Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Киназы

673-

\це обязательным ионом металла может быть Mg, Mn, Ca или

Zo. Хотя раньше это и оспаривалось, однако теперь в результате

кинетических, термодинамических и ЯМР-исследований оконча-

тельно установлено, что металл связывается с ферментом не не-

тосредственно, а через нуклеотидный субстрат (тип I).

Больше всего работ выполнено с ферментом из мышц кро-

лика, который с хорошим выходом получается в кристаллическом

виде [65]. Он является димером с молекулярной массой 82 600 и,

по-видимому, образован из идентичных мономеров [66]. Диссо-

циация димера, наблюдаемая только в жестких денатурирующих

условиях, приводит к утрате активности и деструкции центра

связывания нуклеотида [62, 67]. Если же принять меры для за-

щиты сульфгидрильных групп, освобождающихся при денатура-

ции, то впоследствии удается восстановить в активном виде и

димерную форму. Считается, что глобула содержит два активных

центра (по одному на мономер), в которых имеется по одному

реакционноспособному остатку цистеина.

Выше уже рассматривались результаты кинетических исследо-

ваний фермента (разд. 2.2). Мы не будем обсуждать работы

группы Куби [66] и других лабораторий [68, 69], посвященные

белковой химии креатинкиназы. Основное внимание будет уделено

лишь тем сведениям, которые были получены методом магнит-

ного резонанса, а также при параллельных исследованиях.

В одной из первых работ Кон и Лей [34] использовали изме-

рения ЯМР и ЭПР для демонстрации образования комплекса

МпАДФ — фермент. Эти результаты были дополнены О'Суллива-

ном и Кон [35], которые, используя графический метод анализа

данных ЯМР, определили значения констант ассоциации фермен-

та с МпАДФ

и МпАТФ

, хорошо согласующиеся с кинетиче-

скими результатами. Впоследствии благодаря использованию вы-

числительной техники в эти величины были внесены некоторые

поправки, не изменившие представления о наличии у фермента

двух активных центров [61, 70].

В работе [7] в качестве субстратов изучались различные

нуклеозиддифосфаты. Одновременно исследовалась способность

их марганцевых комплексов воздействовать на скорости релакса-

ции протонов воды. Были обнаружена строгая корреляция между

наблюдаемым усилением для соответствующего тройного комп-

лекса и способностью дифосфата участвовать в реакции в качест-

ве субстрата. Третья из исследованных в этой работе характери-

стик— способность металл-нуклеотидных комплексов влиять на

реакцию иодацетата с каталитической сульфгидрильной груп-

пой— подчиняется той же закономерности (рис. 18.2). Был сде-

лан вывод о том, что наблюдаемые явления — следствие конфор-

мационных изменений в активном центре фермента, индуцируе-

мых субстратами. Обнаруженные различия в усилении

'<674

Глава

релаксации, скорости реакции и доступности SH-группы можш

объяснить различием в степени этих конформационных измене

ний при воздействии разных нуклеотидов. Аналогичные соотно

шения получены и для нуклеозидтрифосфатов, хотя в этом случа(

результаты менее убедительны, чем для дифосфатов.

Скорость

реакции

Усиление

релаксации

Увеличение

реакционной

способности

SH-группы

100

А Б В Г Д А Б В Г Д

А В ГД

Рис. 18.2. Сравнение относительных значений максимальной скорости реакции,

усиления протонной релаксации и возрастания реакционной способности

SH-групп для комплексов металлов с различными нуклезиддифосфатами.

А — МАДФ-; Б — М-З'-дАДФ-; В — М-2'-дАДФ—, Г — МИДФ-; Д — МГДФ-. Максимальные

скорости и реакционная способность SH-групп определялись с Mg

+, кроме случая ИДФ.

где использовался Mn

+; усиление релаксации измерено с Mn

+ [J. Biol. Chem.. 241. 3116

(1966)].

Наблюдались и значительные различия в характере влияния

свободных нуклеотидов и их комплексов с металлами на реак-

цию иодацетата с SH-группой. Например, АДФ

~ защищает фер-

мент от инактивации, хотя эта защита никогда не бывает полной

даже при насыщающих концентрациях, тогда как комплекс фер-

мента с х\^АДФ

реагирует с алкилирующим агентом в большей

степени, чем нативная креатинкиназа. Поскольку ни АДФ

~, ни

MgAДф- не влияют на скорость взаимодействия сульфгндриль-

ной группы с электронейтральным иодацетамидом [50], можно

заключить, что при конформационных изменениях активного

центра происходит перераспределение зарядов.

Доказательства наличия таких изменений конформации ак-

тивного центра были получены и при исследовании креатинкина-

зы методом температурного окачка [71]. Согласно этим данным,

при добавлении АДФ

или МАДФ- (M=Mg

+, Ca

+ или Mn

происходит изомеризация фермента. Константы связывания ме-

талл-нуклеотидных комплексов лишь в незначительной степени за-

висят от природы металла, что согласуется с изложенным выше

представлением о характере взаимодействия (ESM). (Величины

констант скоростей образования самих металл-нуклеотидных

Киназы 675-

комплексов отличаются у разных металлов на несколько по-

рядков.)

Образование непродуктивного четверного комплекса (присое-

динение креатина к МпАДФ—Е) приводит к резкому изменению

скорости протонной релаксации. Причина этих изменений до не-

которой степени объясняется результатами измерений при разных

у -ю

Рис. 18.3. Зависимость 1/Г

1р

от температуры для тройного и четверного ком-

плексов креатинкиназы [J. Biol. Chem., 243, 2737 (1968)].

Условия: 4 мг/мл (0,05 мМ) креатинкиназы, 0,1 мМ MnCb, 0,1 мМ АДФ, 0,05 M N-этилмор-

фолнна, рН 8,0. ф нативный фермент; Я нативпый фермент в присутствии 30 мМ креатина;

Л неактивный карбоксиметилирован.ный фермент; О неактивный карбоксиметнлированный

фермент в присутствии 30 мМ креатина.

температурах (рис. 18.3). Скорость релаксации для тройного ком-

плекса МпАДФ—E имеет нулевой или отрицательный температур-

ный коэффициент, а у четверного комплекса МпАДФ—E — креа-

тин этот коэффициент положителен. Раньше считалось, что по-

следнее является следствием процесса, определяемого х

[62].

Однако, согласно недавно полученным данным (зависимость этого

явления от частоты), величина T

, по-видимому, определяется

значением x

[5].

На рис. 18.3 показаны также результаты, полученные скреа-

тинкиназой, обработанной иодацетатом (замещены две активные

SH-группы). Модифицированный фермент связывает МпАДФ

так же хорошо, как и нативная креатинкиназа, однако при этом

уже не наблюдается «эффект креатина».

Свидетельства наличия конформационных изменений при об-

разовании четверного комплекса получены в исследованиях инак-

тивации доступных сульфгидрильных групп иодацетатом и иода-

674

Г лава

цетамидом [50] и чувствительности фермента к трипсину [51].

Некоторые сведения о природе этих изменений получены в на-

чальных работах со спин-меченой креатинкиназой.

Использование в качестве спиновых меток иминоксильных про-

изводных иодацетамида, стехиометрически реагирующих с сульф-

гидрилом, способствовало значительному увеличению количества

информации, получаемой резонансными методами [58]. Подобно

другим модификаторам SH-группы, иминоксильные производные

полностью инактивируют фермент из мышц кролика. Однако при

этом он еще сохраняет способность связывать нуклеотидные суб-

страты, хотя уже и не показывает «эффект креатина». Благода-

ря этому оказалось возможным использовать методы ЭПР и про-

тонного резонанса для определения констант диссоциации раз-

личных диамагнитных металлов (например, Mg

+, Ca

+) из их

тройных комплексов с ферментом. Выяснилось, что добавление

МАДФ

приводит к еще большей степени заторможенности ими-

ноксильного радикала, и так уже значительно заторможенного

вследствие присоединения к ферменту.

Два следующих примера демонстрируют возможности метода

парамагнитных зондов [70]. По уширению сигнала ЭПР от ими-

ноксильного радикала, наблюдавшемуся после добавления

МпАДф-, удалось определить расстояние между неспаренным

электроном метки и связанным ионом марганца. Оно составило

8—12 А (для МпАТФ на поверхности белка это расстояние равно

13—18 А). Аналогичные исследования были проведены с фермен-

том из сердца цыпленка, который после связывания иминоксиль-

ной метки еще сохраняет около 25% активности. Из наблюдений

за уширением линий протонов Н-8 и Н-2 в кольце связанного

аденина, происходящем при переходе от АДФ—E к МАДФ—Е,

а затем к МАДФ—E—креатин, было усгановно что адениповое

кольцо удаляется от сульфгидрильной группы.

Эти эксперименты пока еще имеют характер предварительных.

Тем не менее уже и по их результатам видно, какие широкие

возможности предоставляют для изучения активных центроЕ

киназ методы магнитного резонанса.

3.2. Аргининкиназа

Аргининкиназа катализирует обратимый перенос фосфориль-

ной группы от АТФ к ь-аргинину аналогично реакции креатин-

киназы [1]. Она широко распространена среди беспозвоночных

особенно у членистоногих. Ферменты, выделенные из некоторых

ракообразных, почти не отличаются друг от друга по физическим

свойствам. Аргининкиназа состоит из одной полипептидной цепи с

молекулярной массой около 40

ООО

(половина молекулярной массы

креатинкиназы) с одним каталитическим центром.

Киназы

677-

Подобно креатинкиназе аргининкиназа, по-видимому, подчи-

няется кинетике быстрого статистического равновесия. (Сообще-

ние [72] о том, что у фермента из Jasus verrauxi реакция имеет

механизм типа «пинг-понг», не содержало достаточно убеди-

тельных доказательств.) Это согласуется с ЯМР-данными, полу-

ченными с аргининкиназами из трех источников: Homarus vul-

garis, Homarus americanus и Panulirus Iongipes [73]. Все они

являются ферментами типа I с относительно высокими значе-

ниями е/ для комплексов МпАДФ—E и МпАТФ—Е. Хотя и

имеются некоторые количественные различия, однако характер

усиления релаксации одинаков во всех случаях, а константы

диссоциации комплексов марганца с нуклеотидами, определен-

ные по скоростям релаксации протонов, хорошо согласуются со

значениями, полученными из кинетических данных.

Эксперименты с различными Мп-нуклеотидами (АДФ,

2'-дАДФ и ИДФ) обнаружили такую же корреляцию между ej

и максимальной скоростью, как и для креатинкиназы. Между

этими ферментами наблюдается аналогия и в изменениях ско-

рости релаксации при образовании четверных комплексов

(МпАДФ—E—креатин и МпАДФ—Е—L-аргинин). С D'-аргини-

M, который является либо слабым ингибитором, либо вообще

инертным по отношению к аргининкиназе, подобный эффект

не обнаружен.

На данной стадии исследований представляется, что арги-

нинкиназа и, вероятно, другие гуанидинкиназы [74, 75] имеют

механизм, подобный креатинкиназе. Гораздо меньшая молеку-

лярная масса аргининкиназы делает ее более удобной для изу-

чения методом сканирующей ЯМР-юпектроскопии.

3.3. Пируваткиназа

Пируваткиназа катализирует реакцию

+, M

АТФ

+ пируват

АДФ

+ фосфоенолпируват (1)

а также две нефизиологичеокие реакции — «фторкиназную» и

«гидроксиламинкиназную»:

HCOJ

АТФ

" + F

< АДФ

- + FPOl" (2)

HCOJ

АТФ

-+NH

OH < ' * АДФ

- + гидроксиламинфосфат (3)

Все эти реакции, по-видимому, происходят в одном и том же

центре фермента. Для всех них необходимо присутствие ионов

жак двух-, так и одновалентных металлов [76]. Ионами двух-

* Здесь et — то же, что и е

в гл. 14.

Глава 18

валентных металлов для реакций (1) и (2) могут быть Mg

или Mn

+, для реакции (3) — Zn

+, а одновалентных —

К+ >Rb+>NHT>Cs+>Nа+ [76, 77].

Наиболее подробные исследования проведены с ферментое

из мышц кролика — тетрамером с молекулярной массой 237 000

состоящим, по-видимому, из одинаковых субъединиц [78]. Име

ются некоторые расхождения в мнениях по поводу кинстическон

схемы [6, 79], однако представляется вероятным (главны*

образом на основании экспериментов со слабо диссоциирующие

ионом Ni

+ [80]), что тройной комплекс металл — фермент —

АДФ может образовываться как при взаимодействии АДФ

ЕМ, так и непосредственно из фермента и МАДФ^ (пути 11 и

III на схеме в разд. 2.4). Было также обнаружено, что только

предварительная инкубация фермента с фосфоенолпируватом

(ФЕП), но не с МАДФ

приводит к увеличению скорости реак-

ции. Последнее свидетельствует об определенной упорядоченно-

сти в последовательности связывания субстратов. Фермент иг

дрожжей подчиняется тому же механизму, однако с существен-

ным отличием — фруктозодифосфат является аллостерическим

активатором [80].

Обе пируваткиназы (из мышц кролика и из дрожжей) ведут

себя как ферменты типа II. Наблюдается значительное усиление ре-

лаксации у комплексов фермента с марганцем при малых значе-

ниях для тройных комплексов. Результаты кинетических экспери-

ментов свидетельствуют о существовании структуры с металлом

в качестве мостика. О том же говорят данные резонансных ис-

следований. Лучше всего в этом убеждают результаты изучения

«фторкиназной» реакции, катализируемой ферментом [81], та*

как ядра фтора дают удобный для наблюдения спектр. Исследо-

вание влияние марганца, связанного с ферментом, на скоростн

релаксации 1/Т\ и I/T

ядер

F позволило рассчитать раостоянж

между атомами Mn и F. Эти расчеты хорошо согласуются с не

давним рентгеноструктурным анализом кристаллов CaFPO

[82]

и соответствуют мостиковым структурам

°п

IL / \ S

Е—Mn—О—P-F или E—Mn]

1 \/ V

О- о

Скорость обмена (\/х

) аниона FPO!

в координационную сфер?

иона марганца по порядку величины согласуется с кинетическим!

данными.

Различия в значениях е« для E—МпАДФ и E—МпАТФ соот

ветствуют различиям самих этих комплексов (потеря одной моле

кулы воды в последнем случае) [83]. По-видимому, Mn образуе-

Киназы 679-

связи с у-фосфатом АТФ (т. е. с фосфорильной группой, перено-

симой к ФЭП), а возможно, и с р-фосфатом АТФ и АДФ.Однако

хобавление ФЕП к E—Mn приводит к гораздо большим измене-

ниям в усилении релаксации, чем в тех случаях, когда это можно

объяснить простым замещением молекулы воды. Вероятно, свой

зклад в это явление вносят и конформационные изменения фер-

мента. Независимые доказательства наличия структурных преоб-

разований глобулы при добавлении различных субстратов и одно-

л двухвалентных активаторов получены также при спектроскопи-

ческих исследованиях в лаборатории Сьюлтера [52].

Кроме АДФ и АТФ пируваткиназа может превращать и дру-

гие нуклеотидные субстраты, но эта способность зависит от при-

эоды нуклеотида и от величины рН [9]. Пока неизвестно, еущест-

зует ли корреляция между максимальными скоростями и усиле-

нием релаксации для соответствующих комплексов, подобно

наблюдавшейся у креатинкиназы. Интересно, что предварительные

эксперименты свидетельствуют об обратной зависимости между

усилением релаксации комплекса E—M—ФЕП и природой при-

сутствующего иона одновалентного металла [77]. Чем слабее ион

Vl+ как активатор, тем значительнее усиление релаксации трой-

ного комплекса. Пока еще не ясно, в какой степени это является

следствием изменений в значениях е

и констант диссоциации

РЭП из комплекса [112]. Тем не менее подобные данные !свиде-

тельствуют о важной роли одновалентных ионов, которые, воз-

ложно, образуют центр связывания для карбоксильной группы

РЕП [77].

Дополнительные доказательства присутствия одновалентных

сатионов в каталитическом центре пируваткиназы получены в

!редварительных экспериментах с таллием [85]. Наиболее рас-

гространенный изотоп

205

Tl имеет спин '/г, что позволяет исполь-

ювать его для резонансных измерений. Результаты этих экспери-

лентов говорят о наличии в ферменте взаимодействия между Tl

I Mn. Следовательно, их центры связывания достаточно близки

фуг к другу.

3.4. Фосфоенолпируваткарбоксикиназа

(фосфопируваткарбоксилаза)

Подобно пируваткиназе и другим ферментам, превращающим

Е>ЕП [5], фосфоенолпируваткарбоксикиназа относится к типу II.

£е реакция очень похожа на реакцию пируваткиназы и пируват-

сарбоксилазы. Она подробно рассмотрена в гл. 14.

3.5. Аденилаткиназа

Реакция, катализируемая аденилаткиназой, может быть пред-

ставлена в виде [86]

МАТФ

- + АМФ

- Т—M АДФ" + АДФ

680

Г лава 18

где роль металла могут играть Mg, Mn, Ca или Со [36]. Специ-

фичность этого фермента к ионам металлов требует некоторых

пояснений. Первоначально сообщалось, что для обратной реак-

ции, катализируемой ферментом из мышц кролика, ион Ca

не является активатором. Однако тот факт, что по данным ЯМР

аденилаткиназа относится к типу I, заставил более внимательно

изучить явление активации. При этом было обнаружено, что хотя

Ca+

— действительно слабый активатор при протекании реакции

в направлении образования АТФ (его эффективность в 10 раз

меньше, чем у Mg

+), он почти так же хорошо, как и Mg

+, акти-

вирует прямую реакцию [36]. Такое аномальное поведение каль-

ция пока остается не понятым, хотя и представляется заманчи-

вым объяснить его тем, что Ca

+ вступает в комплексы с АТФ и

АДФ и выходит из них примерно на два порядка быстрее, чем

+ или Mn

+. К сожалению, в литературе отсутствуют убеди-

тельные данные о подобных свойствах и других киназ.

Наиболее подробно изучена аденилаткиназа, выделенная иг

мышц кролика. Она построена из единственной полипептндног

цепи с молекулярной массой 21 ООО и имеет два активных центра

Низкая молекулярная масса делает ее удобной для измерени?

методом сканирующей ЯМР-спектроскопии. Предварительные

эксперименты [87] продемонстрировали наличие значительны?

сдвигов протонов Н-2 и Н-8 АТФ при связывании с ферментом

Как уже указывалось, этот фермент относится к типу I, т. е

Mn связывается с аденилаткиназой через АТФ. Первоначальнс

графический анализ результатов измерений протонного резонансе

привел к таким значениям усиления релаксации комплексг

МпАТФ—Е, которые превосходили даже теоретически возможны?

максимум (особенно при температурах 30—40

C) [5, 36]. Bno

следствии при обработке этих данных на ЭВМ [61] были полу

чены более реальные значения, аналогичные наблюдавшимся }

других ферментов (табл. 18.2). Согласно результатам машинногс

анализа, аденилаткиназа, скорее всего, имеет два центра связы

вания для МпАТФ

Было найдено, что различные нуклеозидтрифосфаты действую:

как дополнительные субстраты для аденилаткиназы. Обнаружен*

и соответствующая корреляция между максимальными скоро

стями и усилением релаксации марганцевого комплекса [36]

Другими словами, и для этого фермента наблюдаются индуци

руемые субстратами изменения конформации, степень которы;

зависит от природы субстрата. Комплекс МпАДФ—E исследоват]

не удалось.

Аденилаткиназа имеет два реакционноспособных остатка ци

стина, и хотя они необходимы при проявлении каталитическо!

активности, в некоторых случаях оказалось возможным провеет!

их модифицирование без полной инактивации фермента. Так, ре

Киназы

681

Таблица 18.2

Усиление релаксации у различных комплексов марганца

относится к усилению релаксации бинарного комплекса М—S;

^ соответствует бинар-

ному комплексу Е—М, a £^ — тройному комплексу, содержащему фермент, металл и суб-

страт. Усиление релаксации для ионов Mn

+ в отсутствие комплексующего агента принято

за 1,0. Данные заимствованы из работ [35, 36, 57, 59, 72, 100]. В некоторых случаях они бы-

ли пересчитаны на ЭВМ [61].

Усиление релаксации

Комплекс

МПАДФ-

1,6

МпАТФ

1,7

Мп-пируваткиназа

АДФ—Мп-пируваткиназа

АТФ—Мп-пируваткиназа 13

Фосфоенолпируват—Мп-пируваткиназа

Мп-креатинкиназа 1,5

Мп-АДФ—креатинкиназа

Mn-АТФ—аденилаткиназа

Mn -дАТФ—аденилаткиназа

Мп-АДФ—аргининкиназа

Mn—фосфоенолпируваткарбоксикиназа 14

акция SH-группы с дитио-бие-нитробензойной кислотой (ДТНБ)

приводит к полной потере активности [88], но после реакции с

некоторыми органическими производными ртути, также взаимо-

действующими с сульфгидрилом, фермент еще сохраняет значи-

тельную часть каталитической активности [89]. По данным про-

тонной релаксации, МпАТФ

связывается с аденилаткиназой,

модифицированной одним из таких соединений (с производным

меркурбензоата) [36], и не связывается при использования про-

изводных ДТНБ [88].

Милдван и Кон [5] считают, что роль металла-активатора со-

стоит в сближении лигандов для облегчения реакции. Можно

предположить, что использование сканирующей ЯМР-спектроско-

пии и спиновых меток приведет к более подробным сведениям об

активном центре.

3.6. Гексокиназа

Гексокиназа катализирует перенос фосфорильной группы от

АТФ к глюкозе. Наиболее подробно изучен дрожжевой фермент,

хотя некоторое внимание исследователи уделили и гексокиназс

44—2451

682

Г лава 18

мышц и мозга. Фермент обладает широкой специфичностью как к

нуклеотидным, так и к углеводным субстратам [90].

Гексокиназа, особенно дрожжевая, была объектом широких

кинетических исследований. При этом были получены как свиде-

тельства того, что имеет место упорядоченный механизм [91] с

определенной последовательностью связывания глюкозы и

М^АТФ

, так и противоположные аргументы в пользу независи-

мого присоединения субстратов к свободному ферменту по типу

бы,строго статистического равновесия [92]. Подобное противоре-

чие еще раз подчеркивает, что на основании чисто кинетических

экспериментов очень трудно получить однозначный ответ о меха-

низме действия фермента.

Группа французских исследователей впоследствии представи-

ла ,результаты физико-химического изучения гаксокиназы, кото-

рые в некоторой степени подтверждают их гипотезу об упорядо-

ченном механизме. Им удалось показать, что фермент из дрож-

жей связывает глюкозу прочнее, чем А^АТФ

[93]. Подробное

исследование ингибирования фермента позволило Kocoy и Роузу

[94] заключить, что при некоторых условиях (малые или уме-

ренные ингибирующие концентрации М§АДФ~) продукты реак-

ции выделяются в определенной последовательности — сначала

глюкозо-6-фосфат, а затем АДФ.

Первые результаты исследования протонной релаксации, вы-

полненные Кон [4], свидетельствуют о том, что гексокиназа от-

носится к типу I. Тем самым в какой-то степени поддержи-

вается представление об упорядоченном механиме. Оказалось, что

усиление релаксации МпАДФ- или МпАТФ

наблюдается только

в присутствии глюкозы. Однако последнее можно объяснить и

тем, что комплекс Mn—нуклеотид может ферментом связываться

двояко: без глюкозы — со слабым усилением, в присутствии глю-

козы — с большим усилением [5]. Очевидно, для выяснения меха-

низма необходимы дальнейшие исследования.

3.7. З-Фосфоглицераткиназа

Этот фермент катализирует обратимый перенос фосфорильной

группы от АТФ к 3-фосфоглицерату. По данным широких кине-

тических исследований фермента из дрожжей его свойства пред-

ставляются очень похожими на свойства креатинкиназы [95].

Результаты измерений протонной релаксации свидетельствуют

о том, что 3-фосфоглицераткиназа относится к типу I [4]. Срав-

нительно небольшая молекулярная масса (45

ООО)

и простота

выделения из многих тканей позволяют надеяться, что этот фер-

мент будет удобным объектом в дальнейших физико-химических

исследованиях.