Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Карбоангидраза

623

121. Moskowitz A., Proc. R. Soc., А297, 16 (1967).

122. Ward R. L., Biochemistry, 8, 1879 (1969).

123. Ward R. L., Biochemistry, 9, 2447 (1970).

124. Galley W. C., Stryer L., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 60, 108 (1968).

125. Fabry M. E., Koenig S. H., Schillinger W. E., J. Biol. Chem., 245, 4256

(1970).

126. Hamilton C. L., McConnell H. M., in A. Rich, N. Davidson (eds.), Structural

Chemistry and Molecular Biology, Freeman, San Francisco, 1968, p. 115.

127. Griffith O. H., Waggoner A. S., Accounts Chem. Res., 2, 17 (1969).

128. Stone T. J., Buekman T., Nordio P. L., MeConnell H. M., Proc. Natn. Acad.

Sci. U. S., 54, 1010 (1965).

129. MeConnell H. M., Hamilton C. L., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 60, 776

a968).

130. Hubbell W. L., McConnell H. M., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 63, 16

(1969).

131. Rozantzeo E. G., Neiman M. B., Tetrahedron, 20, 131 (1964).

132. Rozantzev E. G., Krinitzkaya L. A., Tetrahedron, 21, 491 (1965).

133. Mushak P., Coleman J. E., unpublished data.

134. Itzkowitz M. S., Ph. D. Thesis, California Institute of Technology, 1966.

135. Lindskog S., Ehrenberg A., J. Mol. Biol., 24, 133 (1967).

136. Lipscomb W. N., Hartsuck J. A., Reeke G. N., Quiocho F. A. et al., in «Structu-

re Function and Evolution of Proteins», Brookhaven Symp. Biol., 21, 24

(1969).

137. Lipscomb W. H., Hartsuck J. A., Quiocho F. A., Reeke G. N., Proc. Natn. Acad.

Sci. U. S., 64, 28 (1969).

138. Pocker Y., Storm D. R., Biochemistry, 7, 1202 (1968).

139. Pocker Y., Stone J. T., Biochemistry, 7, 3021 (1968).

140. Eigen M., Kustin K, Moss G., Z. Phys. Chem., 30, 130 (1961).

141. Kern D. M., J. Chem. Educ., 37, 14 (1960).

142. Ho C., Sturtevant J. M., J. Biol. Chem., 238, 3499 (1963).

143. Gibbons B. H., Edsall J. T., J. Biol. Chem., 238, 3502 (1963).

144. Roughton F. J. W., Physiol. Rev., 15, 241 (1935).

145. Roughton E. J. W., Harvey Lect. Ser., 39, 96 (1943).

146. Davies R. E., Biol. Rev. Cambridge Phil. Soc., 26, 87 (1951).

147. Cain S. M., Otis A. B., J. Appl. Physiol., 16, 1023 (1961).

148. Davis R. P., J. Am. Chem. Soc., 60, 5209 (1958).

149. Davis R. P., in P. Boyer, H. Lardy, K. Myrback (eds.), The Enzymes, Vol. 5,

Academic Press, New York, 1961, p. 545.

150. Wang J. H., Science, 161, 328 (1968).

151. Eigen M., Discuss. Faraday Soc., 39, 7 (1965).

152. Caplow M., J. Am. Chem. Soc., 93, 230 (1971).

153. DeVoe H., Kistiakowsky G. B., J. Am. Chem. Soc., 83, 274 (1961).

154. Sargeson A. M., in F. P. Dwyer, D. P. Mellor (eds.), Chelating Agents and

Metal Chelates, Academic Press, New York, 1964, p. 183.

155. Eigen M., Wilkins R. G., Mechanisms of Inorganic Reactions, Adv. Chem. Ser.,

No. 49, American Chemical Society, Washington, D. C., 1965, p. 55.

156. Coleman J. E., unpublished data.

157. Malmstrom B. G., personal communication, 1971.

ГЛАВА 17

ФОСФАТНЫЙ ПЕРЕНОС

И ЕГО АКТИВАЦИЯ ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ;

ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА

Т. Г. Cnupo

Spiro Т. G., Department of Chemistry, Princeton University,

Princeton, New Jersey, USA

1. ФОСФАТЫ и БИОЭНЕРГЕТИКА

Можно утверждать, что фосфор является пятым из важнейших

для биологии элементов вслед за углеродом, водородом, кислоро-

дом и азотом. Значительный интерес для химиков-неоргаников

представляет тот факт, что, в то время как четыре основных эле-

мента входят в огромное множество сложных органических моле-

кул, биохимия фосфора ограничивается главным образом произ-

водными иона ортофосфата. Подавляющее большинство этих

производных являются просто эфирами и ангидридами фосфорной

кислоты, хотя существуют и такие, в которых есть связи между

фосфором и азотом или серой. Интересно также то, что биохимия

фосфора в основном тесно связана с ионами двухвалентных ме-

таллов. Можно полагать, что фосфаты и их производные, а также

их взаимодействия с ионами металлов составляют раздел неор-

ганической химии, однако вклад химиков-неоргаников в эту

обл асть в действительности довольно скромен. Хотя им и принад-

лежит несколько превосходных работ по химии фосфатов, их ин-

терес к этим соединениям невелик. В биохимическом же мире,

напротив, по крайней мере три десятилетия после того, как Лип-

ман

;[

1—3] указал на их важность, они находятся в центре

внимания.

Фосфаты играют две ключевые роли в биологии. Во-первых,

они служат структурными элементами ряда биологических ком-

понентов: например, сахарофосфатный остов нуклеиновых кислот

или отложения фосфата кальция костей и зубов. Вторая, более

интересная роль связана с переносом энергии. По-видимому, фос-

фат представляет собой универсальную энергетическую «размен-

ную монету» в живых организмах. Сокращение мышц, перенос

ионов через мембраны против градиента концентрации и очень

большое число реакций биосинтеза — эти потребляющие энергию

процессы осуществляются благодаря переносу фосфорильных

групп (РОз) от высокоэнергетических акцепторов к низкоэнерге-

тическим.

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

625

1.1. Потенциалы переноса фосфорильной группы

Свободная энергия, запасаемая в фосфатных связях в природ-

ных соединениях, может составлять 13 ккал/моль. На основе сво-

бодной энергии гидролиза фосфатных производных, называемой

также потенциалом переноса фосфорильной группы [1], построена

удобная энергетическая шкала. Некоторые характерные величины

![4, 5] приведены в табл. 17.1. Эти !свободные энергии сильно

зависят от концентраций протонов и ионов !металлов, которые по-

разному взаимодействуют с реагирующими соединениями и про-

дуктами гидролитических реакций. Данные, приведенные в

табл. 17.1, относятся к стандартным условиям (рН 7,0, концентра-

Таблица 17.1

Стандартная свободная энергия гидролиза фосфатных

производных [5]

Соединение

-AF',

ккал/моль

Енолпируват-Р

12,8

З-Фосфоглицерил-Р

11,8

Креатин-Р

10,5

Ацетил-Р

10,1

Аргинин-Р

9,0

АТФ (а-ангидрид)

8,0

АТФ (|3-ангидрид)

6,9

Пирофосфат

6,6

АДФ > • .

6,4

Глюкозо-I-P

5,0

Глицеро-2-Р

4,2

Глюкозо-6-Р

3,3

Глицеро-1-Р

2,3

a Z—

R—P обозначает R-PO3 .

Стандартные условия: рН 7,0, 25 °С, 0,01 M Mg

ция Mg

+ 0,01 М, 25 °С), которые близки к обычным физиологи-

ческим. Кроме того, стандартное состояние, как обычно, основы-

вается на шкале молярных концентраций для реагирующих

веществ и продуктов реакции, но не для растворителя. Актив-

ность растворителя принята равной единице, хотя в рассматри-

ваемом случае он тоже участвует в реакции. Если бы учитыва-

42—2451

'<626

Глава 17

лась молярная концентрация воды (55,5 М), то все изменения

свободной энергии уменьшились бы на 2,4 ккал/моль и тогда

стало бы очевидным, что простые фосфорные эфиры, такие, как

глицеро-1-фосфат, по стабильности не намного уступают ортофос-

фату. Тем не менее в водном растворе из-за большого избытка

воды по отношению к глицерину реакция гидролиза протекает

почти до конца.

Известно, однако, несколько фосфатных производных, таких,

как фосфоенолпируват, креатинфосфат и ацетилфосфат, при гид-

ролизе которых освобождается 10—13 ккал/моль свободной энер-

гии. Неустойчивость фосфатной связи в этих молекулах объясня-

ется их структурными особенностями [6]. В фосфоенолпирувате

существует значительное отталкивание зарядов анионных фос-

фатной и карбоксильной групп, энергия которого оценивается в

3—4 ккал/моль, однако основной движущей силой реакции гидро-

лиза служит переход образующейся пировиноградной кислоты из

енольной в более устойчивую кето-форму, свободная энергия кото-

рой на 6—9 ккал/моль меньше:

OPOi;- ОН

_ CH

=C-COO- + HOH V CH

=C-COO

+ HOPOf (1)

фосфоенолпируват пировиноградная кислота

(енольная форма)

-C-COO"

пировиноградная кислота

(кето-форма)

В ацетилфосфате существует аналогичное отталкивание атомов

кислорода фосфатной и находящейся в непосредственной близо-

сти карбоксильной групп, но и здесь основной энергетический

вклад вносит последующее превращение продукта, заключающее-

ся в этом случае в ионизации уксусной кислоты при нейтральном

рН благодаря резонансной стабилизации ацетата-иона.

О о

Il 11

-C-O-POf + HOH CH

-C-OH + HOPOf

сн

—соо" + н+ , ; (2)

Гидролиз креатинфосфата

C +NH

I Il

"OOC -CH

-N-C -NH-POf

приводит к продуктам — креатину и ортофосфату — с повышенной

резонансной стабилизацией, но основным фактором здесь явля-

ется меньшая прочность связи P—N по сравнению с Р—О.

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

627

Пирофосфат занимает промежуточное положение на шкале

потенциалов групп (6,6 ккал/моль). В нем также есть электро-

статическое отталкивание двух фосфатных групп, а образование

ортофосфат-иона, по-видимому, приводит к некоторому увеличе-

нию делокализации электронов кислорода. Похожая ситуация

обнаружена и для нуклеозидполифссфатов, которые все харак-

теризуются близкими значениями свободной энергии гидролиза.

Свободные энергии гидролиза полифосфатов особенно чувстви-

тельны к рН, поскольку и продукты реакции и реагирующие ве-

щества ионизуются в нейтральной области. Соответствующие зна-

чения рK

таковы [7]: H

POI-6,9; H

- 6,1; HP

"-8,4;

ATO

-— 4,1; НАТФ

- —6,5; Н

АДФ~—4,0; НАДФ

-—6,4;

АМФ°—3,8; НАМФ-—6,0. Для других нуклеотидов эти вели-

чины примерно такие же. Кроме того, большое значение имеет

связывание двухвалентных катионов как продуктами реакции,так

и реагирующими соединениями. Логарифмы констант устойчиво-

сти [7] для комплексов типа 1:1 с Mg

+ следующие: 1,9 для

HPO

, 6,4 для P

, 4,0 для АТФ

~, 3,1 для АДФ

~ и 2,0 для

АМФ

- (т. 2, гл. 33, табл. 33.1).

Изменение свободной энергии при переносе фосфорильной

группы от одного акцептора к другому можно определить, вычи-

тая потенциал переноса группы второго фосфатного производ-

ного из аналогичной величины для первого. Почему эта свобод-

ная энергия используется организмом, а не рассеивается в окру-

жающей воде в результате гидролиза? Причина заключается в

том, что гидролиз фосфатов при нейтральном рН представляет

собой медленный процесс, несмотря на большое изменение свобод-

ной энергии. По-видимому, такие нуклеофилы, как вода или гид-

роксил, отталкиваются отрицательно заряженным кислородным

атомом фосфата. Поэтому перенос фосфорильных групп может

контролироваться ферментами. Сравнительно широкий диапазон

потенциалов переноса групп в сочетании со значительным кине-

тическим барьером являются отличительными особенностями фос-

фатных производных, позволяющими им служить посредниками

в биологическам переносе энергии.

1.2. Фосфорилирование и фосфоролиз

Оказывается, что существует единственный посредник в дви-

жении энергии при переносе фосфорильной группы. Это молекула

аденозинтрифосфата (АТФ). В высших организмах энергия, вы-

деляющаяся при восстановлении кислорода, запасается в виде

АТФ в результате прямого синтеза из аденозиндифоофата (АДФ)

и ортофосфата. Во всех организмах гликолиз Сахаров приводит

к образованию высокоэнергетических 1,3-дифосфоглицерата и

фосфоенолпирувата, которые отдают свои фосфорильные группы

40*

'<628

Глава 17

АДФ [8, 9]. Последующее использование энергии происходит при

передаче фосфорильной группы АТФ акцепторам, которые обес-

печивают сокращение мышц, транспорт ионов и реакции биосин-

теза [8]. В конце концов эта фосфорильная группа гидролизу-

ется до ортофосфата и может опять участвовать в синтезе АТФ.

Существует, конечно, много поступлений в этот фосфатный поток.

Например, клетки мышц образуют большое количество высоко-

энергетического креатинфосфата, который может быстро фосфо-

рилировать АДФ, если в течение короткого интервала времени

для сокращения мышцы необходимо много АТФ.

Еще один процесс, который имеет отношение к превращению

энергии, — это фосфоролиз, названный так по аналогии с гидро-

лизом. В этом процессе расщепление связей в субстрате происхо-

дит под действием фосфата, а не воды. Так, например, гликоген,

запасной полимер глюкозы, распадается не путем гидролиза до

глюкозы, а в результате фосфоролиза до глюкозо-1-фосфата:

гликоген

-f-

HPOf

глюкозо-1-фосфат (3)

Из энергетических соображений преимущество фосфоролиза над

гидролизом состоит в сохранении примерно 5 ккал на моль глю-

козы (табл. 17.1.), тем более что глюкозо-1-фосфат может быть

непосредственно использован в дальнейшем метаболизме.

Изменение свободной энергии для реакции (3), как и для дру-

гих реакций фосфоролиза, невелико. Несмотря на это, биосинтез

гликогена не протекает в результате обращения реакции (3).

Глюкозо-1-фосфат предпочтительнее соединяется с уридинтрифос-

фатом (УТФ) с образованием УДФ-глюкозы и освобождением

пирофосфата:

глюкозо-1-фосфат + УТФ УДФ-глюкоза + HP

(4)

Затем УДФ-глюкоза присоединяет свой остаток глюкозы к

растущей цепи гликогена:

УДФ-глюкоза + гликоген,, *• гликоген

п+1

-J-УДФ (5)

и УДФ опять фосфорилируется под действием АТФ

УДФ + АТФ —V УТФ + АДФ (6)

Реакция (4) представляет собой обращение процесса, аналогич-

ного фосфоролизу, но с участием пирофосфата, т. е. пирофосфо-

ролиз. Как и для фосфоролиза, изменение свободной энергии для

этой реакции мало. Однако она сдвигается в сторону завершения

в результате последующего гидролиза пирофосфата:

- + H

O HPOl- + H

POJ (7)

с освобождением 6,6 ккал/моль. В целом процесс расходует мно-

го энергии, но ясно, что он надежнее, чем обращение реак-

ции (3), которое зависело бы от неожиданных изменений кон-

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

629;

центрации свободного фосфата в организме. По-видимому, общей

закономерностью распада биологических макромолекул — нуклеи-

новых кислот, белков и липидов, а также полисахаридов, явля-

ется то, что он протекает посредством фосфоролиза, в то время

как их синтез включает стадию активации, энергию для которой

дает гидролиз выделившегося пирофосфата ![10].

2. МЕХАНИЗМЫ ПЕРЕНОСА ФОСФАТА

2.1. Расщепление связей P—О и X—О

Возможны два основных пути протекания реакций, объединяе-

мых названием «перенос фосфата». Их можно представить сле-

дующим образом:

O(RI) P(R

)

Yf-Wx

O(R

)

р-£оХ —> Y-P^-O + XO: (T)

о I V O(R

)

P(R

)

'X-O-P

Y-X + О

O(R

)

O(R

)

O(R

)

(II

Для простоты здесь опущены протоны и заряды. R

и R

могут

присутствовать или отсутствовать. Тризамещенные фосфаты, по-

видимому, редко встречаются в биохимических системах.

Путь (I) представляет перенос фосфорильной группы от одно-

го акцептора (XO) к другому (Y) или обратный процесс. Он

включает разрыв связей P—О или P—Y. Важнейшим классом

реакций этого типа являются реакции переноса фосфорильной

группы к АДФ или от нее. Ферменты, которые их катализируют,

называются киназами. Они рассмотрены в гл. 18. Путь (II)

представляет перенос электрофила X от фосфата к Y или наобо-

рот. В этом случае разрываются связи X—О или X—Y. При от-

сутствии Ri и R

реакцией, обратной (II), будет процесс, извест-

ный как фосфоролиз [см. уравнение (3)], а осуществляющие его

ферменты называются фосфорилазами [11]. Если Ri — фосфо-

рильная группа, a R

отсутствует, то путь (II) —это реакция, об-

ратная пирофосфоролизу. Например, в реакции (4) кислородный

атом фосфата в глюкозо-1-фосфате представляет собой нуклео-

фил Y, а а-фосфорный атом УТФ—электрофил X. Ферменты,

катализирующие подобные реакции, раньше назывались пирофос-

'<630

Глава 17

форилазами, однако теперь их называют синтетазами, чтобы под-

черкнуть тот факт, что они осуществляют стадии активации в

процессах биосинтеза. Общим правилом оказывается то, что ак-

u0u

/Л /OPO

глюкозо—О

-P-O "Р —О—P^

"уридиндифосфатглюкоза

/ / \ i О

О OOo

(4)

тивирующей группой, как и в реакции (4), служит нуклеотид.

Следовательно, синтетазные реакции можно также рассматривать

как путь (I), если Ri—это нуклеозид [уридин в реакции (4)], а

OX — пирофосфат. Важно то, что разрывается связь P—О. Даже

фосфоролиз может приводить к расщеплению связи P—О, если

атаке фосфатом под действием полинуклеотидфосфорилазы под-

вергается нуклеиновая кислота [12].

2.2. Гидролиз

На вопрос о том, протекает ли рассматриваемая реакция пе-

реноса фосфата посредством разрыва связи P—О или X—О,

часто можно ответить, анализируя продукты реакции, хотя фер-

ментативные реакции могут быть сложнее, чем представляются

при поверхностном рассмотрении, и нередко включают образова-

ние промежуточных соединений. Иногда их можно обнаружить,

используя метку

O, по методу, предложенному Кон [13]. Если

нуклеофилом служит вода, то расщепление связей P—О и X—О

приводит к одним и тем же продуктам реакции и использование

воды, меченной

O, является единственным способом сделать

выбор. В случае пути (I) метка оказывается в фосфате, а в слу-

чае пути (II)—в НО—X:

O(R

) O(R

)

O^P-OX — НО*-Р' +HOX (I')

O(R

) O(R

)

/ /

О*^Х4Э-Р^ —+ НО*Х + HO-i> (

\ О \

O(R

) O(R

)

Этим методом изучено большое число реакций ферментативного

гидролиза, и, как оказалось, все они протекают исключительно

через расщепление связи P—О (путь Г).

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов 629;

В неферментативных гидролитических реакциях, напротив, в

зависимости от условий происходит расщепление как P—О-, так

и С—О-связей [14]. В случае монозамещенных фосфатов ди анион

ХОРОз" и моноанион XOPO

H- гидролизуются с расщеплением

связи P—О, в то время как нейтральная молекула ХОРО3Н2

гидролизуется с расщеплением связи С—О, причем X может быть

алкильной, арильной, ацильной или гликозильной группой.

Известен также катализируемый кислотой процесс, при кото-

ром расщепляются обе связи, P—О и С—О, но в разной степени

в зависимости от эффективности X в качестве уходящей группы.

В диэфирах фосфорной кислоты одновременное расщепление

связей P—О и С—О происходит как в нейтральной, так и в мо-

ноанионной формах. Триэфиры фосфорной кислоты сравнительно

быстро атакуются ионом гидроксила с разрывом связи P—О.

Для установления детального механизма реакций интенсивно

изучался неферментативный гидролиз производных фосфата [14].

Естественно, что внимание обычно фокусируется на пути, сопро-

вождающемся разрывом связи P—О, поскольку именно он ис-

пользуется гидролитическими ферментами. Этот путь включает

нуклеофильную атаку на фосфор и разрыв связи P—О, и инте-

ресно установить порядок, в котором происходят эти две стадии.

Две крайние возможности таковы: 1) диссоциативный механизм,

в котором расщепление P—О приводит к производному трехко-

ординационного метафосфата (РОз), реагирующему затем с нук-

леофилом, и 2) ассоциативный механизм, в котором при нуклео-

фильной атаке образуется пятикоординационное производное,

отщепляющее затем уходящую группу ОХ. Нет необходимости

говорить о возможности механизма, занимающего промежуточное

положение между двумя крайними случаями, такого, в котором

появление и разрушение связей происходит одновременно, без

образования промежуточного соединения.

A priori пятикоординационное ,промежуточное соединение,

по-видимому, более вероятно, чем трехкоординационное.

Существует много стабильных пятикоординационных сое-

динений фосфора, в том числе оксифосфораны, у кото-

рых во всех пяти координационных положениях на-

ходятся атомы кислорода. Стабильные же трехкоординационные

соединения фосфора (V) неизвестны. [Соединения фосфора (III),

конечно, являются трехкоординационными, однако нет указаний

на то, что гидролиз фосфатов включает окислительно-восстанови-

HO: P-OX

OQR

HO-P-OX

<Г

O /

HO-P^

+ XOH + ОН

'<532 Глава 17

тельные реакции фосфора.] Пятикоординационное промежуточное

соединение, по-видимому, участвует в гидролизе триэфиров фос-

форной кислоты, энергия активации для которого меньше, чем

для гидролиза диэфиров и моноэфиров [3] (см. также гл. 34).

Несомненно, быстрый гидролиз зтиленметилфосфата трудно по-

нять без механизма псевдовращения Вестхаймера, который вклю-

чает такой интермедиат [16] (разд. 4.5).

С другой стороны, есть основания полагать, что гидролиз мо-

нозамещенных фосфатов происходит по диссоциативному меха-

низму. Имеются разнообразные доказательства участия мета-

фосфатного интермедиата в гидролизе ацил- [17] и ар ил фосфатов

[18]. Их можно обобщить следующим образом:

1. Скорость гидролиза дианионов ХОРОГ строго коррелирует

с константой кислотности уходящей группы XO

, что указывает

на значительное разрушение связи P—О в переходном состоянии.

В случае очень кислых уходящих групп, таких, как 2,4-дини-

трофенолят и n-нитробензоат, дианион гидролизуется быстрее

моноаниона XOPO

, хотя можно было бы ожидать, что боль-

ший отрицательный заряд дианиона затруднит нуклеофильную

атаку на фосфорный центр.

2. Скорость гидролиза моноанионов XOPO

значительно

хуже коррелирует с кислотностью уходящей группы. При слабо-

кислых уходящих группах моноанион гидролизуется быстрее диа-

ниона. Считают, что этот особый эффект связан с протонирова-

иием уходящей группы, после которого удаляется нейтральная

молекула XOH и образуется метафосфатный ион [14]:

-Q OyH*-)

OOHH

о. о

о. ,он

он

+ XOH

Если протон заменен на алкильную или арильную группу, этот

эффект исчезает и моноанионы диэфиров XO(RO)PO гидроли-

зуются быстрее моноанионов моноэфиров.

3. При сольволизе я-нитрофенилфосфата как в виде моно-,

так и дианиона в системе метанол — вода образование метил-

фосфата и ортофосфата происходит в том же отношении, в каком

присутствуют метанол и вода, хотя метанол является лучшим

нуклеофилом. Это служит доказательством того, что реакционно-

способное промежуточное соединение, метафосфат, реагирует с

водой и метанолом в одинаковой степени. В других смешанных

системах растворителей можно обнаружить отклонения от стати-

стического распределения продуктов, но эти отклонения легкс

объяснить эффектами селективной сольватации.