5. Barman T. E.,

Gutfreund

H., Biochem. J., 101, 411 (1966).

6. Bernhard S. A.,

Gutfreund

H.,

Proc.

natn.

Acad. Sci., U.S.A., 53, 1238

(1965).

7. McConn /.. Ku E.. Himoe A., Brandt K. G., Hess G. P., J. biol. Chem.,

246, 2918 (1971).

8. Bender M. L., Schonbaum G. R., Zerner В., J. Am. chem. Soc, 84, 2540

(1962).

Caplow

M., Jencks W. P., Biochemistry, 1, 883 (1962).

10. Bernhard S. A., Lau S. J., Noller H., Biochemistry, 4, 1108 (1965).

11.

Jersey

J.,

Keough

D. Т.,

Stoops

J. K., Zerner В., Eur. J. Biochem 42,

237 (1974).

12. Miller С G., Bender M. L, J. Am. chem. Soc, 90, 6850 (1968).

13.

Fersht

A. R.,

Blow

D. M.,

Fastrez

J., Biochemistry, 12, 2035 (1973)

14.

Fastrez

/.,

Fersht

A. R., Biochemistry, 12, 2025 (1973).

15.

Henderson R., J. molec. Biol., 54, 341 (1970).

16. Jansen E. F., Nutting M. D., Balls A. K., J. biol. Chem., 179, 201 (1949).

17. Schaffer N. K., May S. C, Summeson W. H., J. biol. Chem., 202, 67 (1953).

18.

Gutfreund

H., Hammond B. R., Biochem. J., 73, 526 (1959).

19.

Garen

A., Levinthal C, Biochem. biophys. Acta, 38, 470 (1960).

20.

Heppel

L. A., Harkness D. R., Hilmoe R. J., J. biol. Chem., 237, 841 (1962).

21.

Aldridge

W. N., Barman T. £., Gutfreund H., Biochem. J., 92, 23C (1964).

250

ГЛАВА

22.

Hull W. £., Sykes В. D., Biochemistry, 15, 1535 (1976).

23.

Hull W. E., Halford S. £., Gutfreund H., Sykes B. D., Biochemistry, 15,

1547 (1976).

24. Epand R. M., Wilson I. В., J. biol. Chem., 238, 1718 (1963).

25.

Epand R. M., Wilson l. В., J. biol. Chem., 240, 1104 (1965).

26 Bender M. L, Clement G. E.,

Gunter

С R., Kezdy F. J., J. Am. chem. Soc,

86,

3697 (1964).

27.

Березин

И. В., Казанская Н. Ф.,

Клёсов

A. A., FEBS Letts., 15, 121 (1971).

28.

Engstrom

L, Biochim. biophys. Acta, 54, 179 (1961); 56, 606 (1962).

29.

Schwartz J. H., Lipmann F.,

Proc.

natn.

Acad. Sci., U. S. A., 47, 1996

(1961).

30. Barrett H., Butler R., Wilson I. B., Biochemistry, 8, 1042 (1969).

31.

Snyder S. L, Wilson I. B., Biochemistry, 11, 3220 (1972).

32.

Block W., Schlesinger M. L, J. biol. Chem., 248, 5794 (1973).

33.

Chlebowski

J. F.,

Armitage

1. M., Tusa P. P.,

Coleman

J. E., J. biol. Chem.,

251,

1207 (1976).

34. Chappelet-Tordo D., Iwatsubo M., Lazdundski M., Biochemistry, 13, 3754

(1974).

35.

Msheimer G. S.,

Axelrod

В., J. biol. Chem., 227, 879 (1957).

36.

Ostrowski

W., Barnard E. A., Biochemistry, 12, 3893 (1973).

37.

Wallenfels K., Kurz G., Biochem. Z., 335, 559 (1962).

38.

Wallenfels K., Malhotra 0. P., Adv. Carbohyd. Chem., 16, 239 (1961).

39.

Koshland D. E., Jr., In: McElroy W. D., Glass V. (eds.), Mechanisms of.

enzyme

action, p. 608, Johns Hopkins Press, Baltimore (1954).

40. Rupley J. A.,

Oates

V.,

Proc.

natn.

Acad. Sci., U.S.A., 57, 496 (1967).

41.

Pollock

J. J., Chipman D. M., Sharon N., Archs Biochem. Biophys., 120, 235

(1967).

42.

Stokes T. M., Wilson I. B., Biochemistry, 11, 1061 (1972).

43.

Sinnott M. L,

Viratelle

О. Е., Biochem. J., 133, 81 (1973).

44. Sinnott M. L, Souchard I. J. L, Biochem. J., 133, 89 (1973).

45.

Sinnott M. L, Withers S. G., Biochem. J., 143, 751 (1974).

46.

Hoagland M. В., Biochim. biophys. Acta, 16, 288 (1955).

47.

Berg

P., P., J. biol. Chem., 222, 1025 (1956).

48.

Hoagland M. В.,

Keller

E. В., Zamecnik P. C, J biol. Chem., 218, 345

(1956).

49.

Soil D., Schimmel P. R., The Enzymes, 10, 489 (1974).

50. Norris A.,

Berg

P.,

Proc.

natn.

Acad. Sci., U. S. A., 52, 330 (1964).

51.

Baldwin A. N.,

Berg

P., J. biol. Chem., 241, 839 (1966).

52.

Loftfield R. В., Prog.

Nucl.

Acid. Res. (& Mol. Biol.), 12, 87 (1972).

53.

Fersht

A. R., Kaethner M. M., Biochemistry, 15, 818 (1976).

54.

Fersht

A. R., Kaethner M. M., Biochemistry, 15, 3342 (1976).

55.

Lowey S., Slayter H. S., Weeds A. G., Baker H., J. mol. Biol., 42, 1 (1969).

56.

Weber A., Hasselbach W., Biochim. biophys. Acta, 15, 237 (1954).

57.

Tonomura Y.,

Kitagawa

S., Biochim. biophys. Acta, 26, 15 (1957).

58.

Lymn R. W., Taylor E. W., Biochemistry, 9, 2975 (1970).

59.

Taylor E. W., Lymn R. W., Moll G., Biochemistry, 9, 2984 (1970).

60. Lymn R. W., Taylor E. W., Biochemistry, 10, 4617 (1971).

61.

Trentham D. R., Bardsley R. G.,

Eccleston

J. F., Weeds A. G., Biochem. J.,

126,

635 (1972).

62.

Bagshaw

С R.,

Eccleston

J. F., Trentham D. R., Yates D. W.,

Goody

R. S.,

Cold

Spring

Harb.

Symp. quant. Biol., 37, 127 (1972).

63.

Bagshaw

С R., Trentham D. R., Biochem. J., 133, 323 (1973).

64.

Bagshaw

С R., Trentham D. R., Biochem. J., 141, 331 (1974).

65.

Bagshaw

С R.,

Eccleston

1. F., Eckstein F., 6oody R. S.,

Gutfreund

Trentham D. R., Biochem. J., 141, 351 (1974).

66. Mannherz H. G., Schenck H.,

Goody

R. S., Eur. J. Biochem., 48, 287 (1974).

67.

Wolcott R. G., Boyer P., J. Supramolecular Structure, 3, 154 (1975).