Карнаухов В.Н. Люминесцентный анализ клеток

Подождите немного. Документ загружается.

плоскость микрообъекта 7 с помощью интерференционной светоделителъной пластинки 5.

Введенный в ход лучей светофильтр 4 выделяет требуемую для возбуждения люминесценции линию

излучения ртутной лампы 1. Таким образом, люминесцирующий участок имеет щелевидную форму.

Рис. 1.12. Схема бесщелевого

микрофлуориметра с фоторегистрацией.

1 – ртутная дуговая лампа;

2 – коллектор;

3 – щелевая диафрагма;

4 – светофильтр;

5 – интерференционная светоделительная пластинка;

6 – микрообъектив;

7 – препарат;

8 – запирающий светофильтр;

9 – отражательная реплика дифракционной решетки;

10 – фотопленка;

11 – зеркало;

12 – окуляр;

13 – поворотная призма;

14 – визирная трубка.

Микрообъектив 6 собирает свет люминесценции щелевого участка микрообъекта 7, и с

помощью плоской дифракционой решетки 9 в нулевом порядке создается увеличенное изображение

щелевидной области микрообъекта 7 в свете его люминесценции. В другом участке плоскости 10 в

первом порядке дифракционной решетки 9 получается спектральное разложение света

люминесценции этой же области микрообъекта.

составе попадающего на решетку 9 светового пучка имеется также частично прошедшая

через запирающий светофильтр 8 возбуждающая люминесценцию линия излучения дуговой лампы 1,

отраженная от покровного стекла микрообъекта 7. Изображение этой линии в спектре первого

порядка дифракционной решетки может быть использовано в качестве реперной точки при

последующей обработке фотопленки на микрофотометре с

целью получения спектра люминесценции

объекта в графической форме.

Для предварительного просмотра микрообъекта 7 и выбора подлежащего спектральному

исследованию участка его в ход лучей нулевого порядка микрообъектива 6 и дифракционной

решетки 9 вводится зеркало 11, направляющее световой поток в плоскость полевой диафрагмы

окуляра 12. Полученное в этой плоскости изображение визуально просматривается с

помощью

визирной трубки 14 и поворотной призмы 13. Система описанного типа может найти применение в

полевых условиях.

П1.6. Высокоапертурный бесщелевой спектрофлуориметр

Высокоапертурный бесщелевой спектрофлуориметр [372, 373]. Хотя, строго говоря, этот

прибор не предназначен для исследования микропрепаратов, его следует упомянуть здесь, так как в

конструкции этого спектрофлуориметра заложена идея бесщелевого микроспектрофлуориметра.

Важнейшая задача, которую необходимо решить в первую очередь при разработке приборов для

спектрального анализа сверхслабого свечения тканей, заключается в создании оптической системы с

максимально возможным светосбором. При люминесцентных исследованиях одиночных клеток эта

задача решается достаточно просто путем применения высокоапертурных микрообъективов.

Однако увеличение яркости объекта по мере увеличения апертуры микрообъективов

сопровождается уменьшением поля зрения. Таким образом, выигрывая в яркости, можно проиграть в

общей интенсивности светового излучения за счет уменьшения массы (объема) излучающего

материала.

С целью

в той или иной мере обойти возникающие противоречия была разработана

оптическая система, сочетающая в себе высокую апертуру микрообъектива и относительно большое

поле зрения (рис. 1.13, 2, 3). Все элементы этой системы выполнены в виде отражающих зеркальных

поверхностей, что дает возможность использовать ее в диапазоне от ультрафиолетовой до

инфракрасной области спектра.

Излучающий объект

1 помещен в фокусе объектива, состоящего из собирающего вогнутого

сферического зеркала 2 и формирующего параллельный пучок выпуклого зеркала 3.

Сформированное в виде параллельного пучка излучение объекта 1 попадает непосредственно на

дифракционную решетку 4 и с помощью плоского зеркала 5 направляется на выходное сферическое

зеркало 6, в плоскости фокусировки которого размещена выходная

щель 7. За выходной щелью 7

установлен фотоумножитель 8, регистрирующий спектр излучения.

С целью сравнения спектров сверхслабого хеми- и биолюминесцентного излучения объекта 1

со спектрами собственной фотолюминесценции этого же объекта в описываемое устройство введена

дополнительно система возбуждения фотолюминесценции, содержащая в своем составе дуговую

лампу 9, линзу 10 и светоделительную пластинку с интерференционным покрытием 11.

Рис. 1.13. Схема

высокоапертурного бесщелевого

спектрофлуориметра.

1 – объект исследования;

2, 3 – зеркальный светосильный объектив;

4 – дифракционная решетка;

5 – плоское зеркало;

6 – сферическое зеркало;

7 – выходная щель монохроматора;

8 – ФЭУ;

9 – дуговая лампа;

10 – конденсор;

11 – светоделительная пластинка;

12 – контротражатель.

Эффективное относительное отверстие светоотбирающей системы равно примерно 1:0,6.

Светосила прибора может быть повышена за счет использования контротражателя 12.

П1.7. Микроспектрофотометр для изучения фосфоресценции клеток

Микроспектрофотометр для изучения фосфоресценции клеток [376]. Описывая

фотоиндуцированное излучение микрообъекта, обычно приходится определять его как

люминесценцию, не уточняя, идет ли речь о флуоресценции или о фосфоресценции. Причиной этого

является в основном отсутствие приборов, необходимых для определения типа наблюдаемой

люминесценции. В то же время этот вопрос в ряде случаев приобретает принципиальное значение

так как триплетные состояния возбужденных хромофоров, при дезактивации которых возникает

фосфоресценция, могут играть значительную роль в таких важных внутриклеточных процессах, как,

например, зрение и фотосинтез. Более того, иногда оказывается важным точно знать, из какого

возбужденного состояния - синглетного (флуоресценция) или триплетного (фосфоресценция) -

происходит излучение красителя-метки, связанного с объектом исследования. В

связи с этим были

предприняты успешные попытки создания ряда приборов для изучения фосфоресценции

микрообъектов [374—379]. Одну из этих установок [376], по-видимому, наиболее удачную,

целесообразно рассмотреть подробнее.

Оптическая схема установки приведена на рис. 1.14. В качестве источника возбуждающего

излучения 1 использована ртутная дуговая лампа типа ДРШ-100-2, помещенная в фокусе кварцевого

конденсора 2. Изображение светящегося

тела лампы переносится коллектором 4 в плоскость

апертурной диафрагмы 5, которая коллектором 6 изображается в плоскости входного зрачка

микрообъектива 9. Плоские зеркала 3 и 7 и сменная интерференционная светоделительная пластинка

8 меняют направление светового потока. Три сменных пластинки 8, отличающиеся одна от другой

границей между областями пропускания и отражения, закреплены

в специальном опак-

иллюминаторе. Это позволяет выбрать наиболее оптимальные условия возбуждения и регистрации

люминесценции объекта.

Плоскость полевой диафрагмы 10 сопряжена оптически с плоскостью объекта 11, что

позволяет менять размеры исследуемого участка препарата, изменяя размер полевой диафрагмы. В

установке предусмотрена возможность использования охлаждающего столика 12, представляющего

собой миниатюрный газовый холодильник [378], работающий на

основе эффекта Джоуля-Томпсона.

При этом температура исследуемого объекта может поддерживаться в интервале от комнатной до -

192° С.

Для разделения во времени возбуждающего излучения и света фосфоресценции применяется

механическая модуляция, осуществляемая сменным диском 16, закрепленным на оси двигателя

постоянного тока 17. На разных расстояниях от оси вращения диска расположены две системы

вырезов

, одна из которых служит для модуляции возбуждающего излучения, в то время как другая -

для модуляции света фосфоресценции. При этом соотношение между длительностью возбуждения,

длительностью наблюдения и интервалом между ними определяется геометрией диска, а абсолютные

значения этих временных интервалов изменяются линейно с изменением числа оборотов диска,

которое в данной установке может

плавно меняться от 5 до 100 об/с. Специальное стробоскопическое

устройство служит для точного определения числа оборотов диска. Модуляция возбуждающего

излучения осуществляется в плоскости апертурной диафрагмы 5, а модуляция света фосфоресценции

- в плоскости выходного зрачка микроскопа, расположенного за окуляром 18, т. е. в местах

наименьших сечений световых пучков.

Рис. 1.14. Оптическая схема фосфоресцентного

микроскопа с одним модулирующим диском

[376].

–

лампа ДРШ 100-2;

–

кварцевый конденсор;

–

плоское зеркало;

–

кварцевый коллектор;

–

апертурная диафрагма;

–

кварцевая линза;

–

плоское зеркало;

– интерференционная

светоделительная пластинка;

–

микрообъектив;

– полевая диафрагма;

– объект;

– микрохолодильник;

– лампа накаливания СЦ-61;

– стеклянный коллектор;

– выдвижное зеркало;

– модулирующий диск;

– электродвигатель;

– окуляр;

– микрофотонасадка;

– откидывающаяся призма;

– входная щель монохроматора;

– вогнутое зеркало;

– выходная щель;

– реплика дифракционной

решетки;

– откидывающееся плоское

зеркало;

– фотоумножитель;

– опорный ФЭУ;

– кварцевая пластинка.

В наборе имеются специальные диски для исследования флуоресценции. Система

модулирующих прорезей в этих дисках такова, что возбуждающее излучение и свет флуоресценции

прерываются одновременно и, таким образом, вся установка превращается в обычный

микроспектрофлуориметр. Естественно, что при этом в оптическую систему необходимо ввести

светофильтры для выделения области возбуждения и запирающий светофильтр.

Исследуемое

излучение объекта из окуляра 18 попадает в микрофотонасадку 19 типа МФН-3.

Наблюдение объекта в свете фосфоресценции осуществляется с помощью призмы 20. При

фотографировании и спектральных исследованиях призма 20 выводится из хода лучей. Для

регистрации спектральных характеристик вместо фотоаппарата устанавливается монохроматор с

фотоумножителем, как это показано на рис. 1.14. При этом плоскость

входной щели 21

монохроматора совпадает с плоскостью изображения объекта. Алюминированное вогнутое зеркало

изображает входную щель 21 в плоскости выходной щели 23. Диспергирующим элементом служит

реплика дифракционной решетки 24, поворотом которой осуществляется развертка спектра. В случае

исследования слабосветящихся объектов перед репликой может быть введено зеркало 25. При этом

изображение входной щели 21

совпадает с выходной щелью 23 и регистрируется изменение

интенсивности свечения объекта в широком спектральном диапазоне.

В качестве, приемника излучения используется фотоумножитель 26 типа ФЭУ-39, питание

которого осуществляется высоковольтным источником ВС-22. Регистрирующая часть установки

выполнена в нескольких вариантах, соответствующих разным режимам ее работы. В одном варианте

сигнал с ФЭУ через усилитель

У1-2 подается на самописец, на ленте которого при повороте реплики

дифракционной решетки записывается спектр исследуемого свечения. Кривая затухания в этом

случае может сниматься или по точкам, или посредством изменения скорости вращения

модулирующего диска и применения дисков разной геометрии, или при помощи стробирования [371]

ФЭУ в определенный момент времени после окончания возбуждающего импульса

. Последняя

система позволяет значительно увеличить постоянную времени регистрации и существенно

улучшить соотношение сигнал - шум.

Для быстрой регистрации кривых затухания послесвечений с временем жизни 10

-4

-10

-1

служит система, состоящая из ФЭУ-39, широкополосного усилителя переменного тока типа Ф-73 и

осциллографа С1-4 (С1-19). Развертка осциллографа по времени может быть как линейной, так и

экспоненциальной.

Опорный сигнал, необходимый для стробирования ФЭУ-39, подается с дополнительного

фотоумножителя 27, на который с помощью кварцевой пластинки 28 отражается 5-7%

модулированного светового потока, возбуждающего свечение

объекта. Этот же сигнал служит для

синхронизации экспоненциальной развертки осциллографа при исследовании кривых затухания.

Определенным недостатком этой системы является относительно малое временное

разрешение (не более 10

-4

с). Существенное повышение временного разрешения вряд ли возможно в

системах с механической модуляцией световых потоков. По-видимому, дальнейшие перспективы в

этой области связаны с применением импульсных источников света, в том числе лазерных

умножителей частоты, а также различных электрических и магнитных модуляторов световых

потоков.

В заключение этого раздела следует отметить, что в зависимости от конкретной задачи

исследования схема микроспектрофлуориметра и его

устройство могут широко варьировать.

Приложение 2

П2. Микрофлуориметры

Простота изготовления одноканальных микрофлуориметров, позволяющих объективно

измерять интенсивность люминесценции в том или ином выделяемом светофильтром участке

спектра, привела к довольно широкому распространению их. При этом используются как

электронные [380-384], так и фотографические [385-386] системы регистрации.

Однако, учитывая, что промышленностью выпускается удобная в работе фотоэлектрическая

насадка типа ФМЭЛ-1, представляющая собой в комплекте с

люминесцентным микроскопом, в

особенности с такими, как МЛ-4 [21] или «Люмам ИЗ» [387], хороший и надежно работающий

микрофлуориметр, нет надобности описывать здесь устройства лабораторного изготовления.

Необходимо только еще раз подчеркнуть изложенные выше соображения о трудностях

интерпретации результатов измерения интенсивности одной полосы люминесценции, тем более, что

широкий набор входящих в состав ФМЭЛ-1 интерференционных фильтров

позволяет проводить

измерения последовательно в нескольких участках спектра.

Определенный интерес представляют собой используемые в ряде лабораторий

многоканальные микрофлуориметры, позволяющие производить измерения интенсивности

люминесценции одновременно в заранее выбранных участках спектра [388-404].

П2.1. Трехканальный микрофлуориметр

Одним из примеров подобного типа устройств является трехканальный микрофлуориметр,

блок-схема которого приведена на рис. 2.1. Прибор позволяет одновременно измерять интенсивность

люминесценции в синей (420-480 нм), желтой (500-560 нм) и красной (600-750 нм) областях спектра.

Здесь светоделительные пластинки (рис. 2.1, 3, 10, 11) использованы не только для отделения света

люминесценции от возбуждающего его излучения (3), но и

для грубого разделения света

люминесценции по трем спектральным областям (10, 11).

Основой прибора является люминесцентный микроскоп МЛ-3, подвергнутый некоторым

конструктивным изменениям. С целью построения инвертированной системы произведена

перестройка крепления зеркала визуального наблюдения 8. Кроме того, стандартная «желтая»

пластинка, которой комплектуется микроскоп МЛ-3, заменена «синей» светоделительной пластинкой

Таким образом, ультрафиолетовое излучение источника

1 типа ДРШ-250, организованное

оптической системой осветителя 2 микроскопа МЛ-3, отражается «синей» пластинкой 3 и

микрообъективом 4 фокусируется на микрообъект 5, возбуждая его видимую люминесценцию. Свет

люминесценции микрообъекта, собранный объективом 4, свободно проходит через «синюю»

светоделительную пластинку 3 и запирающий светофильтр 7 типа ЖС-3 и попадает на «желтую»

светоделительную пластинку

10.

Как видно из спектральной характеристики, приведенной на рис. 2.2, 1, пластинка 10

отражает лучи синей области спектра, направляя их на фотокатод ФЭУ-51 (1), и пропускает лучи

желто-зеленой и красной областей спектра на «красную» светоделительную пластинку 11.

Спектральная характеристика пластинки 11 такова, что она отражает лучи желто-зеленой области

спектра, направляя

ее на фотокатод ФЭУ-51 (2) следующего канала, и пропускает лучи красной

области спектра.

Прошедший через «красную» светоделительную пластинку свет люминесценции поворотной

призмой 12 направляется на фотокатод ФЭУ-51 третьего канала прибора для регистрации. Для

улучшения спектральных характеристик каждого из каналов перед фотокатодами фотоэлектронных

умножителей могут быть установлены дополнительные запирающие фильтры.

Подбором

этих дополнительных запирающих фильтров и изменением коэффициентов

усиления фотоумножителей чувствительность всех трех каналов может быть установлена

одинаковой. Визуальное наблюдение объекта в этом приборе осуществляется с помощью окуляра 9

при введении в ход лучей зеркала 8. Полевая диафрагма осветителя 2 используется для ограничения

поля зрения и выбора, таким образом, подлежащего исследованию участка

изучаемого объекта.

Рис. 2.1. Блок-схема трехканального инвертированного микрофлуориметра.

1 – ртутная дуговая лампа ДРШ-250;

2 – проекционная система осветителя микроскопа МЛ-3 (МЛД);

3 – интерференционная светоделительная пластинка («синяя»);

4 – микрообъектив;

5 – препарат;

6 – предметный столик;

7 – запирающий светофильтр;

8 – зеркало;

9 – окуляр;

10 – интерференционная светоделительная пластинка («желтая»);

11 – интерференционная светоделительная пластинка («красная»);

12 – поворотная призма;

13, 14, 15 – каналы электронной регистрации.

На рис.2.1 не приводится электрические блоки питания и регистрации. Для этой цели могут

быть использованы любые из описанных выше систем, а также специальная система импульсного

возбуждения и регистрации люминесценции.

П2.2. Двухканальный импульсный микрофлуориметр

Двухканальный импульсный микрофлуориметр [393]. Другим примером построения схемы

микрофлуориметра, позволяющей существенно уменьшить ошибки измерения, обусловленные как

нестабильностью источника возбуждающего люминесценцию излучения, так и изменением

интенсивности и цвета люминесценции объекта за счет фотохимического разрушения флуорохрома,

может служить схема, приведенная на рис. 2.2. Прибор собран на основе опытного образца

люминесцентного микроскопа «Люмам» (1, 2, 6-10, 17—20, 35-38), выпускаемого

ЛОМО.

Одной из отличительных особенностей этого микрофлуориметра является использование

импульсной лампы 3 типа ИФТ-200 с непрерывным спектром излучения [394] для возбуждения

люминесценции препарата 19. При этом часть (≈7%) возбуждающего люминесценцию излучения,

выделяемого светофильтром 8 из общего потока лампы 3 полированной кварцевой пластинкой 11,

ответвляется в канал сравнения, состоящий из диафрагмы 12, позволяющей

регулировать величину

оптического сигнала, оптических элементов 13-15 и фотоумножителя 16 типа ФЭУ-71.

Основной поток возбуждающего излучения, прошедший через пластинку 11, отражается

интерференционной светоделительной пластинкой 17 и микрообъективом 18 фокусируется в

плоскость препарата 19, возбуждая его люминесценцию. Люминесцентное излучение объекта,

собранное микрообъективом 18, проходит через светоделительную пластинку 17, запирающий

светофильтр 21 и линзу

23, с помощью интерференционной пластинки 24 создает два изображения

объекта (в коротковолновой и длинноволновой) областях спектра люминесценции) в плоскостях

диафрагм 25 и 31 соответственно. Изображение в плоскости регулируемой зеркальной диафрагмы 25

может рассматриваться с помощь визирной системы 29, 30. При этом производят совмещение

фотометрируемого участка изображения микрообъекта с фотометрическим отверстием диафрагмы

25. Поскольку диафрагма 31 «красного» канала оптически сопряжена с диафрагмой 25,

предполагается, что отверстие диафрагмы 31 будет совмещено с тем же участком изображения

микрообъекта.

Рис. 2.2. Двухканальный импульсный микрофлуориметр [393].

–

лампа накаливания КГМ-75;

, 37 – коллекторы;

–

импульсная лампа ИФТ-200;

–

переключающееся зеркало;

, 14, 26, 32 – линзы;

–

апертурная диафрагма;

–

возбуждающий светофильтр;

12 – полевые диафрагмы;

– кварцевая пластинка;

35 – зеркала;

21, 27, 33 – запирающие

светофильтры;

28, 34 – ФЭУ;

24 – сменные интерференционные

светоделители;

– микрообъектив;

– препарат;

– фазовоконтрастный конденсор;

– система фокусировки для

контрастной микроскопии;

– ахроматическая тубусная линза;

31 – фотометрическая диафрагма;

30 – система для визуального

наблюдения;

– зеленый светофильтр;

– лампа накаливания;

40 – интегрирующие емкости;

42 – переключающиеся контакты.

Описанная система позволяет проводить два типа измерении. по одноволновому и по

двухволновому методам.

Если препарат окрашен монохроматическим красителем, максимум излучения которого

лежит, например, в желтой области спектра, то применяется одноволновый метод регистрации с

помощью системы 25—28, как это показано на рис. 2.2. Второй измерительный канал 12-16

используется для устранения влияния нестабильности

светового потока источника излучения 3. При

этом во время импульсной вспышки источника 3 на фотоумножителе 28 регистрируется сигнал,

обусловленный люминесценцией фотометрируемого участка объекта 19. Одновременно

фотоумножитель 16 регистрирует сигнал, пропорциональный интенсивности возбуждающего

люминесценцию излучения источника 3. Каждый из сигналов накапливается на интегрирующих

конденсаторах 39 и 40 и усиливается усилителями постоянного тока. Частное

от деления рабочего и

опорного сигналов регистрируется цифровым вольтметром ВК2-6, перестроенным по схеме деления

и показывающим интенсивность люминесценции в относительных единицах. Для измерения

двухволновым методом на интегрирующий конденсатор 40, сигнал подается с фотоумножителя 34

«красного» измерительного канала. Цифровой вольтметр при этом показывает отношение

интенсивностей люминесценции объекта в «желтой» и «красной

» областях спектра, которое также не

зависит от изменений интенсивности возбуждающего излучения.

Положительной особенностью прибора является применение цифрового индикатора, что

повышает производительность труда при массовых измерениях большого количества препаратов.

Учитывая, что выход цифрового вольтметра может быть непосредственно подключен к перфоратору,

можно параллельно фиксировать результаты измерения на перфоленте. Это существенно снижает

трудоемкость подготовки материала для обработки на ЭЦВМ (в случае такой необходимости).

В описываемом устройстве для выбора объекта исследования с целью предохранения

препарата от фотохимического выцветания может быть применено наблюдение в

фазовом контрасте

(система 20, 35-38) или в свете люминесценции, возбуждаемой лампой накаливания 1 типа КГМ9-75.

В случае использования контактных объективов для фокусировки на разную глубину ткани линза 23

может быть заменена на фокусирующую систему 22.

Проведенные на этом приборе исследования показали, что при изучении окрашенных

фиксированных препаратов степень фотохимического выцветания объектов

при импульсном

освещении такая же, как и при непрерывном, и зависит только от дозы облучения объекта.

П2.3. Двухканальные поляризационные микрофлуоримегры

Двухканальные поляризационные микрофлуоримегры [395]. Ввиду того, что при изучении

взаимодействия люминесцентных красителей-меток с высокоупорядоченными структурами клеток

(например, мышечных) может возникнуть потребность исследования степени поляризации

люминесценции красителя, представляется полезным дать краткое описание двух

усовершенствованных моделей [395] двухканального поляризационного микрофлуориметра [389].

Оба варианта с фотографической (рис.2.3) и фотоэлектрической (рис.2.4) системами регистрации

предназначены для

работы в широкой области спектра, включая его ультрафиолетовый диапазон.

Принцип действия прибора с фотографической регистрацией (рис. 2.3) состоит в следующем:

на два кадра фотопленки, заряженной в специальную кассету 23, производится одновременное

фотографирование исследуемого объекта в лучах люминесценции, прошедших через призму-

анализатор 22 и отраженных от ее гипотенузной грани, поляризованных в двух взаимно

перпендикулярных плоскостях. Затем с помощью обычной методики фотометрирования

фотографических изображений осуществляется измерение плотностей почернения полученных на

негативах изображений микроструктур и расчет степени поляризации люминесценции.

Люминесценция объекта возбуждается монохроматическим излучением источника 1,

выделяемым с помощью зеркального монохроматора 2-5 с дифракционной решеткой 5, выходной

щелью которого является зрачок микрообъектива 8. Поляризованное призмой 6

возбуждающее

излучение отражается интерференционной светоделительной пластинкой 7 и фокусируется на объект

9 микрообъективом 8. Для устранения влияния интерференционной пластинки 7 на поляризацию

возбуждающего излучения поляризатор 6 ориентируется относительно этой пластинки таким

образом, чтобы колебания электрического вектора были ей параллельны. Ошибку, обусловленную

влиянием пластинки на поляризацию, можно учесть, предварительно измерив ее действие в

рабочей

части спектра, либо скомпенсировать с помощью подобной по пропусканию пластинки,

устанавливаемой над пластинкой 7 в перпендикулярной ей плоскости [396].

Визуальное наблюдение препарата с целью выбора подлежащей исследованию области его

осуществляется с помощью системы 16 или, при работе в ультрафиолетовой области спектра, с

помощью телевизионной установки ПТУ-26 на видиконе 20 с кварцевым окном

. Прибор позволяет

также измерять фотографическим способом величину двойного лучепреломления и дихроизма, для

чего применяется освещение проходящим монохроматическим светом через конденсор микроскопа

10 при выведенных запирающем фильтре 21 и интерференционном светоделителе 7. При изменении

двулучепреломления анизотропного объекта он устанавливается так, чтобы колебания

электрического вектора света составляли с его оптической осью угол 45°. Фотографирование

объекта

производится в области спектра, не поглощаемой исследуемыми структурами.

Для регистрации дихроизма при выведенном из хода лучей поляризаторе производится

фотографирование объекта в лучах выбранной длины волны, находящейся в зоне поглощения

исследуемого участка препарата. Измерив на каждом из двух полученных негативов плотности

почернения в изображении изучаемой структуры и пустого участка, подсчитывают коэффициенты

поглощения света с колебаниями, параллельными (k

║

) и перпендикулярными (k

⊥

) оптической оси

этой структуры. Дихроизм в определенной длине волны определяется по формуле:

Д =( k

║

— k

⊥

)/(k

║

+ k

⊥

Естественно, что перед фотографированием препарат ориентируется определенным образом

относительно анализатора 22.

Отличием фотоэлектрического варианта прибора (рис. 2.4) от описанной выше модели с

фотографической регистрацией является замена фотопленки двумя фотоумножителями 22 и 23.

Отсутствует здесь также телевизионная система наблюдения в ультрафиолете, а оптическая система

визуальной настройки 15-20 построена по зондовой схеме. В то же время в схему введена

дополнительная система 24-27 возбуждения люминесценции объекта от

источника 27. При этом

интерференционная светоделительная пластинка 24 служит дополнительно для компенсации влияния

пластинки 5 на поляризацию люминесценции объекта 7.

Рис. 2.3. Принципиальная оптическая схема фотографического варианта двухканального

микрофлуориметра [395].

1 – источник света (лампа

ДРШ-250-2);

2 – коллектор;

3 – входная щель

монохроматора;

4 – вогнутое зеркало;

5 – плоская дифракционная

решетка;

6, 6’ – сменные

интерференционные

поляризаторы для УФ и

видимой области

спектра;

7 – сменные интерференционные

светоделители;

8 – микрообъектив;

9 – препарат;

10 – конденсор;

11 – апертурная диафрагма;

12, 19 – переключающиеся

алюмированные зеркала;

13, 15 – алюмированные зеркала;

14 – линза;

16 – система визуального

наблюдения;

17 – фотозатвор;

18 – окуляр микроскопа

;

20 – видикон;

21 – запирающие сменные

светофильтры;

22 – сменные интерференционные

анализаторы для Уф и видимой

области спектра;

23 – фотокассета.

Имеются отличия и в системе измерения дихроизма. Под конденсором микроскопа

располагается кристалл исландского шпата 14 с точечной диафрагмой 13, которая раздваивается этим

кристаллом. Два изображения диафрагмы с помощью коденсора проецируются в плоскость

анизотропного объекта, который устанавливается с помощью препаратоводителя так, чтобы одно

изображение диафрагмы попало на исследуемый участок клетки, другое -

на пустой участок

препарата. Каждый из сигналов регистрируется своим ФЭУ (22, 23) при выведенном зеркале 15.

Электронная система регистрации вычисляет отношение этих сигналов, фиксируемое на самописце,

проградуированном для этой цели в значениях оптической плотности, т.е. измеряется коэффициент

поглощения анизотропным объектом составляющей светового потока с колебаниями, параллельными

оси объекта (k

║

). Затем объект перемещают так, чтобы оба изображения диафрагмы 13 в плоскости

препарата поменялись местами, и производят измерение k

⊥

. Дихроизм определяется по приведенной

выше формуле.

Рис. 2.4. Принципиальная схема фотоэлектрического варианта двухканального

поляризационного микрофлуориметра [395].

1 – источник света;

2 – коллектор;

3 – двойной монохроматор;

4 – сменные поляризаторы;

5 – сменные

интерференционные

светоделители;

6 – микрообъектив;

7 – препарат;

8 – конденсор или

микрообъектив;

9, 11, 12 – алюмированные

зеркала;

10 – линза;

13 – точечная диафрагма;

14 – кристалл испанского шпата;

15 – вогнутое алюмированное

зеркало с отверстием;

16 – зеркало;

17, 19 – линзы;

18 – окуляр;

20 – защитные светофильтры;

21 – сменные анализаторы;

22, 23 – ФЭУ;

24 – интерференционный

светоделитель;

25 – светофильтр;

26 – коллектор

;

27 – источник света;

25-27 – осветитель и

интерференционный светоделитель

условно повернуты на 90

относительно оптической оси

микроскопа.

П2.4. Двухканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением

Двухканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением [284]. Основной сферой

применения микрофлуориметров будеть являться, по-видимому, комплексный эксперимент, в

котором регистрация интенсивности люминесценции объекта в определенных длинах волн

предварительно изученного спектра люминесценции его сопровождает регистрацию

физиологических параметров этого же объекта, таких как, например, электрическая или

механическая активность, газообмен и др. В этих

случаях применение громоздкой

микроспектральной техники может оказаться как неудобным, так и излишним. Более того, возникает

необходимость (см. гл. I) регистрировать внутриклеточную компартментализацию состояний тех или

иных (например, энергетических) функциональных систем клетки. В этом случае представляет

интерес не сам спектр люминесценции объекта, а прямая регистрация отношения интенсивности

отдельных полос излучения в этом

спектре (например, ξ, т. е. отношение интенсивности

люминесценции окисленных флавопротеинов к таковой восстановленных пиридиннуклеотидов, а

также упоминавшиеся выше параметры α, β и аналогичные им).

Одним из удобных для этой цели приборов может явиться двухканальный микрофлуориметр

с раздельным возбуждением люминесценции двух исследуемых соединений. Его принципиальная

оптическая схема, собранная на основе люминесцентного микроскопа «Люмам», приведена на рис.

2.5. Возбуждение флуоресценции осуществляется падающим через микрообъектив 12 излучением с

применением в опак-иллюминаторе сменных интерференционных светоделателей 11. В качестве

источника света 1 использована ртутная лампа ДРШ-250-2. Ограничение размеров освещаемого поля

осуществляется с помощью диафрагмы 10 типа «кошкин глаз», а

выделение фотометрируемого

участка - с помощью регулируемой зеркальной диафрагмы 17, расположенной в плоскости

изображения объекта. Наблюдение объекта с целью выбора места препарата для фотометрирования и

приведение измеряемой структуры внутрь зонда может осуществляться как в свете люминесценции,

так и по методу фазового контраста. В последнем случае обычный микрообъектив 12 заменяется

фазовым, а освещение

производится в проходящем свете от лампы накаливания 27 через фазово-

контрастный конденсор 14. Преимуществом такого способа освещения является минимальное

фотохимическое воздействие возбуждающего света на объект. Изображение объекта, полученное в

плоскости зеркальной диафрагмы 17, наблюдается с помощью оптической системы 22.

Интенсивность флуоресценции части объекта, изображение которой приходится на отверстие в этой

диафрагме, регистрируется с помощью фотоумножителя 20 типа ФЭУ-71.

Рис. 2.5. Оптическая схема двухволнового микрофлуориметра с раздельным

возбуждением [284].

1 – дуговая лампа;

2, 5, 9, 18, 28 – линзы;

3, 30 – теплофильтры4

4 – затвор;

6, 10, 17, 25, 29 – диафрагмы;

7 – сменный диск со

светофильтрами;

8, 8’ – светофильтры возбуждения;

11 – сменные светоделители;

12 – микрообъектив;

13 – препарат;

14 – конденсор;

15, 21 – системы сопряжения;

16, 24, 31 – зеркала;

19, 19’ – светофильтры;

20, 26 – ФЭУ;

22 – система визуального наблюдения;

23 – кварцевая пластинка;

27 – лампа накаливания.

Возбуждающие и запирающие стеклянные светофильтры попарно установлены в прорезях

диска 7, как это показано на рис. 2.5, 4. Они находятся на разных расстояниях от оси вращения диска

и ориентированы в нем таким образом, что каждому возбуждающему светофильтру в осветительной

части прибора соответствует определенный запирающий светофильтр перед фотоумножителем в

регистрирующей системе. Так, в

одном из вариантов возбуждающий светофильтр 8" изготовлен из

стекла УФС-6 (толщиной 4 мм), соответствующий запирающий светофильтр 19" - из стекол СС-5 (3

мм) и ЖС-3 (1 мм). Это пара светофильтров соответствует максимумам возбуждения и излучения

восстановленных пиридиннуклеотидов. Для регистрации окисленных флавопротеинов применяется

пара светофильтров: 8' - из стекла СС-5 (4 мм) и 19' - из стекла 3С-8 (4 мм

). При вращении диска

оптическую ось осветительной части прибора пересекают попеременно возбуждающие светофильтры

8 или 8', в эти моменты перед ФЭУ оказываются соответствующие запирающие светофильтры 19' и

19". Частота смены светофильтров 60 Гц. Это обеспечивает практически одновременную

регистрацию различных полос люминесценции. Сигналы после ФЭУ усиливаются, распределяются

на два канала и попадают в электрическую

систему, которая может регистрировать абсолютные