Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

633;

4. Энтропии активации гидролиза моно- и дианионов близки

с нулю, что указывает на мономолекулярный механизм. Бимоле-

кулярные реакции сольволиза обычно имеют значительную отри-

цательную энтропию активации (около 20 э. е.) из-за необходимо-

:ти ориентации атакующей молекулы растворителя.

2.3. Фосфатазы и фосфотрансферазы

Ферменты, которые катализируют гидролиз производных фос-

фата, называются фосфатазами [5]. Существует несколько фер-

ментов, роль которых, по-видимому, заключается в образовании

эртофосфата из моноэфиров фосфорной кислоты. Они малочувст-

вительны к природе заместителя в фосфате и называются неспе-

цифическими фосфомоноэстеразами. Существуют, однако, замет-

ные различия в диапазонах рН, в которых они работают, и по-

этому они делятся на кислые [19] и щелочные [20] фосфатазы,

штя бывают и промежуточные случаи. Другие фосфатазы дейст-

вуют на определенные субстраты, такие, как глюкозо-6-фосфат

[21], фосфосерин [21] и Б'-нуклеотиды [22]. Важным ферментом

является неорганическая пирофосфатаза [23], поскольку гидро-

лиз пирофосфата сопряжен со всеми синтетазными реакциями.

Некоторые киназы обнаруживают небольшую АТФ-азную актив-

ность. Активную АТФ-азу можно выделить из разрушенных ми-

тохондрий [9], и она без сомнения участвует в окислительном

фосфорилировании, посредством которого обращается гидролити-

ческая реакция.

Дизамещенные фосфаты гидролизуются ферментами фосфо-

диэстеразами. Некоторые из них неспецифичны, но большинство

участвует в гидролизе нуклеиновых кислот и называется нуклеаза-

ми. Существуют рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы (гл. 34), и

по действию они совершенно различны. Экзонуклеазы атакуют

фосфодиэфирные связи последовательно, начиная с одного конца

цепи нуклеиновой кислоты, в то время как эндонуклеазы атакуют

также и связи внутри цепи.

Часто предполагают, что при действии фосфатаз образуется

промежуточное фосфорилферментное соединение, которое затем

гидролизуется, и в некоторых случаях эта особенность механизма

вполне установлена. Некоторые фосфатазы, кроме гидролиза

фосфатов, катализируют также перенос фосфорильной группы к

нуклеофилам, отличным от воды, т. е. обнаруживают фосфотранс-

феразную активность. Так как водные растворы содержат 55,5 M

воды, то эти реакции иногда трудно заметить, если не использо-

вать смешанные растворители. В некоторых случаях, однако,

найдены такие нуклеофилы, которые даже в малой концентрации

эффективно конкурируют с водой. Неизвестно, имеют ли такие

реакции биологическое значение.

'<34

Глава 17

Важность катализа определенных стадий фосфотрансферазны:

реакций обычно очевидна. Киназы и синтетазы уже упомянуть

выше. Некоторые ферменты этого класса переносят фосфатнук

группу из одной части молекулы в другую. Примером может слу

жить фосфоглюкомутаза [24], которая превращает глюкозо-6-фос

фат, продукт фосфорилирования глюкозы под действием АТФ, i

глюкозо-1-фосфат, служащий субстратом в реакции (4). Интерес

но, что это превращение протекает через два фосфорилированны:

промежуточных соединения — фосфорилированный фермент i

глюкозо-1,6-дифосфат. Фосфатная группа первого из них перено

сится на ОН-группу глюкозо-6-фосфата, находящуюся в положе

нии 1, а затем образовавшийся глюкозо-1,6-дифосфат отдает фос

фатную группу из положения 6 ферменту.

Ферменты, относящиеся к классу фосфотранефераз, не фосфо

рилируют воду, т. е. не способны катализировать гидролиз. Не

известно, каким образом это оказывается возможным в водно*

растворе, и этот факт представляет собой один из самых интерес

ных аспектов механизма переноса фосфата. В случае некоторые

рибонуклеаз гидролизу предшествует стадия переноса фосфата

приводящая к образованию лабильного циклического 2',3'-нуклео

зидфосфата. Наиболее изучена из них панкреатическая рибону

клеаза [25].

2.4. Необходимость ионов металлов

Среди всех ферментов, переносящих фосфат, по-видимому

единственным хорошо охарактеризованным металлоферментом

т. е. ферментом, который сохраняет существенно важный метал;

при выделении, является щелочная фосфатаза, рассматриваема?

в следующем разделе. Согласно имеющимся данным, возможно

что фосфатаза из селезенки быка, гидролизующая фосфобелю

и другие монозамещенные фосфаты, представляет собой железо-

содержащий металлофермент [26].

Большинство ферментов, переносящих фосфат, нуждаются ДЛУ

активности в ионах двухвалентных металлов. Эти ионы сравни-

тельно легко удаляются из ферментов, что приводит к потере ак-

тивности. При добавлении металлов она восстанавливается

Поскольку единственными двухзарядными ионами, которые в фи-

зиологических условиях присутствуют в достаточном количестве

являются Mg

+ и Ca'

, то считают, что именно они выполняют

биологическую функцию. Однако влияние ионов металлов на фер-

менты может быть разным. Чаще всего наибольшей эффектив-

ностью обладает Mg

+. Некоторые металлы первого переходного

ряда, особенно Mn

+, могут заменять его, но активность фермента

при этом несколько понижается. Это же относится к Ca

+, однако

иногда он ингибирует реакцию, тогда как в некоторых случаях

+ служит активатором, а Mg

+ — ингибитором.

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

635;

Установление факта необходимости ионов металлов представ-

ляет иногда сложную задачу. Их влияние на активность может

маскироваться взаимодействиями с субстратом, примесями в пре-

парате фермента или дополнительными центрами связывания на

:амом ферменте. Обычно существует оптимальная концентрация,

при превышении которой наблюдается эффект ингибирования, и

величина этой оптимальной концентрации зависит от природы ме-

талла. Иногда хелатирующие агенты, например ЭДТА, увеличи-

вают активность, что может объясняться селективным связыва-

нием следов таких ионов, как Cu

+, которые сильно ингибируют

реакцию.

Несмотря на эти трудности, имеющиеся надежные данные

позволяют с уверенностью сделать несколько общих выводов о

потребности в ионах металлов. Двухзарядные ионы необходимы

для всех киназ и синтетаз. Фосфатазы обычно также нуждаются

в катионах, хотя известны и исключения, например неспецифиче-

ская кислая фосфатаза. Для фосфоглюкомутазы ион Mg

+ необ-

ходим, а для похожей на нее фосфоглицератмутазы нет [24].

Потребность в двухзарядном катионе характерна для нуклеаз,

механизм действия которых не включает образование на первой

стадии циклического нуклеотида [25]. Фосфорилазы, расщепляю-

щие связь С—О, не зависят от двухзарядных ионов, а расщеп-

ляющие связь P—О зависят, примером чему служит фосфоролиз

полинуклеотидов. Кроме того, ионы двухвалентных металлов

обычно, но не всегда необходимы для ферментов, переносящих

фосфат в том случае, если катализируется расщепление связи

P—О. Эти выводы суммированы в табл. 17.2.

Таблица 17.2

Необходимость ионов металлов для ферментов, переносящих фосфат

Нуждаются в двухзарядном катионе

He нуждаются в двухзарядном катионе

Неспецифические щелочные фосфатазы

Неспецифические кислые фосфатазы

Большинство других фосфомоноэстераз

Пирофосфатаза

Фосфоглюкомутаза Фосфоглицератмутаза

Нуклеазы, действующие как фосфоди-

эстеразы

Рибонуклеазы, образующие цикличе-

ский интермедиат, 2',3'-нуклеозид-

фосфат

Киназы

Синтетазы

Полинуклеотидфосфорилаза (расщепле-

ние связи P—О)

Другие фосфорилазы (расщепление

связи С—О)

'<36

Глава 17

3.. ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА

Щелочная фосфатаза из бактерии Escherichia coli заслуживает

особого внимания, поскольку это единственный хорошо охарак-

теризованный металлофермент из числа переносящих фосфат

В настоящее время он изучается в нескольких лабораториях, к

описание его структуры и механизма функционирования еще

далеко от завершения. Проводимый [27] рентгеноструктурный

анализ кристаллов фермента в значительной мере прояснит су-

ществующую картину. Тем не менее уже сейчас известны неко-

торые удивительные особенности этого фермента. Их подробное

обсуждение с акцентом на ферментативной кинетике дано Рей

дом и Вильсоном [28].

Используя обедненную фосфатом среду, можно вызвать обра

зование в Е. cali большого количества фосфатазы [29—31], кото

рую затем сравнительно нетрудно очистить и охарактеризовать

Она является неспецифической фосфомоноэстеразой [32] с опти

мумом рН в диапазоне 8,5—10,0. Фосфатаза катализирует такж<

гидролиз соединений с фосфоангидридной связью (например, пи

рофосфата и АТФ) и фторфосфата, но неактивна по отношению!

связям P—N и P—С [33, 54]. Интересно, что S-алкилтиофосфать

(RS—РОз) быстро расщепляются [34, 35], тогда как О-алкилтио

фосфаты (RO—PO

S) или не гидролизуются вообще [35], ил]

гидролизуются значительно медленнее [36] обычных эфировфос

форной кислоты. Кислая фосфатаза, напротив, расщепляе'

О-замещенные, но не S-замещенные эфиры тиофосфорной кис

лоты [35]. Известно также, что щелочная фосфатаза переноси'

фосфат на нуклеофилы, отличные от воды [37].

3.1. Присоединение металлов

Очищенный фермент содержит прочно связанные ионы цинк;

и похож в этом отношении на два других гидролитических фер

мента — карбоксипептидазу (гл. 15) и карбоангидразу (гл. 16)

Молекулярная масса нативной фосфатазы равна 80 000 [38—40]

В кислом растворе молекула белка диссоциирует на две идеи

тичные субъединицы [40—43]. При высокой концентрации цинк;

образуется тетрамерная форма, причем положение равновеси

димер^тетрамер зависит от рН [44].

Число атомов цинка в составе нативного фермента составляет

по данным разных авторов [34, 45—50], от двух до четырех и

димерную молекулу. Можно считать установленным, что тольк

два атома цинка определяют каталитическую активность фер

мента. Из экспериментов Коэна и Вильсона [45] по равновесном

связыванию, в которых фосфатазная активность измерялась

присутствии буферных растворов цинка, следует, что активност

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

637;

молекулы фермента, содержащей один ион цинка, составляет

12% активности комплекса с двумя (или более) ионами этого

металла. Константы комплексообразования, полученные в этой

работе при рН 8,5 и 25

C в присутствии 1 M NaCl, оказались

различными для двух ионов цинка: p/Ci=7,66 и р/Сг= 10,22. По

данным Чопак [46], использовавшей метод равновесного диали-

за, обе эти константы при рН 8,5 и 25

C в присутствии 0,1 M

KNO

значительно меньше и различаются только на статистиче-

ский множитель, равный четырем: PZC

=Il

Ie и р/Сг= 11,76.

Уменьшение этих величин при рН меньше 8,5 описывается кривой

с наклоном, примерно равным единице. Третий и четвертый ионы

цинка диссоциируют значительно легче двух первых, определяю-

щих активность [48].

Ионы цинка можно удалить обработкой хелатирующими аген-

тами. Образующийся апофермент может присоединять затем раз-

нообразные двухзарядные ионы [49, 51]: Mn

+, Со

+, Ni

+, Cu

+, Hg

+. Прочность комплексов для центра с наименьшим

сродством уменьшается в ряду Cd

+=Mn

+>Zn

+>Co

+>Ni

[49, 50]. Положение Cu

+ и Hg

+ в этом ряду неизвестно, однако

+, по-видимому, присоединяется прочнее Zn

+ [50]. Каталити-

ческая активность обнаружена лишь у Со

+-фосфатазы и состав-

ляет только 12%) активности нативного фермента, содержащего

+ [52—54]. Со

+-форма фермента не обнаруживает трансфе-

разную активность с нуклеофилами, которые эффективны с

^epMeHTOM.

Со

+-Фосфатаза представляет особый интерес, так как элек-

тронный спектр Co (II) дает возможность судить о геометрии ко-

ординации в активном центре. Видимый спектр Со

+-фермента

имеет необычный вид [48, 55], и для него характерны максимумы

при 640, 610, 555 и 510 нм. Молярные коэффициенты поглощения

при этих длинах волн равны соответственно 250, 210, 350 и 280.

Эта картина похожа на наблюдаемую для Со(II)-карбоангидразы

(гл. 16). Она не отвечает ни октаэдрической, ни тетраэдрической

координации лигандов Co(II). В некоторой степени похожие

спектры получены для пятикоординационных комплексов ко-

бальта с расположением лигандов в вершинах псевдотригональ-

ной бипирамиды [56, 57], хотя в случае фермента расщепление

полос более выражено, что свидетельствует о пониженной симмет-

рии [48]. Спектры кругового дихроизма в видимой области слож-

ны [48, 55]. Спектры ЭПР присоединенного к фосфатазе иона

+ указывают на изменение его окружения при связывании вто-

рого иона этого металла [50].

Информация о центрах присоединения металлов на ферменте

неполна. Тейт и Вейлли [58] предположили, что лигандами цинка

служат три остатка гистидина, поскольку фотоокисленный апо-

фермент, степень разрушения гистидина в котором выше, чем в

'<638

Глава 17

нативном ферменте, не способен к присоединению обычных коли-

честв цинка и неактивен. Рейнольде и Шлезингер [47] из сравне-

ния кривых титрования нативного и апофермента также заклю-

чили, что в связывании цинка участвуют два или три остатка

гистидина. Характерный спектр и активность Со

+-фосфатазы ис-

чезают при добавлении кислоты [48]. Точка перехода находится

при рН 7,0, что согласуется с ионизацией гистидина [47]. Спек-

трофотометрическим титрованием установлено, что при удалении

из фермента цинка шесть остатков тирозина приходят в контакт

с растворителем [59]. Это согласуется с участием тирозина в

связывании цинка, хотя другой причиной такого эффекта может

быть изменение конформации.

3.2. Фосфорилфермент

Тот факт, что перенос фосфата протекает через ковалентное

промежуточное соединение, фосфорилфермент, служит основой

предполагаемого механизма катализа щелочной фосфатазой. Фос-

форилированный белок можно осадить из смеси фосфата с фер-

ментом прибавлением трихлоруксусной кислоты [60]. Анализ про-

дуктов расщепления белка показывает, что фосфат присоединен

к остатку серина [61]. В щелочной среде обнаружить ковалентно

присоединенный фосфат не удается, однако Вильсон и сотр.

[62—67] с помощью кинетических и изотопных методов показали,

что фосфорилфермент образуется при всех значениях рН и что он

идентичен фосфорилированному белку, выделяемому из кислого

раствора. Свободная энергия гидролиза этого промежуточного

соединения удивительно мала, и по величине соответствующей ей

константы равновесия он в IO

раз устойчивее обычных фосфор-

ных эфиров [62—64]. Причина того, что фосфатаза не оказыва-

ется в термодинамической ловушке, заключается в образовании

нековалентного комплекса фермент — фосфат, который при рН 8

в 100 раз устойчивее фосфорилфермента [62]. В результате этого

равновесие

E-PO

•<—>- E-PO

(8)

в щелочной среде сильно смещено вправо и свободный субстрат

может вытеснить нековалентно связанный фосфат и регенериро-

вать катализатор. Как и следовало ожидать, сам фосфат сильно

ингибирует фосфатазную реакцию.

В кислых растворах, напротив, равновесие (8) смещено влево

и фермент неактивен [63, 64]. Однако положение этого равновесия

не является определяющим фактором, так как рК

группы, кото-

рая контролирует инактивацию фермента, близок к 7 как для

+-, так и для Со

+-фосфатаз [53, 54]. При рН7 основная часть

фосфата связана нековалентно [63]. Предполагается, что для ак-

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

639;

тивации фермента необходимо депротонирование остатка гисти-

дина [53]. Фосфорилирование Zn

+- и Со

+-ферментов протекает

очень быстро, причем Со

+-форма реагирует с фосфатом быстрее.

Стадия дефосфорилирования лимитирует скорость гидролиза

Со

+-фосфатазой [53]. С гп

+-ферментом отщепление фосфата

протекает значительно быстрее, и в щелочной среде эта стадия,

по-видимому, не определяет скорости гидролиза [66, 67]. Сущест-

вует предположение, что скорость ферментативной реакции ли-

митируется стадией изменения конформации [68, 69]. Оно под-

тверждается кинетическими данными по связыванию ферментом

обратимого ингибитора [70]. Этот вопрос детально рассмотрен

Рейдом и Вильсоном [28]. Максимальная скорость гидролитиче-

ской реакции не зависит от природы субстрата, несмотря на зна-

чительные различия в эффективности уходящей группы (напри-

мер, в нитрофенил- и динитрофенилфосфатах [52]). При высоких

значениях рН константа Михаэлиса увеличивается, что означает

ослабление связи с субстратом. Величина рKa этого перехода для

+-фocфaтaзы составляет 8,6 [54], а для Со

+-фосфатазы она

несколько больше (8,9 [54] или 9,6 [52] по данным разных ав-

торов). Этот эффект объясняют ионизацией молекулы воды, свя-

занной с ионом металла [52]. Аналогичным образом можно объ-

яснить рН-зависимость константы диссоциации цинка с точкой

перехода при рН 8,5 [46].

Коулмен и сотр. [51] обнаружили, что Cd

+- и Мп

+-фосфата-

зы, у которых каталитическая активность совершенно отсутству-

ет, очень прочно присоединяют фосфат с образованием значитель-

ного количества фосфорилфермента. В то время как для Zn

фосфатазы степень образования ковалентного соединения с фос-

фатом максимальна при рН 5 и очень мала при рН выше 6, для

+- и Мп

+-фосфатаз оптимальное значение рН этой реакции

равно 7. В случае Cd

^epMeHTa при этом значении рН большая

часть присоединенного фосфата связана ковалентно. Следователь-

но, Cd

+- и Мп

+-производные так же эффективны на стадии фос-

форилирования белка, как и фермент, содержащий цинк. Причи-

на отсутствия у них ферментативной активности заключается,

вероятно, в неспособности к дефосфорилированию в щелочной

среде. Степень ковалентного присоединения фосфата к Со

+-фос-

фатазе, как сообщается в этой работе, очень мала при всех значе-

ниях рН и достигает максимума (всего 0,2 моля на 1 моль фер-

мента) при рН 6 [51].

Последний результат противоречит сообщению Лаздунски и

др. [71] о том, что при 0°С (группа Коулмена проводила иссле-

дования при 4 °С) можно выделить до 1 моля ковалентно при-

соединенного фосфата на 1 моль Со

+-фосфатазы после ее инку-

бации с фосфатом в кислой среде. В щелочных растворах кова-

лентное соединение не было обнаружено, причем рН точки пере-

'<640

Глава 17

хода было равно 5,6. Для 2п

+-фермента эта величина была почти

такой же (5,1), но максимальная величина включения в кислом

растворе была равна двум молям на 1 моль белка. Более того,

максимальная величина ковалентного присоединения фосфата при

инкубации с субстратами (АМФ и АТФ) в кислом растворе при

0°С и для Zn

+-, и для Со

+-фосфатаз составляла 2 моля/моль,

а минимальная величина включения в щелочной среде была равна

одному молю/моль. Однако величины рН перехода были для них

различными: 6,6 для цинкпроизводного и 4,6 для кобальтпроиз-

ВОДНОГО.

3.3. Присоединение фосфата

Интересные результаты, полученные при определении числа

фосфатсвязывающих центров, привлекли в последнее время зна-

чительное внимание. Несмотря на димерную природу фермента,

кинетические данные указывают на существование одного актив-

ного центра [62—64]. Экспериментальное подтверждение этого

было получено методом остановленной струи [66, 68, 72], при

помощи которого было обнаружено, что величина предстационар-

ного выброса продукта равна примерно 1 молю на моль фермен-

та. Однако при высокой концентрации субстрата (2-Ю

-3

М) этот

метод дал величину 2,7 [73]. Включение фосфата в большинстве

работ, за исключением вышеупомянутой работы Лаздунски и др.

[71], составляло 0,6—1,3 моля/моль [64, 74, 75]. Нейман [35]

обнаружил связывание 1 моля ингибитора. 0-я-нитрофенилтио-

фосфата, на 1 моль белка.

В экспериментах по изучению равновесного связывания обна-

ружено присоединение одного или двух ионов фосфата на моле-

кулу. По последним данным, один ион фосфата связывается

прочно и один или несколько слабо [51, 68, 69, 76, 77]. Кроме

того, Симпсон и Вейлли [76] получили кинетическое подтвержде-

ние подобной антикооперативности, обнаружив в соответствующих

условиях активацию субстратом, выражающуюся в двухфазном

характере зависимости активности от концентрации субстрата.

Отрицательная кооперативность подробно обсуждена для другой

системы Левицки и Кошландом [77]. Симпсон и Вейлли предпо-

лагают, что функциональная роль антикооперативности заключа-

ется в сохранении определенного уровня активности фермента в

широком диапазоне концентрации субстрата. Их вывод о суще-

ствовании в фосфатазе аллостерических взаимодействий отчасти

подтверждается изменением конформации фермента при связыва-

нии ингибитора [70] [ом. «Дополнения, внесенные в корректуру»,

пункт 1].

Присоединение фосфата к Со

+-фосфатазе вызывает значи-

тельное изменение спектра белка в видимой области [48, 55].

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

641

)казывается, что две высокоэнергетические полосы — при 510 и

>55 нм — сдвигаются соответственно к 475 и 550 нм, интенсив-

ность низкоэнергетической полосы при 640 нм сильно уменьша-

йся, а плечо при 610 нм исчезает совсем. Аналогичные измене-

ния происходят при связывании арсената [51]. Оба аниона силь-

но влияют на спектр кругового дихроизма, однако если фосфат

уменьшает [48, 55], то арсенат увеличивает эллиптичность основ-

ной полосы при 550 нм [51]. Следовательно, хотя фосфат и арсе-

нат вызывают примерно одинаковые изменения энергетических

/ровней d-электронов кобальта(II) в Со

+-фосфатазе, их влияние

гна диссимметрию координационной сферы металла оказывается

торазительно различным. Существует противоречие в вопросе о

том, сколько ионов фосфата, один [55] или два [48], должны

присоединиться к молекуле фермента для достижения макси-

мального спектрального эффекта. Связывание фосфата Си

-фос-

фатазой вызывает значительное изменение спектра ЭПР иона

меди [50, 128].

3.4. Модели активного центра

Как следует из изложенного выше, в описании щелочной фос-

фатазы и ее действия остаются неясными некоторые ключевые

моменты, которые подчас трактуются взаимоисключающими спо-

собами. Не приходится сомневаться в том, что дальнейшие иссле-

дования, в том числе рентгеноструктурный анализ кристаллов

фермента, прояснят положение. Однако сейчас остается только

гадать о деталях процессов, происходящих в активном центре.

По-видимому, можно без опасений считать, что молекула суб-

страта в активном центре прямо взаимодействует с ионом цинка.

Ярко выраженная зависимость ферментативной реакции от приро-

ды металла, чувствительность электронного спектра и спектра

кругового дихроизма Со

+-фосфатазы и спектра ЭПР Си

+-фос-

фатазы к фосфату и арсенату — все эти факты делают маловеро-

ятным косвенное участие ионов цинка в катализе. Кроме того,

прямое присоединение субстрата к иону цинка было уже надеж-

но установлено кристаллографически [78] для другого фермен-

та—карбоксипептидазы (гл. 15).

Электронный спектр Со

-фосфатазы обнаруживает некоторую

асимметрию в координационном окружении иона кобальта. При-

соединение фосфата или арсената сильно влияет на спектр, одна-

ко форма полос и их расщепление остаются почти неизменными.

Из этого можно заключить, что в целом координационная гео-

метрия сохраняется и что фосфат или арсенат просто замещают

лиганд атома металла. Самым удобным для замещения лигандом

могла бы быть вода. Это предположение также напрашивается из

данных по кристаллической структуре карбоксипептидазы,

42—2451

'<642

Глава 17

согласно которым вода служит четвертым лигандом цинка в силь-

но искаженной координационной сфере. С этой гипотезой согла-

суется также предположение Готтесмана и сотр. [52] о том, чтс

увеличение константы Михаэлиса для Zn

+- и Со

-фосфатаз

связано с ионизацией молекулы воды, служащей лигандом ме-

талла. Вытеснение субстратом воды из комплекса с металлом

должно происходить легче, чем вытеснение иона гидроксила.

Прочность связи фосфата с металлоферментом удивительно

велика. Константа устойчивости комплекса, равная около IO

-1

[51, 63, 76], выше, чем можно было бы ожидать для взаимодей-

ствия HPO ? и иона двухвалентного металла. Так, константа

устойчивости комплекса типа M(HPO

) равна 370 M

-1

для Mn

и 77 M

-1

для Mg

+ [7]. Вероятно, вблизи иона цинка находится

еще один катионный центр связывания, например протон амино-

группы боковой цепи аминокислоты, взаимодействующий с кис-

лородными атомами фосфата. Образование фосфорилфермента

при реакции с субстратом и HPO

можно считать твердо уста-

новленным. После разрушения белка фосфат оказывается присое-

диненным к серину. Отсюда делается вывод о том, что в актив-

ном центре вблизи иона цинка находится остаток серина, ориен-

тация которого делает возможной его атаку по фосфорильному

атому присоединенного производного фосфата. Высокая термоди-

намическая устойчивость получающегося фосфорилфермента при

гидролизе предполагает сохранение в нем значительной части

взаимодействий комплекса фермент — фосфат [62]. Вполне ве-

роятно, что фосфорильная группа, присоединенная к серину, со-

храняет связь с ионом цинка.

Бреслоу и Кац [36] пришли к интересному выводу о механиз-

ме действия из сравнения относительных скоростей гидролиза

О-алкилфосфатов и тиофосфатов. При ферментативном гидролизе

моноэфиры тиофосфата реагируют быстрее эфиров фосфата, тогда

как при неферментативном гидролизе наблюдается обратная за-

кономерность. С другой стороны, при неферментативном гидро-

лизе триэфиров производные тиофосфата реагируют медленнее.

Считают, что триэфиры гидролизуются по «ассоциативному меха-

низму», который предусматривает уменьшение кратности связи

P=O (или P = S) и увеличение заряда атома кислорода (серы)

в переходном состоянии, тогда как гидролиз моноэфиров проте-

кает по механизму элиминирования с образованием метафосфата,

при котором кратность связи P = O (или P = S) увеличивается,

а заряд атома кислорода в переходном состоянии уменьшается

(разд. 2.1). Соотношение скоростей неферментативных реакций

можно объяснить меньшей электроотрицательностью серы по

сравнению с кислородом. Следовательно, изменение соотношения

скоростей распада моноэфиров в ферментативной реакции пред-

полагает переход от одного механизма к другому. Эта гипотеза