Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов

Подождите немного. Документ загружается.

КИНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 251

68.

Trentham D. R.,

Eccleston

J. F.,

Bagshaw

С. R., Q. Rev. Biophys., 9, 2

(1976).

69.

Taylor R. W., Weeds A. G.,

Biochem.

;

159, 301 (1976).

70.

Fishbein

R., Benkovic P. A., Schray K- J-, Siewers 1. /., Steffens J. J.,

Benkovic S. /., J. biol.

Chem.,

249, 6047 (1974).

71.

Wurster В., Hess В.,

FEBS

Letts.,

38, 257 (1974).

72.

Koerner T. A. W., Jr., Younathan E. S., Ashour A.-L. E.,

Voll

R. J., J. biol.

Chem.,

249, 5749 (1974).

73.

Shaw £., The Enzymes, 1, 91 (1970).

74.

Schoellmann G., Shaw E., Biochem. biophys. Res. Commun., 7, 36 (1962);

Biochemistry, 2, 252 (1963).

75.

Baker B. R., Lee W. W., Tong E., Ross L. 0., J. Am. chem. Soc, 83, 3713

(1961).

76.

Wofsy L, Metzger H., Singer S. /., Biochemistry, 1, 1031 (1961).

77.

Glick D., Biochemistry, 7, 3391 (1968).

78.

O'Connell E. L, Rose I. A., J. biol. Chem., 248, 2225 (1973).

79.

Shaw P. J., Muirhead H., FEBS Letts., 65, 50 (1976).

80.

Lundblda R. L., Stein W. H., J. biol. Chem., 244, 154 (1969).

81.

Singh A., Thornton E. R., Westheimer F. H., J. biol. Chem., 237, 3006 (1962).

82.

Knowles J. R,, Ace. chem. Res., 5, 155 (1972).

Глава

КООПЕРАТИВНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ

ЛИГАНДОВ И АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

А.

Положительная

кооперативность

Молекулы многих белков состоят из субъединиц и имеют

несколько

центров связывания лигандов. В ряде случаев кривые

связывания

лигандов не

следуют

уравнению Михаэлиса — Мен-

тен (глава 6, разд. Г), а имеют

сигмоидный

характер. Кривая

такого рода представлена на рис. 8.1; она отражает зависимость

степени насыщения гемоглобина кислородом от давления кисло-

рода. Здесь же для сравнения приведена гипербола, описывае-

мая

уравнением типа уравнения Михаэлиса — Ментен, которая

отражает связывание кислорода миоглобином. Сигмоидные

кривые характерны для случая кооперативного связывания ли-

гандов белками, имеющими несколько центров связывания в

белковом олигомере. Так, например, молекула гемоглобина со-

стоит из четырех полипептидных цепей, каждая из которых

сход-

на

с единственной полипептидной цепью миоглобина. Кривую

связывания

кислорода гемоглобином можно описать уравнением,

содержащим четыре константы последовательного связывания

(уравнение Эдера [1]). Удивительная особенность процесса ко-

оперативного связывания состоит в том, что сродство гемогло-

бина

к четвертой присоединяемой молекуле кислорода в

несколько

сот (до тысячи) раз превышает сродство к первой

молекуле. Это увеличение сродства нельзя объяснить, исходя из

наличия

четырех невзаимодействующих центров, обладающих

просто разным сродством к кислороду. В этом

случае

центры с

высоким

сродством к кислороду заполнялись бы первыми и

молекула с частично заполненными центрами связывания обла-

дала бы меньшим сродством, чем дезоксигемоглобин. Увеличе-

ние

сродства по мере насыщения гемоглобина кислородом явля-

ется результатом взаимодействия связывающих центров, приво-

дящим

тому,

что связывание молекулы кислорода с одним

центром вызывает увеличение сродства

другого.

Аналогичными кооперативными свойствами обладает и ряд

ферментов.

Здесь также зависимость v от [S] изображается

сигмоидными кривыми. Обычно эти ферменты ответственны за

КООПЕРАТИВНОЕ

СВЯЗЫВАНИЕ ЛИГАНДОВ

253

регуляцию

контроль метаболических процессов,

и их

актив-

ность

регулируется

по

принципу обратной связи. Терминология,

используемая

при

ряссмотрении вопросов кооперативности,

за-

имствована

из

области исследования процессов регуляции

[2].

Венозное давление

100

Артериальное

давление

Рис.

8.1.

Связывание кислорода гемоглобином

(/) и

миоглобином

(//).

Ферменты

описанными выше свойствами называются

аллосте-

рическими

(от

греч.

allos

—

другой,

stereos

—

пространство),

Таблица 8.1

Константы

Эдера

(мм"

Hg) для присоединения О

гемоглобину при 25 °С, рН 7,4 и 0,1 М NaCl

б)

2,3-дифосфоглицерат,

мМ

2,0

К\

0,024

0,01

К.2

0,074

0,023

*з

0,086

0,008

7,4

11,2

НЬ

Tyuma

I.,

Imal

К.,

Shimlzu

К-

Biochemistry,

12,

1491

(1973).

б) Уравнение Эдера описывает следующий

процесс:

НЬО

" f

НЬ(О

)

(

' >

НЬ(О

)з

<""" >

НЬ(О

)

где

[НЬО

]

[НЬ]

[О

]

•

Кг=

[НЬ

[HbO

]

254

ГЛАВА

поскольку аллостерический эффектор (ингибитор или актива-

тор) обычно структурно отличен от субстрата и связывается с

центром,

расположенным в

другом

месте белковой молекулы,

чем активный центр. Взаимодействия

между

идентичными мо-

лекулами субстрата называют

гомотропными,

а взаимодействия

между

аллостерическими эффектором и субстратом—гетерот-

ропными.

Б.

Механизмы

аллостерических

взаимодействий

кооперативности

Первые попытки объяснить механизм кооперативности были

предприняты

при исследовании свойств гемоглобина. Чтобы

лучше понять смысл этих работ, рассмотрим

структуру

дезокси-

оксигемоглобина. Молекула гемоглобина состоит из

двух

пар

цепей,

аир, расположенных в пространстве таким образом, что

образуется симметричный тетраэдр. Гемы, являющиеся центра-

ми

связывания кислорода, располагаются достаточно далеко

друг

от

друга

и непосредственно не взаимодействуют. При ок-

сигенации

дезоксигемоглобина тетраэдрическая симметрия со-

храняется, а в четвертичной и третичной

структуре

наблюдаются

изменения

(рис. 8.2) [3]. Из опытов по измерению констант

связывания

известно, что дезоксигемоглобин характеризуется

низким

сродством к кислороду,

тогда

как оксигемоглобин —

высоким.

1. Механизм Моно — Уаймена — Шанжё [4]

Моно,

Уйамен и Шанжё предложили изящное объяснение

кооперативности,

приняв, что небольшая часть дезоксигемогло-

бина

находится в виде четвертичной окси-структуры, которая

связывает кислород более прочно. При присоединении одного

моля

кислорода концентрация окси-структуры возрастает, по-

скольку кислород предпочтительно связывается именно с этой

структурой. Связывание достаточно большого числа молекул

кислорода приводит к

тому,

что окси-форма становится преоб-

ладающей формой гемоглобина в растворе, и последующее свя-

зывание кислорода облегчается. Чтобы упростить соответствую-

щие

математические выражения и сделать более ясным их фи-

зический

смысл, авторы предположили, что четвертичная струк-

тура

молекулы гемоглобина всегда сохраняет свою симметрию;

данная

молекула, присоединившая некоторое количество кисло-

рода, находится либо в окси-, либо в дезокси-состоянии;

смешанные состояния невозможны. По этой причине модель

КООПЕРАТИВНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ ЛИГАНДОВ

256

Моно

и др. часто называют «согласованной» моделью, постро-

енной

по принципу

«все

или ничего», или моделью

«двух

состоя*

НИИ»,

• • •• . ••• •

ц 1

Рис.

8.2. Модели океигемоглобина (А) и дезоксигемоглобина (5), выполнен-

ные

из бальзового дерева. Гемы изображены в виде дисков. Обратите внима-

ние

на увеличение расстояния

между

Р-цепями при дезоксигенации.

Эта модель применима и к другим аллостерическим белкам

при

следующих предположениях.

а. Рассматриваемые белки являются олигомерами. б. Моле*

кула белка находится в одном из

двух

конформационных состоя-

256

ГЛАВА

ний:

Т (tense, «напряженном»)-состоянии, которое преобладает,

когда белок не связан с лигандами, или R (relaxed, «расслаб-

ленном»)-состоянии. Формы белка, соответствующие разным

состояниям,

находятся в равновесии. Указанные состояния раз-

личаются энергетически и по числу связей

между

субъединица-

ми,

в. Форма белка, соответствующая Т-состоянию, обладает

меньшим сродством к лигандам. г. В каждом состоянии все

центры связывания эквивалентны и имеют одинаковые констан-

ты связывания лигандов (предположение симметрии).

4S +

2S +

•it-

•it

•Jh

+ 2S

Рис.

8.З. Модель

Моно,

Уаймена и

Шанжё

связывания лигандов тет-

рамерным белком.

Тсостояние

П-состолние

Сигмоидную кривую связывания можно построить, исполь-

зуя лишь три параметра: L — аллостерическую константу, рав-

ную отношению концентраций

двух

состояний свободного фер-

мента [T]/[R], /Ст и Кя — константы диссоциации для каждого

центра в Т- и R-состояниях соответственно.

Регуляция активности фермента с помощью аллостерических

взаимодействий

Первым достижением теории Моно и др. было построение

теоретической кривой связывания на основе

трех

параметров —

KR И КТ, которая с большой точностью совпала с эксперимен-

тально полученной кривой связывания кислорода гемоглобином.

Но

еще более впечатляющим было предложенное этой теорией

очень простое объяснение механизма регуляции. Моно, Уаймен и

Шанжё утверждали, что сигмоидный характер зависимости v от

[S] в отсутствие аллостерических активаторов и ингибиторов

свойствен всем аллостерическим ферментам. Они указывали, что

КООПЕРАТИВНОЕ

СВЯЗЫВАНИЕ ЛИГАНДОВ

257

если эта сигмоидность обусловлена кооперативным связыванием

существованием R *± Т равновесия, то регуляцию можно объ-

яснить

изменением под действием эффектора отношения

[R]/[T] путем предпочтительной стабилизации одной из этих

форм.

Активатор связывается с R-формой и увеличивает ее кон-

центрацию; ингибитор предпочтительно связывается с Т-формой

таким образом затрудняет переход в R-состояние.

Рис.

8.4. Исчезновение положи-

тельной кооперативное™ при при-

соединении аллостерических эф-

фекторов к некоторым ферментам.

Обратите внимание на очень силь-

ное увеличение ферментативной

активности при низких концентра-

циях субстрата (фосфоенолпипу-

вата) при добавлении AMP к изо-

цитратдегидрогеназе (A),

dCDP

дезокситимидинкиназе (Б) и FDP

пируваткиназе (В), показываю-

щее, как можно

«включить»

фер-

мент с помощью аллостерического

эффектора.

[Hathaway J. A., At-

kinson D. E. J. biol. Chem., 238,

2875

(1963); Okazaki R., Korn-

berg

A. J. biol. Chem., 239, 275

(1964); Haeckel R., Hess В., Lau-

terhorn

W.,

Wfirster

K--H. Hoppe-

Seyler'e

physiol.

Chem., 349, 699

(1968).]

+AMP

ектор

'•miyem

П-2

0,4 0,6

[ИзоцитрапО,мМ

Эффектор

отсутствует

[ATP],

мМ

+FVP

Эффектор

отсутствует

6 8 W

[PEP], мМ

В предельном

случае

активатор смещает равновесие

между

R- и Т-формами в такой степени, что преобладает R-состояние,

кооперативность исчезает и выполняется кинетика Михаэлиса —

Ментен,

что и подтверждается экспериментально для ряда фер-

ментов (рис. 8.4).

Согласно модели Моно и др., присоединение ингибитора к

ферменту, который связывает субстраты но кооперативному ме-

ханизму, должно происходить некооперативно, поскольку инги-

битор присоединяется к преобладающему Т-состоянию. Для ак-

тиваторов, присоединяющихся к ансамблю связывающих цент-

ров в R-состоянии, должно наблюдаться кооперативное связы-

вание.

268

ГЛАВА 8

Наиболее слабым местом теории Моно

и др.

является допу-

щение

симметрии. Использование минимального числа проме-

жуточных состояний приводит

тому,

что

модель становится

лишь

неким приближением

действительности.

Но как раз в

этом допущении

заложено достоинство модели:

она

дает

простую

схему,

которая объясняет экспериментальные данные.

Такие

предсказания,

как

переход

от

сигмоидной зависимости

кинетике

Михаэлиса

—

Ментен

при

достаточно высоких концен-

трациях активатора

для

ферментов, выполняющих регуляторные

функции,

могут

быть сделаны независимо

от

того, вводится

ли

допущение

наличии промежуточных состояний. Необходимо

отметить также,

что,

несмотря

на

свою простоту,

эта

теория

объясняет характер кривых связывания кислорода целым рядом

мутантных форм гемоглобина

(см.

ниже).

Теория

Моно

и др.

является

по

своей сути структурной

тео-

рией.

Гипотеза,

что

между

субъединицами, находящимися

Т-состоянии,

существует

напряжение, послужила отправным

пунктом многих структурных работ Перутца

других

исследо-

вателей

при

объяснении природы

энергетики этих напряжений

гемоглобине.

2. Последовательная модель

Кошланда

—

Немети

—

Филмера

[б]

Авторы

этой модели

не

используют допущение

симметрии,

а предполагают,

что

переход

от

Т-состояния

связанному

с ли-

гандом R-состоянию представляет собой последовательный

про-

цесс.

Конформация субъединиц

олигомере

при

связывании

лиганда изменяется поочередно,

без

резкого «переключения»

всей молекулы

из

одного состояния

другое

(рис.

8.6). В

модели

Моно

и др.

используется идея

об

изменении четвертичной

структуры,

в то

время

как в

рассматриваемой модели

за

основу

принимается

предположение

последовательном изменении

третичной структуры.

Модель Кошланда

и др.

основана

на

двух

допущениях:

а.

отсутствие лигандов белок

существует

одной конформа-

ции.

б. При

связывании лиганд индуцирует

субъединице,

кото-

рой

он

присоединяется, конформационное изменение.

Это из-

менение

может передаваться

на

соседнюю,

«вакантную»

субъединицу.

Рассматриваемая модель олицетворяет высказанную ранее

Кошландом

идею

об индуцированном

соответствии, согласно

которой

связывание субстрата

ферментом вызывает

послед-

КООПЕРАТИВНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ ЛИГАНДОВ

259

нем

конформационные изменения, в

результате

чего каталити-

ческие группы фермента принимают необходимую ориентацию.

Используя эти допущения, можно описать связывание кис-

лорода с помощью четырех констант связывания, что формально

эквивалентно

использованию уравнения Эдера, и, следователь-

но,

модель Кошланда и др. можно рассматривать как интерпре-

тацию этого уравнения на молекулярном уровне. В общем

случае

Рис.

8.5. Модель Кошланда, Немети и Филмера связывания лигандов тетра-

мерным белком.

число необходимых для описания констант равно числу центров

связывания

в отличие от модели Моно и др., в которой всегда

используется три константы.

Модель Кошланда и др. является более общей и, вероятно,

лучше описывает аллостерические свойства некоторых белков,

чем модель Моно и др., хотя интерпретация экспериментальных

данных в этом

случае

часто бывает несколько более сложной.

3. Обобщенная модель [6]

Эйген

указывал, что модели Моно и др. и Кошланда и др.

представляют собой предельные случаи более общей схемы

(рис.

8.6). Эта схема сложнее представленной здесь «шахматной

доски», поскольку по причинам симметрии в

случае

гемоглобина

имеется 44 возможных состояния. На рис. 8.6 модель Кошланда

др. представляется перемещением слона вдоль диагонали,

идущей из левого верхнего

угла

шахматной доски в правый

нижний

угол,

а модель Моно и др.— перемещением ладьи вдоль

вертикальных сторон доски и

между

этими сторонами. В работе

260

ГЛАВА

[7] была проанализирована обобщенная модель, включающая

как

крайние случаи модели Моно и Кошланда и рассматриваю-

щая

диссоциацию олигомера на субъединицы и т. д. Однако

получающиеся результаты слишком сложны, чтобы ими можно

S S

ел

СНГ

Рис.

8.6 Обобщенная схема Эйге-

на

для связывания лигандов тет-

рамерным белком. Крайние слева

справа столбцы изображают

упрощенную

схему

Моно и др., а

диагональ, идущая из левого верх-

него

угла

в правый

нижний,—

схе-

му Кошланда и др.

было широко пользоваться, и значительно удобнее интерпрети-

ровать экспериментальные данные в рамках рассмотренных вы-

ше моделей.

В. Отрицательная кооперативность и реакционная

способность половины активных центров [8, 9]

У некоторых ферментов при последовательном связывании

молекул лигандов наблюдается

уменьшение

сродства. Как ука-

зывалось ранее, это явление можно объяснить изначальным

различием в сродстве имеющихся центров связывания, приводя-

щим к

тому,

что первым связывают лиганды те центры, у кото-

рых сродство выше. Однако установлено, что такое поведение

свойственно и олигомерным ферментам, состоящим из идентич-

ных субъединиц. Результаты рентгеноструктурных исследо-

ваний

двух

ферментов — тирозил-тРНК.—синтетазы [10] и гли-

церальдегид-3-фосфат—дегидрогеназы [11] из

Bacillus

stearo-

thermophilus

— показали, что субъединицы этих ферментов

располагаются симметрично, так что все центры в исходном

состоянии эквивалентны. Однако тирозил-тРНК—синтетаза, яв-

ляясь димером, прочно связывает только один моль тирозина,

связывание же второго моля не удается обнаружить

даже

при

миллимолярных концентрациях тирозина [12, 13]. Присоедине-

ние

четырех молей NAD+ к глицеральдегид-3-фосфат—дегидро-