Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

643

согласуется с существованием сильных взаимодействий с кис-

лородными атомами фосфата в активном центре.

После фосфорилирования фермента происходит нуклеофильная

атака на образовавшееся промежуточное соединение. Нуклео-

филом может быть не только вода. Вильсон и др. [37] показали,

что ряд акцепторов фосфата, таких, как этаноламин и этилен-

гликоль, эффективно конкурирует с водой, даже если их кон-

центрация 1 M или меньше. Молекулы этих акцепторов содержат

Рис. 17.1. Модель активного центра щелочной фосфатазы.

а — фосфорилирование фермента; б —перенос фосфата на воду и другие нуклеэфилы.

ОН- или NH

-rpynny, находящуюся на расстоянии, не превышаю-

щем длины цепи из четырех углеродных атомов от акцептирую-

щей гидроксильной группы. Это структурное требование указы-

вает на существование у фермента центра связывания, несущего

положительный заряд и способствующего реакции с нуклеофилом.

Молекулы акцепторов, которые не удовлетворяют этому требова-

нию, оказываются неэффективными в экспериментах по переносу

[37], однако нет оснований полагать, что при достаточно высо-

кой концентрации они не смогли бы конкурировать с водой.

По-видимому, фермент не имеет специального центра для связы-

вания воды. Эти выводы из экспериментальных данных иллюст-

рируются схемой на рис. 17.1. Об участии металлов в придании

активному центру фермента стерической селективности свиде-

тельствует тот факт, что Cd

+ и Mn

+ облегчают фосфорилиро-

вание белка, но не последующий гидролиз промежуточного сое-

динения, тогда как Со

+, активность с которым составляет 12%

активности с Zn

E+

, делает трансферазные реакции невозможными.

Обсуждение механизма действия фосфатазы до сих пор не

касалось осложнения, связанного с существованием лишь одного

центра прочного присоединения фосфата при участии в катализе

двух ионов металла. Согласно аллостерической модели [76, 77],

связывание одной молекулы фосфата затрудняет связывание дру-

гой из-за возникающих дальнодействующих взаимодействий меж-

ду субъединицами. Альтернативный механизм [51] объясняет это

41*

'<644

Глава 17

тем, что основное место присоединения фосфата находится в

области контакта двух субъединиц. Предварительные данные

рентгенографического анализа [27, 28] свидетельствуют о том,

что кристаллы нативного фермента принадлежат к моноклинной

пространственной группе P3i21 с размерами ячейки а = 70,5 А,

6 =70,5 А, с= 155,6 А, |3= 120°. Элементарная ячейка содержит

три димерные молекулы, однако асимметрической единицей явля-

ется молекула мономера. Пары идентичных мономеров связаны

посредством оси вращения второго порядка. Если эти пары пред-

ставляют собой функциональные молекулы димеров, то единст-

венный центр связывания фосфата может находиться на оси сим-

метрии второго порядка. В результате появляется интересная

возможность того, что фосфат одновременно взаимодействует с

двумя ионами цинка и что эта неизвестная ранее структурная

особенность объясняет активацию производных фосфата при ну-

клеофильной атаке.

4. РОЛЬ ИОНОВ МЕТАЛЛА

Ввиду большого разнообразия ферментов, переносящих фос-

фат при участии ионов металлов, следует учитывать возможность

такого же разнообразия функций металла. Действительно, если

обратиться к сравнению эффективности различных металлов,

природы ингибиторов и концентрационных зависимостей актива-

ции и ингибирования, то можно увидеть, что специфические тре-

бования к металлам для различных ферментов неодинаковы.

Вполне возможно, что для каждого фермента характерен свой

механизм участия ионов металла в реакции. Тем не менее можно

попытаться найти некоторую объединяющую основу, базирую-

щуюся на фундаментальных законах химии.

4.1. Тройные комплексы ферментов с металлами

и субстратами

Активация фермента ионами металлов предполагает образова-

ние тройного комплекса фермент —ион металла — субстрат.

Можно представить несколько вариантов организации этого

комплекса, и все они встречаются в реальных системах. Схемы

координации, в которых связывающим мостиком служат лиганд

(Е—S—М), металл (Е—М—S) или фермент (S—Е—М), рас-

смотрены в гл. 14 и в исчерпывающем обзоре Милдвана [79].

4.2. Нейтрализация заряда

Наиболее очевидным свойством ионов металлов, которое

могло бы помочь в объяснении их роли при активации фосфат-

переносящих ферментов, является положительный заряд. Катио-

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

645

ны двухвалентных металлов сохраняют свой заряд в нейтральном

растворе и могут снимать отрицательный заряд кислородных

атомов фосфата, облегчая тем самым присоединение субстрата

к ферменту. Хорошо известно, что двухзарядные катионы обра-

зуют с производными фосфата сравнительно прочные комплексы

(хотя этот эффект часто не виден из-за образования осадка), осо-

бенно если они содержат ди- и трифосфатные группировки

[7, 87]. Кроме того, эти катионы сильно стабилизируют третич-

Рис. 17.2. Предполагаемый механизм реакции Zn

-IlKA4- ImPO

—*• Zn

(ПКА)Р0

+1т.

ную структуру транспортной РНК [88], вероятно, вследствии

взаимодействия с рибозофосфатным скелетом.

Модельная система, в которой нейтрализация заряда, по-види-

мому, играет важную роль, обнаружена Куперманом и Ллойдом

[89]. Они нашли, что Zn

+ катализирует перенос фосфорильной

группы от фосфорилимидазола к кислородному атому 2-пиридин-

карбальдоксима (ПКА), о комплексе которого с Zri

+ было из-

вестно, что он является эффективным нуклеофилом [90]. Реакция

описывается кинетикой с насыщением, что свидетельствует об

образовании тройного комплекса ПКА — Zn — фосфорилимида-

зол. Кривая рН-зависимости скорости реакции имеет колоколооб-

разную форму с максимумом при рН 6. В этих условиях комп-

лекс Zn

+ — КПА и фосфорилимидазол ионизованы. Полагают, что

роль иона цинка заключается в экранировании фосфатной группы,

в результате чего облегчается атака отрицательно заряженным

нуклеофилом (рис. 17.2). Величина эффекта очень большая, и в

оптимуме рН скорость этой реакции примерно в IO

раз превы-

шает скорость атаки фосфорилимидазола водой.

По похожему механизму, вероятно, протекает неферментатив-

ное фосфорилирование ортофосфата до пирофосфата под дейст-

вием АТФ, которое, как показал Ловенштейн [91], требует обяза-

тельного присутствия ионов двухвалентных металлов, предпочти-

тельнее всего Mn'

+, Cd

+ и Ca

+. В этом случае не наблюдается

эффекта насыщения при высокой концентрации реагентов, однако,

имея в виду низкую концентрацию фосфата в эксперименте,

можно заключить, что реакция в этих условиях протекает значи-

тельно быстрее гидролиза АТФ [92]. Необычные характеристики

этого процесса, а именно рН-оптимум 9, оптимальное соотношение

42—2451

'<646

Глава 17

концентраций АТФ и M'

+ около 0,6, показывают, что ее меха-

низм непрост.

Хотя в участии металлов в нейтрализации зарядов при фер-

ментативных реакциях переноса фосфата не приходится сомне-

ваться, можно отметить, что эта функция не обязательно выпол-

няется металлом. Белки содержат и другие заряженные центры,

не содержащие металл, — аминные и имидазольные группы, ко-

торые с успехом могут участвовать в связывании отрицательно

заряженных фосфатных групп. Многие ферменты, в том числе

некоторые из переносящих фосфат, работают в отсутствие метал-

лов, хотя их субстраты заряжены отрицательно.

4.3. Поляризация

Можно ожидать, что, кроме нейтрализации заряда, ион ме-

талла, присоединенный производным фосфата через атом кисло-

рода, вызывает поляризацию соответствующих связей P—О. Рань-

ше при обсуждении роли металла в переносе фосфата функция

поляризации рассматривалась чаще всего. Ее идея заключается

в том, что, оттягивая электроны от атома кислорода, ион металла

ослабляет связь P—О и увеличивает положительный заряд на

атоме фосфора. Это должно облегчать и нуклеофильную атаку,

и разрыв связи Р—О. Иллюстрацией служит рис. 17.3 (см. также

т. 2, гл. 34).

Если бы поляризация играла важную роль в активации фос-

фата, то можно было бы ожидать, что ионы металлов сами по

себе ускоряют гидролиз производных фосфата, поскольку ком-

плексы с металлами образуются и в отсутствие ферментов. Одна-

ко это предположение не подтверждается. Хотя каталити-

ческая роль металлов в модельных системах и обнару-

живается [93]. эффекты вовсе не велики, если реагент не

имеет необычных структурных особенностей. Например, ионы

магния ускоряют гидролиз дианиона ацетилфосфата СН

СООРОГ

[94], однако всего ib 3 раза при концентрации металла 0,1 М.

Если предположить, что константа диссоциации комплекса

Mg(CH

COOPO

) не больше, чем комплекса Mg(HPO

) [7] (она

может быть меньше ввиду возможного участия кислородного

атома карбонильной группы в связывании), то оказывается, что

COOPO

гидролизуется в комплексе с Mg

+ всего в 4—5 раз

быстрее, чем в свободном виде.

Влияние Mg

+ на гидролиз АТФ еще меньше [92], несмотря

на то что этот металл служит активатором большинства киназ.

При рН 9, т. е. когда молекула АТФ депротонирована, магний

ускоряет гидролиз в 2 раза, тогда как при рН 5, когда молекула

свободного АТФ присоединяет один протон, магний даже несколь-

ко ингибирует гидролиз. В случае Ca

+ и Mn

+ ускорение не-

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

647;

сколько больше и составляет 2—10. Существенное увеличение

скорости (iB 60 раз) дает только Cu

+, однако реакция с этим

катионом протекает исключительно через димерный хелат

[(ATOCUOH)

]

, В котором ионы меди, вероятно, соединены

двумя гидроксильными ионами [95]. Неясно, почему этот необыч-

ный комплекс оказывается таким эффективным при гидролизе

АТФ. Скорее всего, дело здесь не в простой поляризации.

Ускорение гидролиза салицилфосфата ионами Cu

+, Fe

+ и VO

также объясняется структурной особенностью суб-

ПП:

+ :Q—Р—О

У QR!

2+ _ <5+ /

M -а— Q-P=O

ORI -Q-

М— о,—UJIU

" H^oC \

RIO^ M-O

- MOH

4- O = P-Y

"ЛИ O=P-V- + RON

/ /

РИС. 17.3. Схема активации посредством поляризации.

страта, заключающейся в присутствии рядом карбоксильной

группы [96]. Эфиры фосфорной кислоты быстро гидролизуются

гидроокисями La(III), Ce(III), Ce(IV), Th(IV) и Pb(II) [97, 98].

В присутствии гидроксигеля La(III) при рН 8,5, 78

C скорость

распада оксиэтилфосфата увеличивается в 1000 раз [99]. Следует

отметить, что детали этих гетерогенных реакций практически не-

известны.

Можно предположить, что хотя в водных растворах бинарных

комплексов выраженный эффект поляризации отсутствует, он

может существовать в тройных ферментных комплексах. Эффек-

тивная диэлектрическая проницаемость в активном центре, веро-

ятно, значительно больше. С другой стороны, есть основания счи-

тать, что отсутствие активации фосфата в простых комплексах

объясняется не отсутствием поляризационного влияния на связь

P—О. Скорее всего, поляризация компенсируется оттягиванием

648

Г лава 17

атомом фосфора заряда от остальной части молекулы. Это свой-

ство атома фосфора строго вытекает из анализа колебательных

спектров производных фосфата и их комплексов с металлами,

проведенного Бринцингером и Хестором [100]. Оказывается, что

силовая константа для растяжения связи P—О уменьшается

только для атомов кислорода, связанных с ионом металла, а для

свободных атомов кислорода она увеличивается, в результате

чего средняя силовая константа связи P-O остается неизменной.

Похожим образом ведут себя другие оксианионы: сульфат, карбо-

нат и нитрат. Предполагается, что поляризация компенсируется

1,517

O-"H-O

-L®60_pL65LO

1,497

Рис. 17.4. Структура серилфосфата [19].

значительным образованием я-связей между атомами кислорода

и центральным атомом с использованием вакантных 2р-орбита-

лей атомов углерода и азота и Зй-орбиталей атомов фосфора и

серы. Электроны легко передаются от одного атома кислорода к

другому без большого изменения заряда центрального атома.

Структурные данные подтверждают такую точку зрения. Kpy-

икшанк [101] обнаружил, что средняя длина связи P—О в произ-

водных фосфата почти постоянна. Присоединение заместителя к

одному из кислородных атомов ортофосфата может существенно,

на 0,15 А, увеличить длину связи P—О, однако остальные связи

P—О укорачиваются таким образом, что средняя длина сохраня-

ется равной 1,54 А. Структура серилфосфата [102], показанная

на рис. 17.4, иллюстрирует этот эффект. Видно также, что влия-

ние протона на длину связи P—О вдвое меньше влияния остатка

аминокислоты. Эта закономерность является общей и, вероятно,

объясняется образованием в кристалле прочных межмолекуляр-

ных водородных связей [101]. Можно полагать, что она справед-

лива и в водных растворах, и на протонных центрах белков.

В солях, образуемых металлами с фосфатом и пирофосфатом

[105], значительное удлинение связей P—О под действием ме

таллов не происходит, однако все исследованные кристаллы этих

соединений представляют собой трехмерные ионные решетки, Е

,которых все кислородные атомы присоединены к ионам металла

и наоборот, в результате чего поляризационный эффект уничто-

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов

649;

жается. По-видимому, до сих пор неизвестна структура ни одного

отдельного комплекса металл — фосфат.

Хотя образование комплекса с ионом металла обычно не уско-

ряет значительно гидролиз простых производных фосфата, с поли-

рибонуклеотидами дело обстоит иначе. В этих полимерах фосфо-

диэфирные связи быстро гидролизуются в присутствии некоторых

металлов, особенно Zn

+, с образованием монорибонуклеотидов,

которые не распадаются дальше до фосфата [106]. Атом фос-

фора фосфодиэфирной группы уже поляризован под действием

двух эфирных связей, и это может служить объяснением того, что

дополнительная поляризация при связывании иона металла не

может быть компенсирована оттягиванием электронов от кисло-

родных атомов (гл. 34).

Усиление нуклеофильных свойств воды представляется более

вероятной функцией ионов металлов по сравнению с активацией

фосфата посредством поляризации. У кислородного атома воды

нет богатых электронами заместителей, которые могли бы ком-

пенсировать поляризующее влияние металла, поэтому прочность

связей О—H координированной молекулы воды существенно

Рис. 17.5. Предполагаемый механизм гидролиза зарина (Р1=изопропил, R

=Me-

тил), ускоряемого [(AA)CuOH]+ (AA=хелатирующий диамин).

уменьшается и оказывается возможной ионизация молекулы.

Таким образом, ион металла способен образовать гидроксильный

ион или близкое к нему состояние при физиологических значе-

ниях рН. Хотя нуклеофильные свойства связанного иона гидро-

ксила, скорее всего, хуже, чем в свободном состоянии, они тем

не менее могут быть лучше, чем у воды. Более того, активность

связанного иона OH

может существенно увеличиваться благода-

ря его благоприятной для реакции ориентации. Этот эффект объ-

ясняет способность комплекса [Cu(AA)OH]+ (АА=хелатирую-

щий диамин) ускорять гидролиз метилизопропилфторфосфата

(зарина) [108]. Вероятно, ион меди взаимодействует с атомом

фгора во время атаки иона гидроксила на атом фосфора

(рис. 17.5). В некоторых хелатах связанный ион OH

активнее

свободного [108]. Быстрый гидролиз производных фосфата гид-

роксидами лантанидов также, вне всякого сомнения, объясняется

4.4. Активация воды

'<650

Глава 17

участием связанного гидроксильного иона. Об эффективности

этого катализа известно давно, однако образование осадков за-

трудняет изучение его механизма [109—111]. Судя по данным

Селвина [112], в случае АТФ гидролизуется растворимый комп-

N^ I .NH

-CH:

t/K

+ -он Zir

N^ NH

I быстра

Ns. I .NH

;со"н сн

+ н

, быстро

"NH

V=O

N^ j .NH

N^ J NHfC

нз

N. .NH

Ss^VV ^

N«3 OC

медленно ^ft

.. HOC

f "ОН

N NH-C

' 0

Рис. 17.6. Предполагаемый механизм образования хелатированного имида гли-

цина из этилового эфира глицина, связанного с пентааминокобальтом (III) [113].

леке АТФ(М

)

и рН-зависимость скорости реакции согласуется

с участием координированного иона гидроксила.

Пока нет прямых данных в пользу того, что определенная мо-

лекула воды или гидроксил-ион, связанные с катионом металла,

оказываются в конце концов присоединенными к атому фосфора.

Однако Бакингем и сотр. [113] показали прямым методом нали-

Фосфатный перенос и его активация ионами металлов 651;

чие нукле-офильных свойств у координированной молекулы ам-

миака. Если этилглицинат присоединен своим аминным концом к

комплексу [Со(NH

)S]

+, то продуктом его гидролиза в NaOH

оказывается хелатированный имид NH2CH2CH2CO1NH. Очевидно,

что для этого необходима атака одной из координированных мо-

лекул аммиака по карбонильному атому углерода. Предполагае-

мый механизм изображен на рис. 17.6. Трудно сомневаться в том,

что молекула воды может выполнять в гидролитических реакциях

похожую роль.

В ферментативных реакциях самые убедительные доказатель-

ства участия механизма с координированным ионом гидроксила

получены для карбоангидразы. По данным инфракрасной: спек-

троскопии, молекула субстрата (CO

) не связана с атомом цин-

ка, но расположена сравнительно близко от него, чтобы быть

атакованной координированным гидроксильным ионом [82]

(гл. 16, разд. 7). С этим механизмом согласуется зависимость

активности от рН и природы разнообразных ингибиторов [114,

115]. Селвин [112] предложил похожий механизм для АТФ-азы

митохондрий, участвующей в окислительном фосфорилировании.

Он основывался на сходстве рН-зависимостей ферментативной

реакции и упомянутого выше ускорения гидролиза АТФ ионами

лантанидов. Однако величина р/С

для АТФ-азной реакции (при-

мерно 7) была намного выше р/С

воды в комплексе с активирую-

щими двухзарядными ионами. Для наилучших активаторов

+, Со

+ и Zn

+ эта величина примерно равна соответственно

—-12, ~9 и ~9 [87]. Селвин [112] предполагает, что кислот-

ность комплексов может увеличиваться под влиянием положи-

тельно заряженных групп фермента, расположенных поблизости.

Надо признать, что расхождение в 5 единиц рН для Mg

+ слиш-

ком велико, чтобы его можно было объяснить таким образом

(необходимая для этого энергия электростатического взаимодей-

ствия должна составлять примерно 7 ккал/моль). Выше говори-

лось о том, что ионизация свободной молекулы воды предложена

в качестве объяснения перехода при рН 8,5, наблюдаемого для

+-coдepжaщeй щелочной фосфатазы. При этом увеличение рН

приводило к уменьшению активности фермента. В силу этого

можно считать, что механизм с координированным гидроксиль-

ным ионом вряд ли играет существенную роль при ферментатив-

ном гидролизе фосфатов.

4.5. Стереохимические модели

Тот факт, что в бинарных комплексах с производными фосфа-

та ионы металлов лишь незначительно ускоряют гидролиз, пред-

полагает качественное различие во взаимном расположении ионов

металла и активируемой фосфатной группы в бинарном комплек-

'<652

Глава 17

се и в тройном комплексе с участием фермента, переносящего

фосфат. Возможно, что ион металла играет лишь косвенную роль,

создавая надлежащую ориентацию фермента и субстрата. С дру-

гой стороны, может быть, что присоединение бинарного комплек-

са к ферменту сопровождается такими стереохимическими изме-

нениями, которые оказываются благоприятными для реакции. Эту

дилемму можно разрешить, изучая модельные системы фермент—

H +

ГЛ

Np/

^OCH

X N

ГЛ

Xp/

Рис. 17.7. Предполагаемый механизм псевдовращения, объясняющий быстрый

гидролиз этилепметилфосфата с образованием этиленфосфата и метанола Г16].

свободный металл — фосфат, выбранные с таким расчетом, чтобы

проверить конкретные стереохимические гипотезы.

Интересная гипотеза была недавно выдвинута Куперманом

[116], однако она, по-видимому, опровергается его же экспери-

ментальными данными. Исходя из того, что несимметричные ли-

эфиры пирофосфорной кислоты гидролизуются в IO

раз быстрее

соответствующих моноэфиров [117], Куперман предположил, что

металл, присоединяясь к замещенной фосфатной группе моно-

эфира пирофосфата, дает похожий эффект. Обычно ионы метал-

лов образуют с полифосфатами хелатные комплексы, но в ак-

тивном центре фермента металл может вовлекаться в связь толь-

ко со второй от конца фосфатной группой полифосфата, например

АТФ, и активировать таким образом концевую фосфатную груп-

пу. Для того чтобы обеспечить связывание металла только со

второй от конца, но не с концевой фосфатной группой, было

получено несколько замещенных фосфонилфосфатов и фосфонил-

пирофосфатов. В качестве заместителей были использованы хе-

латообразующие полиаминные и фенолдиаминные группы. Кон-

станты скорости гидролиза комплексов с катионами различных

двухвалентных металлов существенно не превышали константы