Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Карбоангидраза

593

Возможны и другие объяснения этих явлений. Одно из них

редполагает, что анионом замещается какой-то белковый ли-

анд, диссоциации которого отвечает очень большая величина

- Последний затем присоединяет протон. А взаимодействие

амой этой группы с металлом также зависит от рН со значе-

;ием р/С

~8. Однако данная гипотеза не очень убедительна.

Результаты, полученные методом ЯМР, дают все основания при-

[исывать значение рКа~8 координированной молекуле воды

разд. 5).

После того как Манн и Кейлин [21] обнаружили ингибирова-

[ие карбоангидразы сульфамидами, было получено еще много

юдобных соединений. Установлено, что для эффективного инги-

жрования структура их молекул должна удовлетворять двум

)бщим требованиям. Во-первых, необходима незамещенная суль-

фамидная группа (I, А).

Обычно модифицирование этой группы приводит к утрате инги-

эирующей способности. Правда, недавно появились сообщения о

гом, что некоторые модификации хотя и сильно снижают эффект

гнгибирования, но еще оставляют возможности для связывания

4. КОМПЛЕКСЫ КАРБОАНГИДРАЗЫ

С СУЛЬФАМИДАМИ

сульфаниламид (!)

N N

хлортиазидф

ацетазоламид(Ш)

этоксзоламадШ)

и-окси-3 -

нитро^ензолсульфамид (F)

8—2451

594

Г лава 10

с ферментом [67]. Второе требование к структуре молекулы — ш

личие объемистого ароматического или гетероциклического рад!

кала (R), присоединенного к свободной сульфамидной групп

Как видно из приведенных схем (II—V), детали строения этог

радикала могут быть самыми различными. (Подробный списс

этих соединений дан Мареном [109] и Баром [110].) Сульфамид

интересны также тем, что они оказывают фармакологический

терапевтический эффекты на различные обменные реакции орг;

низма, завершающиеся превращением карбонатов [109]. В п<

следнее время выяснилось, что сульфамиды являются очень це]

ными для исследования физико-химии и механизма действия фе]

мента. Ниже эти сведения изложены в специальных разделах.

4.1. Образование комплексов, константы диссоциации

Величины констант диссоциации, рассчитанные по кинетич»

ским данным для некоторых комплексов карбоангидразы с сул:

фамидами, изменяются от 2-10~

для этокезол амида до 2,6-10

для сульфаниламида и представлены в табл. 16.11. Исключ]

тельно низкие значения констант говорят о весьма высокой про

ности связей в этих нековалентных комплексах. Эта особенное!

была использована для разработки удобного метода определена

концентрации карбоангидразы титрованием ее растворов эток

золамидом [103, 105, 112]. Как отмечалось выше, спектральнь

изменения при связывании сульфамидов и исследования с ni

мощью

Н-ацетазоламида свидетельствуют о непосредственно

взаимодействии сульфамидов с ионами металла в активно

центре [20, 21], причем координация, очевидно, происходит г

счет группы —SO

—NH

[21, 111]. Это согласуется с результатам

рентгеноструктурного анализа [22, 23] кристаллического компле:

са карбоангидразы С человека с сульфамидом. Они показываю

что во внутреннюю координационную сферу цинка включена ами:

ная группа сульфамида (разд. 6). По-видимому, в связыванг

участвуют анионная группировка (—SO

—NH

) с одним прот

ном, замещенным на металл [30, 103]. В отсутствие конкуренцг

последнего величина р/С

для этой группировки колеблется от

до 10 (в зависимости от структуры R) [109, 115]. Некоторые

исследователями было обнаружено максимальное связываю

при рН~7. В кислых и щелочных растворах прочность взаим

действия быстро падает [86, 115, 116]. Причиной распада ком

лекса в кислой области может являться уменьшение количесп

анионной формы ингибитора.

В щелочных растворах сульфамиды, вероятно, вытесняются]

координационной сферы конкурирующими гидроксильными ион

ми. Точно так же зависит от рН и константа скорости второ]

порядка для образования комплекса фермент — сульфанилами

Карбоангидраза 595

Таблица 16.11

«Константы диссоциации» для комплексов карбоангидразы с сульфамидами

Соединение

Константа

диссоциации, M

Литература

ульфаниламид

2,8 ю-

111

-Ацетилсульфаниламид

5,0

ю-' 111

ихлорфенамид 2,5

IO-

111

цетазоламид

8,0

ю-

111

1,5

Ю-76

.етазоламид

9,0 ю-

111

тоюсзоламид

1,0

ю-

111

лоротиазид

2,2

ю-

111

,иклотиазид

6,0 ю-'

лорацетилциклотиазид 6,5

ю-

Диметиламинонафталин-1 -сульфамид

(ДНСА)

2,5

IO-

103

'-Сульфамилфенил-2-азо-7-ацетамидо-1 -ок-

си,нафталин-3,6-дисульфонат (неопронтозил)

1,5

10-61-

Если не указано иначе, считается, что величина K

- равна константе диссоциации.

> определенная непосредственно по связыванию

Н-ацетазоламида.

> определенная флуоресцентным методом.

определенная спектрополяриметрическим методом.

начение которой составляет п-римерно 7-IO

л-моль-'-с

-1

рН 7,9, 25

C, измерена методом остановленной струи) [115].

Еоэтому величины рК

должны представлять ионизацию какево-

одного фермента, так и свободного ингибитора [115]. Однако

ри интерпретации этих данных надо соблюдать осторожность,

высокая прочность связей карбоангидразы с сульфамидами явля-

тся результатом не только координационного взаимодействия,

о и других эффектов (гидрофобных связей, энтропийных и про-

их вкладов). Поэтому любые изменения в структуре белка

следствие изменения кислотности среды могут также сказы-

;аться на величине сродства к ингибиторам.

При действии сульфамидов на карбоангидразу наблюдается

:инетика ингибирования как конкурентного, так и неконкурент-

ого типа в зависимости от времени наблюдения и порядка сме-

иивания реагентов [116—118]. Причина подобных расхождений,

:ероятно, кроется в чрезвычайно низкой скорости диссоциации

[нгибиторных комплексов, следствием чего является и малая

:корость установления равновесия с конкурирующей молекулой

убстрата [115, 117].

596

Г лава 10

4.2. Спектры поглощения и круговой дихроизм

Особенно ценным оказалось использование сульфамидов в к

честве молекулярных зондов, чему способствует наличие хром

форов в молекулах сульфамидов и белка. Лучший пример белк

вого хромофора — ион Co(II). Выше уже отмечалось (рис. 16.5

Рис. 16.14. Аппроксимация полос в спектрах поглощения и КД Co(II)-карбоа:

гидразы В человека и ее комплексов с этоксзоламидом и цианидом (

сериями перекрывающихся гауссавоких линий ( ).

Сплошные линии на всех частях рисунка представляют собой огибающие кривые для сук

составляющих гауссовских линий, которые показаны штриховыми линиями и пронумеровав

в порядке возрастания энергии. Все огибающие согласуются в пределах ошибки измерен!

с экспериментальными данными. А — спектр поглощения Со(П)-фермепта; Б — спектр погл

щения комплекса с этоксзоламидом; В — спектр КД комплекса с этоксзоламидом; Г

спектр поглощения цианидного комплекса; Д — спектр КД цианидного комплекса. Аппро

снмация выполнена с помощью аппаратуры Du Pont. 310 [119].

что при взаимодействии этого хромофора с сульфамидами меш

ются и интенсивность, и энергетическая структура полос поглощ*

ния в видимой области. Эти сдвиги, как и в случае ингибиров;

ния анионами, ясно свидетельствуют о вхождении лиганда

координационную сферу иона металла. Главные особенност

спектра поглощения обсуждались в разд. 3.

Изменения энергетических характеристик и оптической актш

ности полос поглощения кобальта, проявляющиеся после присо<

динения анионных и сульфамидных ингибиторов к активном

Карбоангидраза

597

центру карбоангидразы, являлись объектом многих исследований.

Эсновные результаты суммированы в примерах, приведенных на

рис. 16.14, где показаны спектры поглощения и КД этоксзоламид-

ных и цианидных производных Со (II)-карбоангидразы В челове-

ка. Эти спектры разложены на соответствующие гауесовские

полосы поглощения и эллиптичности для демонстрации (хотя бы

приблизительной) их тонкой структуры [119].

Из проведенного анализа становятся ясными два обстоятель-

ства. Во-первых, все спектры характеризуются расщеплением ви-

димых полос, что говорит о заметном искажении координацион-

ной геометрии даже в ингибированном ферменте. Во-вторых,

для аппроксимации спектров этокезоламидного комплекса

(рис. 16.14, Б и В) требуется такое же количество гауссовских

полос, что ,и для спектра немодифицированной Со (II)-карбоан-

гидразы (рис. 16.14,/4). Результатом введения сильного лиганда

сульфамида, по-видимому, является также смещение в коротко-

волновую область двух слабых полос. Однако общая мульти-

плетность спектра при этом не снижается. Последнее можно объ-

яснить строгими структурными условиями замещения лиганда

(см. рентгеноструктурные данные, разд. 6). Одновременно изме-

няются спектры КД в ближней ультрафиолетовой области хро-

мофоров, что особенно четко проявляется для цианидного комп-

лекса (рис. 16.14, Г). Эти полосы также легко обнаруживаются в

спектре КД немодифицированного Со(II)-фермента (рис. 16.7 и

16.8). Специфическая геометрия координации активного центра,

свойственная ей необычная серия d—d-переходов (рис. 16.14,А),

а также сродство к сульфамидам являются хорошо известными

особенностями белковой химии карбоангидразы. Такие же спек-

тральные полосы имеются и у Со (II)-производных фермента,

выделенного из акул, который, по-видимому, развивался по обо-

собленному эволюционному пути за несколько сотен миллионов

лет до наступления эры млекопитающих [42].

4.3. Взаимодействие с сульфамидами,

содержащими хромофоры

4.3.1. Оптические спектры

Введением хромофоров в молекулу сульфамида можно выз-

вать появление серии спектральных линий, соответствующих

электронным переходам в области активного центра. Многие

сульфамиды обладают хромофорными группировками, оптиче-

ские свойства которых меняются после связывания с карбоангид-

разой [30, 102, 115, 120]. Но наиболее ярко эти эффекты прояв-

ляются при взаимодействии с оксинафталиновым производным

598

Г лава

азосульфанил амида — 2- (4-сульфанилфенилазо)-7-ацетамидо-1

океинафталин-3,6-дисульфонатом (VI)

ОН

,N=N-/ SO

NH,

S-

Для этого сульфамида характерны интенсивные полосы поглоще-

ния в видимой области около 500 нм и ряд полос в ультрафиоле-

товой области. При связывании с карбоангидразой наблюдается

+ )

га

'Cl

,—

(-)

- у

200

300 300

X, HM

J -

500

(+)

о I

ю 5

(-)

Рис. 16.15. Спектры КД карбоангидразы В (-

плекса с азосульфамидом (-

и ее эквимолярного ком-

-) [120].

сильная гипохромия в полосах в видимой области и смещение в

длинноволновую область на несколько нанометров. Количествен-

ные характеристики этих явлений специфичны для каждого изо-

фермента и видового варианта карбоангидразы [30].

Очень похожие изменения спектральных свойств у этого хро-

мофора наблюдаются и в неполярных растворителях ,[30]. Можно

заключить, что ферментативный центр связывания сульфамидов

имеет гидрофобную природу [30]. Такой вывод подтверждается и

рядом других спектральных исследований [103, 105].

Дополнительная большая оптическая активность появляется у

азосульфаниламида ,вследствие связывания этой симметричной

молекулы хромофора с асимметричным белковым окружением

[30, 120]. Спектры КД в видимой области для комплексов этого

Карбоангидраза

599

сульфамида с карбоангидразой В обезьяны приведены на

рис. 16.15, где для сравнения также показан спектр нативного

фермента [120]. Наряду с большими полосами эллиптичности в

видимой области имеются дополнительные интенсивные полосы

эллиптичности в ультрафиолетовой области, которые полностью

затемняют КД-сиектр нативного белка. Сила вращения некото-

рых этих полос (Rh~2-IO

-38

ед. CGS) по своей величине больше

соответствует собственно несимметричным хромофорам, чем сим-

метричным, оптическая активность которых возбуждена асиммет-

ричным окружением [121]. Следовательно, структуре белка свой-

ственно особенно эффективное асимметрическое потенциальное

поле [30].

У разных типов карбоангидразы величина и знак полос эллип-

тичности для комплексов с этим сульфамидом сильно различа-

ются [30]. Очевидно, это является следствием различной молеку-

лярной структуры областей, окружающих активный центр.

К такому же заключению приводят и результаты, полученные ме-

тодом ЯМР с

Cl :[122, 123] и комплексометрическим титрова-

нием [86]. Подобные структурные расхождения могут служить

причиной неодинаковой удельной активности у изоферментов и

видовых вариантов !карбоангидразы [77].

4.3.2. Флуоресценция

Карбоангидраза быка образует сильно флуоресцирующий ком-

плекс с 5-диметиламинонафталин-1-сульфамидом (ДНСА) [103].

Исследуя усиление флуоресценции лиганда и тушение ультрафио-

летовой белковой флуоресценции, Чен и Кернохан [103] показа-

ли, что с одной молекулой фермента связывается одна молекула

флуоресцирующего сульфамида. Константа диссоциации этого

комплекса равна 2,5-Ю

-7

М. Флуоресценция свободного сульфа-

мида имеет пик испускания при 580 нм и квантовый выход 0,055.

Соответствующие значения для связанного ингибитора — 468 нм

и 0,84. Большое смещение максимума испускания в коротковол-

новую область можно объяснить сильной гидрофобной природой

центра связывания, а также отрывом одного протона от сульфа-

мидной группы лиганда при присоединении к ферменту [103].

Расчеты эффективности переноса энергии привели к неожидан-

ным результатам: 85% фотонов, поглощенных семью остатками

триптофана, переносятся к единственной связанной молекуле

ДНСА. Такая эффективность намного больше когда-либо ранее

наблюдавшейся у белков, содержащих только одну 5-диметила-

минонафталин-1-сульфанильную группировку. Хотя диаметр гло-

булы равен 51 А, связанная молекула ДНСА, очевидно, удалена

от каждого из семи остатков триптофана не больше, чем на кри-

тическое расстояние переноса, составляющее для триптофана

600 Г лава

.21,3 А. Согласно этим данным, остатки триптофана и центр свя

зывания сульфамида находятся в глубине молекулы. Рентгено

структурный анализ (разд. 6), выполненный, правда, на друго»

видовом варианте (карбоангидраза С человека), привел к таком;

же заключению. Тем самым доказывается аналогичность струн

тур этих двух форм фермента.

4.3.3. Фосфоресценция

Гэлли и Страйер [124] использовали явление фосфоресценции

возникающей при триплет-триплетном переносе энергии, дл:

изучения взаимодействия еще одного связанного сульфамида

остатками триптофана в белке. Между синглетными состояниям]

хромофоров перенос электронной энергии возбуждения возможе)

на расстояния порядка 30 А, тогда как триплет-триплетны]

перенос энергии требует значительно меньших расстояний -

около 12 А. Если синглетное состояние триплетного акцептор,

обладает большей энергией, чем еинглетное состояние триплетно

го донора, последний может возбуждаться светом с длиной вол

ны, не поглощаемым триплетным акцептором. В этих условия

фосфоресценция триплетного акцептора наблюдается только пр:

триплет-триплетном переносе энергии. Гэлли и Страйер [124

обнаружили подобные явления у !комплекса карбоангидразы бык,

с ж-ацетилбензолсульфамидом (МАБС). Фосфоресценция трипто

фана карбоангидразы вызывается юветом с Я=280 нм. Фосфорес

ценция сульфамида возбуждается светом ic длиной волны 330 нм

которая ие вызывает свечения фермента. Однако в комплексе

фосфоресцирующем при воздействии >.=330 нм, свечение, вере

ятно, обусловлено скорее триптофаном, чем МАБС [124]. Следо

вательно, остатки триптофана расположены очень близко о

центра связывания, образуя, видимо, поверхность его полости.

5. ЯДЕРНЫЙ МАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС

И ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАРАМАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС

До недавнего времени методы магнитного резонанса не ис

пользовались для исследования карбоангидразы. Однако тепер

методы протонного магнитного резонанса и электронного спинс

вого резонанса применяются и для этого фермента благодаря хи

мическим особенностям его активного центра, содержащего ио

металла. Используя хорошо известный эффект увеличения скорс

ста релаксации протонов воды, индуцированный парамагнитным

ионами металлов, Фабри и сотр. [125] доказали присутствие ко

ординированных H

O или OH

в первой координационной сфер

Co(II) в активном центре карбоангидразы. Парамагнитный ио

Карбоангидраза

601

[еталла имеет -магнитный момент, в несколько тысяч раз боль-

шй, чем другие ядра. Поэтому беспорядочное движение таких

онов оказывает гораздо больший эффект на релаксирующие

оседние протоны растворителя, особенно если парамагнитный

;ентр включен в макромолекулу с относительно слабым тепловым.

Рис. 16.16. рН-Зависимость удельной скорости релаксации при малых частотах:

Со(П)-карбоангидраз В быка (1) и человека (2).

Сплошные линии получены при обработке методом наименьших квадратов. Стрелки указь;|-

вают величины рK

- Условия: 0,1 M трис, 0,1 M SO|~, 25 °С, —10 масс. % [125].

движением. Поскольку замена Zn(II) на Co(II) в активном цент-

ре карбоангидразы сохраняет активность фермента, Со(II)-произ-

водные, содержащие парамагнитный центр, являются идеальным

объектом для таких исследований.

Со(II)-Карбоангидраза вызывает заметное увеличение скоро-

сти релаксации (Г7

) протонов воды, особенно при больших рН

[125]. Это увеличение в значительной степени исчезает при добав-

лении азида или этоксзоламида; это несомненно подтверждает,

что наблюдаемый эффект обусловлен активным центром. Усиле-

ние релаксации в зависимости от рН представлено на рис. 16.16 в

виде удельной скорости релаксации. Ингибируемая составляю-

щая общей Tf

зависит от рН с рК—7,0+0,2 для Со(П)-карбоан-

602

Г лава 10

гидразы быка и с р/( = 8,2±0,2 для Со (II)-карбоангидразы В чело

века. Из зависимости величины ингибируемой ,компоненты обще!

скорости релаксации от напряженности магнитного поля рассчи

таны значения времен корреляции для дипольного взаимодейст

вия протона с электронным моментом кобальта (Ю

-11

с), расстоя

ния между протоном и кобальтом (2,2—2,5 А) и времена пребы

вания протона х

(Ю

-5

с) [125]. Лучше всего эти данные можне

объяснить тем, что протон, определяющий ингибируемую част!

находится либо в гидроксильном ионе, связанном с Co(II)

в активном центре, либо в молекуле воды, которая одним ато

мом водорода связана с соседним остатком. Характерно, что зна

чения рK

, описывающие изменения увеличения скорости релак

сации, очень похожи на величины, полученные для координиро-

ванной молекулы воды при комплексометрическом титрованш

(разд. 7) —8,1 для карбоангидразы В человека и 7,4 для изофер

мента быка [86].

Трудно объяснимой особенностью этого явления остается отно-

сительно слабое усиление релаксации при низких значениях рН

где координированной частицей, скорее всего, является молекула

O. Можно предположить, что в кислой области затруднен (или

происходит по измененному механизму) обмен с протонами воды

из раствора [125]. Напомним, что титрование при рН от 9 дс

6 сопровождается явным изменением геометрии координации

(разд. 3.3). Однако пока не установлена четкая взаимозависи-

мость между возможными изменениями строения координацион-

ной сферы и уменьшением усиления релаксации.

Несколько отличным методом для изучения тех же особенно-

стей активного центра воспользовался Уард [422, 123]. В качест-

ве ЯМР-зонда в этих работах применялся

Cl, ядро которогс

имеет спин

и электрический квадрупольный момент Q. Для

сред, в которых ядра хлора находятся в условиях градиента на-

пряженности электрического поля, ширина линии для резонанса

Cl определяется уравнением

2л

Av =-g- (A/Q)

где Av — полная ширина при половинной амплитуде; q— градиент

напряженности электрического поля у ядра; т — время корреля-

ции, описывающее неупорядоченные молекулярные движения,

ответственные за изменения во времени градиента q [422]. Со-

гласно этому соотношению, связывание

Cl с Zn(II) приводит к

ускорению релаксации ядра и уширению линии (рис. 16.17).

Zn(II)-Карбоангидраза тоже вызывает это уширение, а апофер-

мент нет (рис. 16.17). Это свидетельствует о том, что хлорид мо-

жет занимать одно координационное место у иона Zn(II) в актив-

ном центре. Уширение линии устраняется цианидом, что также