Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Карбоангидраза

603

позволяет отнести это (взаимодействие к активному центру. Проч-

ность связи Zn-Cl сильно зависит от рН. Она максимальна при

рН 6 и резко падает при рН 9,0. Величина рКа, описывающая

этот процесс, может быть найдена экстраполяцией данных ЯМР,

полученных при нескольких концентрациях хлорида, к нулевой

его концентрации [122, 123]. Эти значения рК

составляют

7,0+0,1 для фермента быка и 8,1 ±0,1 для изофермента В челове-

ка, что соответствует величинам константы ионизации координи-

рованной молекулы воды, найденным при изучении протонного

резонанса Со(II)-фермента [125]. Как отмечалось выше, то же

обнаруживается и при компл ексометр ичеоком титровании [86].

Эти результаты свидетельствуют о конкуренции между Cl

ОН~ за место в координационной сфере металла при высоких

значениях рН. Еще раньше Линдског [101] в своих исследованиях

различного влияния анионов на спектры Со(II)-карбоангидразы

при различных рН объяснил такие же соотношения (см. выше).

Как и в случае протонного резонанса, при рН<6 наблюдается

значительное уменьшение уширения линии

Cl, по-видимому,

вследствие каких-то структурных изменений в белке.

Введение парамагнитных групп в белок посредством привязы-

вания к нему стабильных свободных радикалов является ценным

методом спектроскопического исследования [126, 127]. Получае-

мые от введенного !свободного радикала сигналы ЭПР можно ис-

пользовать для контроля за изменениями в белке. При этом

можно сделать определенные выводы и об окружении свободного

радикала. Первые примеры применения этой техники представили

МакКоннел с сотр. [128—130]. Удобнее всего оказался стабиль-

ный свободный радикал имнноксильной группы (нитрокснд)

[131, 132], поскольку сам он мало реакционноспособен, но может

а — без фермента, Av ,-.j.-=12,5 Гц; б — 3,5-10-

апокарбоангидразы в 0,01 M ацетатном буфере

(рН 4,8), Av-Av

,-=7,0 Гц; в —4,МО-

M карбоан-

гидразы в 0,01 M трис-буфере (рН 8,2), Av-Avq- =

=49,4 Гц [122].

Рис. 16.17. Спектр ЯМР

Cl в 0,5 M растворе

NaCl.

5.1. Карбоангидраза со спиновыми метками

604

Г лава

быть привязан к различным соединениям, содержащим опреде-

ленные активные группы. Последние могут !Присоединяться к ак-

тивному центру или к специфическим аминокислотным остаткам

белка [127—130].

Рис. 16.18. Спектр ЭПР соединения

VIiI (А) и растворе (!магнитное поля

3401 Гс, аплитуда модуляции 0,5 Гс)

и его эквивалентных комплексов с

различными изоферментами карбо-

ангидраз (Б, В и Г) (магнитное поле

3401 lie, амплитуда модуляции 6,3

Гс) [ 133 J (Б — Zn(II)-Kap6oa«nm-

раза В быка; В — Zn(II)-Kap6oaH-

гидраза В человека; Г — Co(II)-Kap-

боангидраза В человека).

При исследовании иминоксильного радикала установили, что

свободный электрон в основном локализован на 2ря-ат0М'Н0Й

орбитали азота. Сигнал от свободного радикала вследствие сверх-

тонкого взаимодействия с ядром азота расщепляется на три ли-

нии [126, 127] (рис. 16.18). Это сверхтонкое расщепление зависит

от ориентации иминоксила относительно приложенного поля.

Поэтому три различные линии наблюдаются вдоль трех осей

строго ориентированного монокристалла иминоксила [127].

Однако в разбавленных растворах небольших молекул, содержа-

щих свободный радикал, вращение молекул происходит значи-

тельно быстрее, чем обращение спина. Поэтому различные поло-

жения свободного радикала относительно внешнего поля усред-

няются. С другой стороны, если радикал привязан к макромоле-

Карбоангидраза

605

ле с гораздо меньшей скоростью вращения, так что обращение

ина происходит прежде, чем молекула примет все возможные

иентации, то спектр будет комбинацией спектров для различных

иентаций свободного радикала, например 'комбинацией спект-

•в, отвечающих трем осям монокристалла. Подобная картина

!блюдается при дроблении кристалла, когда ориентация полу-

!емого порошка является комбинацией всех ориентаций кри-

аллов [129]. Поэтому спектры таких заторможенных свободных

щикалов относят к спектрам порошкового типа [127, 128].

Поскольку свободный электрон парамагнитного радикала при-

дан к группе +N—О

, он вообще не взаимодействует с элек-

юнными облаками и ядрами окружения, как это имеет место у

юбодных электронов ионов переходных металлов. Поэтому из-

енения спектров ЭПР говорят главным образом о степени затор-

оженности. Этот метод только начинает -применяться к металло-

ерментам, но некоторые результаты уже получены.

Сульфамиды связываются с активным центром, координируясь

иона металла (разд. 4). Их способность к связыванию мало

ависит от структуры группировок, присоединенных к сульфа-

:иду. Поэтому удается довольно просто ввести в карбоангидразу

миноксильные метки, привязывая их к сульфамиду. Одно из та-

их соединений (VII) синтезировали и использовали Мушак и

^оулмен [133].

VII

Спектр ЭПР этого соединения в растворе показан на

эис. 16.18, А, а спектры его эквимолярных комплексов с различ-

гыми изоферментами карбоангидразы—на рис. 16.18, Б, В и Г.

Связывание со всеми тремя формами фермента затормаживает сво-

Зодный радикал. Заторможенность несколько больше у фермента

быка, что согласуется и с большей прочностью связей сульфамидов.

Сравнение этого спектра с расчетными данными Ицковича [126,

134] для заторможенных свободных радикалов приводит к вели-

чине времени корреляции (т) для связанного с ферментом быка

иминоксила в 2-Ю

-8

—4-Ю

-8

с. Интересно, что для времени вра-

щательной релаксации, рассчитанного для комплекса той же

формы карбоангидразы с флуоресцирующим сульфамидом, Чей и

Кернохан [103] получили значения :2,89-10

-8

с.

Co(II) и Zn(II) вызывают почти одинаковую заторможенность

иминоксильной метки, а так как связывание определяется метал-

лом, то и центры связывания в обеих активных металлокарбоан-

606

Г лава

гидразах должны быть почти одинаковыми. Ни Hg(II)-, i

Cd(II)-производные не затормаживают иминоксильный сульф

мид, что также согласуется с данными об отсутствии связывай

сульфамидов с этими металлоферментами.

Другой характерной особенностью является практически по

ное отсутствие спин-спинового взаимодействия между парамг

нитным Co(II) и иминоксилом. Это, видимо, не является неож

данным, так как в соответствии с представлениями о спосо

связывания сульфамидов свободный радикал должен находить

от Co(II) на расстоянии 15—20 А.

5.2. Магнитная восприимчивость

Линдоког и Эренберг [1135] детально исследовали магнитну

восприимчивость Со(II)-карбоангидразы В человека и некоторь

ее комплексов с ингибиторами. Все комплексы фермента соде

жат высокоспиновый Co(II) с магнитными моментами от 4,2 ;

4.7 магнетонов Бора. Поскольку чисто спиновый момент предп

лагается равным 3,9 магнетона Бора, все комплексы показывак

ожидаемое увеличение магнитного момента вследствие спин-орб]

тальных связываний [92]. Согласно многочисленным данным

магнитной восприимчивости высокоспиновых комплексов Со (II

при октаэдрической координации магнитные моменты еоставляк

4,7—5,2 магнетона Бора, а при тетраэдрической — 4,1 — 4,9 мао

нетона Бора. Все описанные квадратно-плоскостные комплекс:

Co(II) являются низкоспиновыми и имеют магнитные моменты о

1.8 до 2,0 магнетона Бора. Последнее, вероятно, не слишко:

удивительно, так как низкоспиновая конфигурация d

-иона може

стабилизироваться благодаря эффекту Яна — Теллера [92]. Bc

личина магнитной восприимчивости Со (II)-карбоангидразы соглг

суется с несколькими вариантами тетраэдрической геометрт

К сожалению, интерпретация тонких различий восприимчивост

невозможна. Независимо от силы поля лигандов тетраэдрически

комплексы Co(II) являются высокоспиновыми вследствие распре

деления орбитальных энергетичеоких уровней. Со(П)-карбоанги

драза остается высокоспиновой и при относительно высоком пол

лигандов, особенно в сульфамидном комплексе, который ;

тому же имеет наибольшую восприимчивость.

6. РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ КАРБОАНГИДРАЗЫ С

ЧЕЛОВЕКА

Рентгеноструктурные исследования кристаллических препара

тов карбоангидразы С человека Страндберг с сотр. [22, 23, 44

45, 85] довели до степени разрешения 2 А. Наряду с более ран

Рис. 16.19. Модель карбоангидразы человека (Л) и ее комплекса с ацетоксимер-

курсульфаниламидом (Б), выполненная по картам электронной плотности с раз-

решением 5,5 А [22].

Карбоангидраза

609

^полоВть

юпивного,

центра

доступ н активному

,центра

активный

гз

- ... „

центр \ меченый HIS ?

Рис. 16.20. Схемы электронной плотности с разрешением 2А в области атома

Zn(II)-карбоангидразы С человека [23].

Л —в плоскости атома цинка; Б—в плоскости, расположенной над атомом цинка [23]:

В — карта электронной плотности активного центра, предварительная расшифровка. Цинк

координирован с тремя остатками гистидина — с двумя остатками посредством Ns к с одним

при помощи N,. Молекула воды занимает четвертое координационное место. Четвертый

гистидин располагается при входе в полость активного центра и может быть тем остатком,

который, как сообщалось, модифицировался бромпируватом в изоферменте С [23]. Элек-

тронные плотности между этим гистидином и ионом цинка обусловлены растворителем,

вероятно молекулами воды».

ними результатами, полученными при разрешении 5 А, эти дан-

ные позволяют теперь подойти к более обоснованному обсужде-

нию механизма действия с точки зрения структурных характери-

стик фермента. Д-р Б. Страндберг и д-р А. Лильяс любезно

предоставили нам свои данные с разрешением 2 А еще до публи-

кации [23]. S

Общая структура молекулы, видимая при разрешении 5 А,

показана на рис. 16.19, Л [22]. Ион цинка (II) находится в глубо-

кой щели вблизи центра глобулы. N- и С-Концевые области по-

липептидной цепи предварительно отнесены на позиции 1 и

33 соответственно. Такое отнесение азотного конца подтвердилось

при разрешении 2 А [23].

Положение единственной свободной SH-группы определено по

разнице в картах электронной плотности нативного фермента и

фермента, модифицированного ацетоксимеркурсульфаниламидом.

Две молекулы последнего реагируют с карбоангидразой— одна с

39—2451

610

Г лава

активным центром, а другая со свободной сульфгидрильно

группой [22]. Модель этого комплекса показана на рис. 16.19, £

SH-группа удалена от иона Zn(II) на 14 А.

Карта электронной плотности с разрешением 2 А показывает

что центр тяжести сульфамида находится от иона цинка на рас

стоянии 3,2 А. Это в пределах длины связи и согласуется с пред

ставлением о координации сульфамидного атома азота у ион;

цинка (разд. 4).

Атом ртути ацетоксимеркурсульфаниламида находится на зна

чительно большем расстоянии от цинка, т. е. бензольная част]

сульфамида лежит в щели, ведущей к иону цинка [22]. Низкш

константы диссоциации сульфамидных комплексов карбоангидра

зы в растворах (Ю

-5

—Ю

-9

М)

[111

—114] свидетельствуют о том

что кроме координационных имеются и другие типы связей межд}

белком и циклической частью молекулы сульфамида. Изменена

в спектрах поглощения и флуоресценции связанных сульфамидоЕ

свидетельствуют о гидрофобном характере связывающей полости

[30, 103, 105]. Однако основание этой полости, расположенно?

вокруг атома цинка, может быть достаточно гидрофильным.

На рис. 16.20,Л и Б приведены две карты электронной плот-

ности с разрешением 2 А. Одна из них соответствует плоскости,

в которой находится ион цинка, а вторая — плоскости, располо-

женной сразу над ним. Наибольшей плотности на картах отве-

чает ион металла. Вокруг него заметны три координированные

группы белка, электронные плотности которых хорошо совмеща-

ются со структурой остатков гистидина (рис. 16.20,В). Так как

аминокислотная последовательность пока не известна, идентифи-

кация должна считаться лишь предварительной. Интересно, что

два из этих трех лигандов (на рис. 16.20, В они расположены ле-

вее) относятся к одному и тому же участку пептидной цепи и их

разделяет только один остаток.

Кроме описанных трех лигандов на схеме заметно еще одно

скопление над атомом цинка (на рис. 16.20,Л — немного правее).

Оно несколько слабее, чем у белковых групп, и, видимо, отно-

сится к молекуле воды из раствора. По направлению это скопле-

ние соответствует местам связывания сульфамида, которые на

рис. 16.20, Б обозначено символами Аз (сульфамидная группа) и

(Hg в бензольной части). При связывании сульфамида слабое

скопление замещается более плотным. Имеется значительное ко-

личество данных о том, что в растворе фермента это четвертое

место занимают координированные H

O или OH

(см. ниже).

Точная структура вокруг иона Zn(II) не может быть опреде-

лена и с помощью карт при разрешении 2 А. Для этого необхо-

дима еще большая степень разрешения. Строение этой области

белка приближается к тетраэдрической геометрии, хотя спектры

Go (II)-карбоангидразы указывают на значительное искажение.

Карбоангидраза

611

Некоторые общие особенности структуры глобулы карбоан-

гидразы заметны и на этих картах. На пространственной модели

полипептидной цепи, построенной в соответствии с ними [23],

обнаруживаются четыре фрагмента правой опирали, по два витка

в каждом. Только один из этих участков соответствует парамет-

рам a-спирали, остальные значительно искажены и скорее похо-

дят на Зю-спираль [23]. Как отмечалось в разд. 2, спектры ДОВ

и КД различных карбоангидраз также указывают на малую сте-

пень спирализации.

Основной особенностью вторичной структуры белка, как сле-

дует из карт электронной плотности с разрешением 2 А, является

большая область p-конфигурации, занимающей центральную часть

молекулы. По меньшей мере восемь таких фрагментов, направ-

ленных антипараллельно друг к другу, образуют изогнутую

складчатую структуру. Еще три или четыре участка цепи также

расположены параллельно или антипараллельно к этой структу-

ре. В результате в центре глобулы образуется большая гидро-

фобная область. В этом отношении структура карбоангидразы

очень похожа на строение карбоксипептидазы А [136, 137]

(гл. 15). Три гистидиновых лиганда, связанных с ионом Zn(II),—

тоже из этой (З-конфигурации.

7. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

Первоначально считали, что карбоангидраза является высоко-

специфичным ферментом, катализирующим только одну реак-

цию— обратимую гидратацию CO

[уравнение (1)]. В последние

годы были найдены и другие реакции, катализируемые этим фер-

ментом. К ним относятся гидролиз п-нитрофенилацетата [24—27]

он

-C-H

он

(5)

612

Г лава

![уравнение (3)], гидролиз сультона 2-окси-5-нитро-а-толуолсуль-

фокиелоты [28—30] [уравнение (4)] и гидратация ацетальдегида

![31—33] [уравнение (5)], а также некоторых других альдегидов

[138, 139].

Гидролиз сультона катализируется ферментом исключительно

эффективно [28—30]. Число оборотов меняется от 600 до

20 000 молей субстрата/мин на 1 моль фермента в зависимости от

природы изофермента, рН, присутствия или отсутствия ингиби-

рующих анионов и органического растворителя [30, 41]. Такая

большая скорость реакции (4), особенно если сравнить с относи-

тельно медленным гидролизом «-нитрофенилацетата (от 6 до

20 молей/мин на 1 моль фермента), по-видимому, объясняется

специфическим характером взаимодействия с активным центром,

так как структура сультона похожа на структуры сильных суль-

фамидных ингибиторов (разд. 4).

Физиологическое значение реакций (3) — (5) в настоящее вре-

мя неизвестно. Важность же обратимой гидратации CO

оче-

видна. В водных растворах эта реакция протекает относительно

быстро и без помощи ферментативного катализа. Кинетическая

схема этого процесса, предложенная Эйгеном и сотр. [140]

[уравнение (6)], имеет то преимущество, что она учитывает непо-

средственное равновесие CO

с HCO

и HaCO

+ HCO

"13

1*31

» H

O + CO

*32

Кинетические .константы уравнения (1) следующим образом вы-

ражаются через параметры этой схемы:

kl = &31+

32 И 6-1=^13^0+^23 (

)

где K

— истинная константа диссоциации угольной кислоты,

р/(=3,6. Константа первого порядка для скорости гидратации

—d [CO

]

K= ^r

-/[CO

] (8)

определена в некоторых работах. Сообщались значения: 0,03 с

-1

Г141], 0,0358 с-

[142], 0,0375 с

-1

[143] для 25°С и 0,0434 с"

[114] для 37

C. Лучшее значение для константы скорости деги-

дратации k-i, по-видимому, составляет 15 с

-1

[142, 143] при 25

В присутствии фермента гидратация CO

осуществляется в

раз быстрее, чем без катализатора (см. ниже). При рН>1С