Карнаухов В.Н. Люминесцентный анализ клеток

Подождите немного. Документ загружается.

исследования спектров люминесценции клеток в области 500—700 нм без коррекции регистрируемой

кривой на спектральную чувствительность установки.

Основным недостатком модели являлся завал спектральной характеристики в области от 400

до 500 нм, определяемый спектральной характеристикой стандартной «желтой» интерференционной

светоделительной пластинки 12 опак-иллюминатора ОИ-17, использованного в описанном

микроспектрофлуориметре. По спектру отражения (под углом 90°) и обратному ему

спектру

пропускания «желтой» пластинки (рис. 1.2, 1) можно видеть, что она хорошо отражает излучение в

области 380—460 нм, используемое для возбуждения люминесценции, и пропускает с малыми

искажениями свет люминесценции объекта в области >530 нм. Пластинками такого типа

комплектуется большинство отечественных люминесцентных микроскопов (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3) и

осветителей (ОИ-17, ОСЛ-1, ОИ-30).

Расширить спектральный диапазон

микроспектрофлуориметра можно, заменив эту пластинку

на «синюю» светоделительную пластинку, спектральная характеристика которой приведена на рис.

1.2, 2 [169]. Для возбуждения люминесценции будут использоваться только лучи УФ-области спектра

в диапазоне от 300 до 400 нм.

При этом спектральный диапазон микроспектрофлуориметра, в котором можно

регистрировать спектры люминесценции объекта практически без коррекции их на спектральную

чувствительность

прибора, увеличивается от 420 до 700 нм. Приведенные на рис. 1.3 спектры

люминесценции стандартных образцов стекол ЖС-19 (1, 2) и БС-10 (3, 4), полученные на

микроспектрофлуориметре с «синей» пластинкой, незначительно отличаются от паспортных

характеристик этих образцов [361].

Рис. 1.2. Спектральные характеристики

«желтой» (1) и «синей» (2)

светоделительных пластинок. По оси

абсцисс – длина волны в нм; по оси ординат

справа – пропускание в %, слева –

оптическая плотность.

Рис. 1.3. Спектры люминесценции

стандартных образцов стекол ЖС-19 (1, 2) и

БС-10 (3, 4). 1, 3 – спектры, полученные на

микроспектрофлуориметре; 2, 4 –

паспортные характеристики.

В ряде случаев бывает необходимо использовать для возбуждения люминесценции излучение

сине-фиолетовой области спектра (400—460 нм). В этом случае «желтая» пластинка вновь

становится необходимой. Поэтому желательно иметь в составе микроспектрофлуориметра обе

светоделительные пластинки. Наиболее удобно использовать с этой целью вместо опак-

иллюминатора ОИ-17 узел сменных светоделительных пластинок от люминесцентного осветителя

типа

ОИ-30 с контактными объективами [21], предварительно заменив в этом узле нейтральную

полупрозрачную светоделительную пластинку на «синюю» пластинку с интерференционным

покрытием. Это тем более возможно, что контактные объективы, входящие в комплект осветителя

ОИ-30, необходимо иметь в составе микроспектрофлуориметра не только для исследования

подвижных клеток и тканей, таких, например, как мышечные, но и для

работы с суспензиями клеток

или органелл. В этом случае преимущества контактного объектива заключаются в том, что его

выступающая фронтальная линза погружается в кювету с суспензией на фиксированную глубину и

изменение высоты поверхности жидкости при добавлении в кювету субстратов, ингибиторов или

иных агентов не влияет на величину регистрируемого сигнала.

Приведенные на рис. 1.3 спектры имеют линейную развертку по шкале длин волн. Это

достигается применением профилированного кулачка (рис. 1.1, узел 2), компенсирующего

нелинейность дисперсии призменного спектрографа ИСП-51.

Приведенный на рис. 1.1 одноканальный самописец ЭПП-09 (КПС-4), несмотря на свою

широкую распространенность, неудобен в работе, так как регистрируемые на нем спектры

оказываются равномерно распределены по длине диаграммной ленты, что затрудняет их сравнение

непосредственно в процессе эксперимента. В этом отношении более удобны двухкоординатные

самописцы (например, ПДС-01

или ПДП4-002), ось Х которых питается напряжением с ползунка

потенциометра, жестко связанного с валом кулачка развертки спектра. Для питания потенциометра

может быть использован любой низковольтный источник стабильного постоянного напряжения. В

этом случае семейство спектров люминесценции исследуемого объекта может регистрироваться на

одном листе бумаги, что позволяет непосредственно в процессе эксперимента следить за

изменением

формы спектра.

Продолжая перечисление возможных усовершенствований микроспектрофлуориметра при

замене стандартных блоков, входящих в его состав, необходимо особо коснуться источника

возбуждающего люминесценцию излучения - дуговой ртутной лампы типа ДРШ-250. Стабильность

этого источника может быть резко повышена.

Примером газоразрядных дуговых ламп с ртутным (см. Приложение 4) и ксеноновым (см

Приложение 5) наполнением, отличающихся высокой

стабильностью положения излучающего

плазменного шнура, является ртутная дуговая лампа типа ДРШ-250-2 [362], уровень собственных

шумов которой не превышает 0,02% в полосе 1 Гц - 10 кГц [363]. Однако столь высокая стабильность

может быть реализована только при питании этой лампы от стабилизированного источника тока.

Ввиду большой перспективности применения подобного типа источников излучения в

микроспектрофлуориметрах представляется полезным привести здесь

схему (рис. 1.4, а) одного из

стабилизированных источников тока [363]. Выпрямитель, выполненный на диодах Д-245 и имеющий

на входе автотрансформатор Атр, при положении 1 переключателя П2 нагружен на цепь, состоящую

из дуговой лампы R

и балластного сопротивления R

== 0,8- 1,5 Ом. Пока лампа не зажжена,

напряжение на ней равно напряжению холостого хода выпрямителя, что для лампы типа ДРШ-250-2

должно составлять 80—90 В. Это напряжение достаточно для зажигания лампы при подаче

поджигающего импульса.

Рис. 1.4. Схема лабораторного источника

питания дуговых ламп (а) и блок-схема

источника питания Ип-16 (б).

После поджига лампы и выхода ее в рабочий режим, когда падение напряжения на ней

составляет 30-35 В, переключатель П2 переводится в положение 2. При этом вместо балластного

сопротивления R

в цепь лампы включается регулирующий элемент, состоящий из трех параллельно

соединенных транзисторов П-210. Обратная связь по току осуществляется напряжением, снимаемым

с измерительного сопротивления (R

=0,6 Ом), включенного последовательно с нагрузкой. Установка

тока в цепи лампы осуществляется переменным сопротивлением 2,5 кОм в цепи обратной связи.

Ценной особенностью описанного стабилизатора тока является возможность с помощью

автотрансформатора регулировать напряжение на его входе и таким образом изменять напряжение на

нагрузке от 0 до 100 В и ток в цепи от 5 до 12,5 А. Это дает возможность не только обеспечивать

оптимальный режим питания ртутной дуговой лампы типа ДРШ-250-2, рабочее напряжение которой

к концу срока

службы увеличивается от 32 до 50 В, но и использовать этот источник как для питания

дуговых ламп другого типа (ксеноновых), так и для питания низковольтных галогенных ламп

накаливания высокой яркости типа КГМ (см. Приложение 5).

В качестве промышленного блока питания высокостабильных дуговых ламп типа ДРШ-250-2

и ДКСШ-150, а также галогенных ламп накаливания типа

КГМ-10-90 и КГМ-9-75 может быть

рекомендован универсальный источник питания ИП-16М, разработанный в СКБ БП АН СССР

(Пущино). Относительно небольшие габариты и высокие качественные показатели этого устройства

достигнуты за счет использования двойного импульсного и линейного регулирования.

Упрощенная схема источника питания ИП-16 [364] приведена на рис.1.4, б. Она включает в

себя управляемый

выпрямитель (Д

-Д

) на тиристорах (импульсный регулятор) и компенсационный

транзисторный стабилизатор тока (линейный регулятор). Напряжение с управляемого выпрямителя

через фильтр (Др

и С

) подается в цепь, состоящую из нагрузки R

коллекторной цепи

регулирующего транзистора РТ и эталонного сопротивления R

, падение напряжения на котором

сравнивается с опорным напряжением. Разность опорного напряжения на R

усиливается балансным

каскадом УПТ (Т

и Т

) и воздействует на регулирующий транзистор таким образом, чтобы ток в его

коллекторной цепи оставался постоянным.

Источником опорного напряжения служит термокомпенсированный стабилитрон Д818Е, что

в сочетании с балансным каскадом УПТ, выполненном на высокочастотных транзисторах,

обеспечивает высокую стабильность тока нагрузи.

Напряжение с регулирующего транзистора РТ подается на схему управления [365]

тиристорами (Д

и Д

) выпрямителя, которая, изменяя момент включения тиристоров, поддерживает

напряжение на РТ постоянным (4-5 В) при всех изменениях напряжения в сети и на нагрузке. К

недостаткам этой схемы авторы относят высокий уровень импульсных наводок, связанных с

переключением тиристоров. Однако ввиду малой длительности фронтов влиянием этих наводок в

ряде случаев можно пренебречь.

Блочность конструкции,

легкость замены узлов дают возможность гибкого использования

описанного микроспектрофлуориметра (рис. 1.1) для решения разнообразных задач, связанных не

только с изучением спектров люминесции, но и с регистрацией кинетики изменения люминесценции

одновременно в нескольких спектральных интервалах.

С этой целью в плоскости фокусировки выходного объектива спектрографа устанавливается

2-3 или более выходных щелей постоянной ширины, вырезающих

несколько заранее выбранных

участков спектра шириной 10-15 нм.

Прошедшие через эти щели потоки света определенной длины волны направляются на

фотокатоды соответствующих фотоумножителей. Фотоумножители, регистрирующие интенсивность

люминесценции каждый в своем, определяемом положением щели спектральном интервале,

питаются от одного и того же источника высокого напряжения 30, но имеют раздельные каналы

усиления - согласования 32 на

ЛПУ-01.

Естественно, что в этом случае необходим многоканальный самописец 33. Таким способом

можно получать информацию о быстро протекающих в клетке процессах.

В ряде случаев для учета интенсивности поглощения и рассеяния возбуждающего

люминесценцию излучения, вместо осветителя с лампой накаливания 19 может быть установлен

дополнительный фотоумножитель на УФ-область спектра типа ФЭУ-39

или ФЭУ-71 со своим

блоком усилителя-согласователя 32 (ЛПУ-01). С той же целью учета рассеяния препаратом

возбуждающего люминесценцию излучения может быть использован один из каналов регистрации в

плоскости фокусировки спектра люминесценции.

В частности, может быть выбран диапазон длин волн 650-700 нм, в который попадает

отраженная объектом красная компонента возбуждающего люминесценцию излучения дуговой

лампы 25. Это возможно при условии, что в области 650-700 нм не имеется полос люминесценции

объекта, и поэтому при подборе светофильтров 21 можно не полностью блокировать красную

компоненту. В более общем случае такой опорный канал регистрации может быть выбран в любой,

свободной от полос люминесценции объекта области спектра. Соответственно этому выбирается

узкополосный интерференционный светофильтр для осветителя с лампой накаливания 19. В этом

случае об изменении оптических характеристик объекта судят по интенсивности проходящего через

него светового потока источника 19. Аналогичным образом можно поступать и при регистрации

спектров люминесценции. Регистрируемая при этом узкая полоса проходящего светового потока, не

затрудняя анализа спектральных характеристик, позволяет следить

за изменениями абсорбционных

характеристик объекта.

В качестве довольно простого, но ценного приспособления необходимо упомянуть также

управляемую электромагнитным реле заслонку, устанавливаемую в осветителе 20 на пути

возбуждающего люминесценцию излучения. Это дает возможность резко снизить дозу УФ-

облучения клетки при достаточно длительных измерениях, когда есть опасность, что это облучение

внесет заметные изменения в измеряемый параметр люминесценции объекта.

сущности, описанный микроспектрофлуориметр нельзя назвать прибором. Скорее - это в

значительной мере универсальная установка, в состав которой могут входить дополнительные

устройства, поставляющие информацию о функциональном состоянии исследуемого объекта,

регистрируемую на том же многоканальном самописце синхронно с оптическими характеристиками.

Особую важность при этом имеют такие дополнительные параметры, как потребление кислорода,

изменение рН,

сила натяжения мышцы. В результате установка становится довольно громоздкой,

однако в лабораторных условиях это обычно не имеет существенного значения.

Приведенная установка в течение ряда лет успешно использовалась для описанных в

предыдущих главах спектральных исследований собственной люминесценции нервных, мышечных и

растительных клеток, а также суспензий митохондрий. Она же применялась при изучении

биолюминесценции

и взаимодействия красителей-меток с органоидами клеток и целыми клетками.

Как видно из рис. 1.1 , особенностью установки является то, что осветитель 20, микроскоп и

предметный столик 16 не связаны жестко друг с другом. Это имеет как свои преимущества, так и

свои недостатки.

Основным преимуществом такой системы является то, что вокруг предметного

столика

имеется значительное свободное пространство. Это дает возможность закреплять на предметном

столике мелких животных (лягушка [169, 192], крыса [197]) при исследовании их клеток в

невыделенном из живого организма виде, т. е. in situ. Известно, что при исследованиях

функциональных механизмов живой клетки, т. е., по сути дела, при изучении физиологии клетки,

наиболее трудной для экспериментатора задачей

является обеспечение ей нормальных условий

существования. В случае же исследования клеток in situ вся ответственность за их жизнеобеспечение

возлагается на само подопытное животное, и полученные таким образом данные наиболее полно

отражают суть протекающих в живой клетке процессов. При исследовании in situ клетки более

крупных животных (кролик [198], собака) предметный столик 16 может быть временно удалён из

установки.

Недостатки такой системы очевидны. Это, прежде всего, ее малая жесткость. В результате

проведение морфологических исследований при больших увеличениях затруднено. Отсутствие

фотоаппарата также несколько снижает универсальность.

П1.2. Микроспектрофлуориметр для морфологических исследований

на базе стандартных узлов

Микроспектрофлуориметр для морфологических исследований на базе стандартных

узлов. Отмеченные выше недостатки предыдущей системы во многом устранены в установке,

представляющей собой модификацию базовой модели. Ее основным отличием является то, что

вместо отдельных узлов осветителя, микроскопа и предметного столика (рис. 1.5), использован

люминесцентный микроскоп МЛ-3 [21]. При этом микроскоп МЛ-3 подвергся следующим

конструктивным изменениям

1. Плоская станина заменена полым прямоугольным основанием, в котором размещена

кварцевая поворотная призма 8, позволяющая либо освещать препарат снизу проходящими лучами

источника света с лампой накаливания 9, либо направлять прошедшее через микрообъект

возбуждающее люминесценцию излучение источника света (ДРШ-250) на фотоумножитель (ФЭУ-4)

для регистрации его интенсивности.

2. Единственная «желтая» светоделительная интерференционная пластинка

заменена блоком

из двух сменных пластинок - «желтой» и «синей» (см. рис. 1.2). Это позволяет выбирать наиболее

оптимальные условия возбуждения и регистрации спектров люминесценции объекта. [В новых

выпускаемых ЛОМО микроскопах серии ЛЮМАМ установлены сменные светоделительные

пластинки].

3. В корпусе микроскопа в районе размещения жидкостного теплофильтра выфрезеровано

отверстие и закреплена обойма. Это позволяет на

место теплофильтра устанавливать зеркало 3 под

углом 45° к оптической оси осветительного устройства. Помещаемая в обойму оптическая система

сопрягает с микроскопом выходную щель монохроматора 26 и дает возможность использовать для

возбуждения люминесценции монохроматическое излучение от ксеноновой дуговой лампы 27

мощностью 500 В, питаемой стабилизированным источником тока 29 (рис. 1.5).

4. К изменениям микроскопа можно

отнести также сменный сканирующий предметный

столик. Он представляет собой стандартный предметный столик микроскопа МЛ-3, на котором

жестко закреплены синхронный двигатель и коробка скоростей, приводящие в движение винт

поперечной подачи. Полное перемещение поперечной подачи соответствует одному обороту

прецизионного потенциометра, сигнал с которого подается на ось Х двухкоординатного самописца

22 (рис. 1.5). Это позволяет исследовать распределение интенсивности люминесценции вдоль

выбранного направления микрообъекта, а также изучать микротонкослойные хроматограммы и

электрофореграммы в отраженном и проходящем свете, а также в свете люминесценции [366].

При проведении

этих исследований сканирующий предметный столик устанавливается

взамен стандартного предметного столика МЛ-3 и многожильный кабель управления разъемом

соединяют с системой управления и регистрации.

В остальном эта система (рис. 1.5) по конструкции и применению аналогична предыдущей

(рис. 1.1).

Рис. 1.5. Блок-схема универсального микроспектрофлуориметра для морфологических

исследований.

1 – дуговая ртутная лампа ДРШ-

250-2;

2, 17 – линзы;

3, 14, 16 – зеркала;

4 – блок сменных

светоделительных пластинок;

5 – микрообъектив;

6 – предметный столик;

7 – конденсор;

8 – призма;

9 – лампа накаливания;

10, 19, 20, 21 – фотоумножители;

11 – запирающий светофильтр;

12 – сферическое зеркало с

отверстием 13;

15 – окуляр;

18 – монохроматор;

22 – двухкоординатный самописец;

23 – кулачок;

24 – реохорд;

25 – 6-канальный самописец;

26 – монохроматор возбуждения;

27 – ксеноновая дуговая лампа;

28 – стабилизатор сетевого

напряжения;

29, 30 – стабилизированные источники

питания дуговых ламп;

31 – источник питания ФЭУ.

Использование жесткой системы микроскопа МЛ-3 совместно с зондовой системой ФМЭЛ-2

дает возможность уверенно регистрировать спектры люминесценции участков клетки диаметром до 1

мкм.

П1.3. Малогабаритный инвертированный микроспектрофлуориметр

Малогабаритный инвертированный микроспектрофлуориметр [367]. Обе описанные

выше установки для микроспектрального люминесцентного анализа клеток обладают большим весом

и довольно громоздки. В лабораторных условиях эти обстоятельства не играют существенной роли.

В то же время необходимость поисков объектов исследований, наиболее удобных для решения

проблемы, требует зачастую проведения экспедиционных работ. Особенно важным это бывает при

изучении молекулярной организации функциональных механизмов живой клетки. В этих условиях

компактность прибора, его малый вес и габариты, а следовательно, транспортабельность

приобретают существенное значение.

Блок-схема малогабаритного микроспектрофлуориметра приведена на рис. 1.6. Этот прибор

представляет собой дальнейшую модификацию базовой модели (рис. 1.1). Основное отличие

заключается, прежде всего, в применении инвертированной схемы наблюдения и регистрации

люминесценции. Это создает большие удобства при исследовании люминесценции и

биолюминесценции

клеток мелких морских животных, которых можно в специальной кювете

поместить на предметный столик 20, отпрепарировать с помощью бинокулярной лупы 22 и,

разместив в поле зрения объектива 19 микроспектрофлуориметра необходимый участок клетки,

приступить к его спектральным исследованиям.

Рис. 1.6. Блок-схема инвертированного микроспектрофлуориметра.

1 – призменный монохроматор;

2 – кулачок разверстки спектра;

3 – призма;

4 – окуляр;

5 – поворотная призма;

6 – щелевая диафрагма;

7 – зеркало;

8 – окуляр;

9 – сменная интерференционная

светоделительная пластинка;

10 – запирающий светофильтр;

11, 13 – линзы;

12 – полевая диафрагма;

14 – апертурная диафрагма;

15 – светофильтры;

16 – жидкостный фильтр;

17 – коллектор;

18 – источник света;

19 – микрообъектив;

20 – предметный столик с

препаратом;

21-23 - бинокулярная лупа;

24 – проекционная система

осветителя (11 - 17);

25 – реостат;

26 – электролитический

конденсатор фильтра;

27 – блок питания дуговой лампы4

28 – электронный стабилизатор

сетевого напряжения;

29 – блок питания дуговой лампы;

30 – ЛПУ-0,1;

31 – двухкоординатный самописец;

32 – зеркало;

33 – выходная щель

монохроматора;

34, 35 – компенсация темнового

тока ФЭУ;

36 – ФЭУ.

Остальные изменения по сравнению с базовой моделью (рис. 1.1) носят непринципиальный

конструктивный характер и направлены на увеличение компактности системы. Основу прибора

составляют люминесцентный микроскоп МЛ-3 и монохроматор УМ-2. От микроскопа МЛ-3

используется оптическая система 24 проекции возбуждающего люминесценцию излучения ртутной

дуговой лампы 18 типа ДРШ-250 с модифицированным кожухом, а также револьвер объективов

19,

узел светоделительной пластинки 9 и узел визуального наблюдения 7, 8. При этом ввиду

необходимости оснащения микроспектрофлуориметра дополнительной «синей» светоделительной

пластинкой в стандартном корпусе узла 9 вырезается сквозное фигурное отверстие, в котором на

салазках типа «ласточкин хвост» размещается узел сменных («синей» и «желтой») светоделительных

пластинок.

Применение инвертированной схемы потребовало изменения угла наклона тубуса

визуального наблюдения 8 относительно оптической оси и соответственно изменения угла наклона

зеркала в корпусе блока 7. В плоскости люминесцентного изображения объекта 21 установлена

оптическая щель 6 с изменяемыми как по высоте, так и по ширине размерами. Она является

одновременно как диафрагмой, выделяющей необходимый для исследования участок микрообъекта,

визуально наблюдаемый через тубус

4 при вдвинутой в ход лучей призме 3, так и входной щелью

монохроматора 1 типа УМ-2.

Для уменьшения габаритов монохроматора в его схему дополнительно введены поворотные

призмы 5 и 32. При выведении призмы 5 из хода лучей световой поток поворотным зеркалом

направляется на пленку фотоаппарата, закрепляемого на тубусе для фотографирования выделенного

щелью 6 исследуемого участка микрообъекта.

Изображение спектра люминесценции объекта фокусируется в плоскость выходной щели 33,

непосредственно за которой расположен фотокатод фотоумножителя 36 типа ФЭУ-51. При

изменении угла поворота призмы монохроматора с помощью профилированного для линеаризации

спектра кулачка 2, закрепленного на оси коробки скоростей развертки спектра, изображение спектра

сканируется в плоскости

выходной щели 33 и регистрируется фотоумножителем 36. Сигнал с

выходного сопротивления фотоумножителя 33 через рН-метр 30 типа ЛПУ-01, включенный по

описанной выше схеме, регистрируется по оси Y двухкоординатного самописца 31, по оси Х

регистрируется сигнал угла поворота призмы (длина волны), снимаемый с прецизионного

потенциометра, закрепленного на одном валу с кулачком развертки

спектра 2. Таким образом,

самописец регистрирует спектр люминесценции исследуемого участка микрообъекта.

В состав электрической схемы микроспектрофлуориметра входят также: электронный

стабилизатор сетевого напряжения 28 типа St—200 (Tesla), стабилизированные источники высокого

29 (типа ВС-22) и низкого 27 напряжения, питающие фотоумножитель 36 и ртутную дуговую лампу

18 соответственно.

Следует отметить, что при необходимости дальнейшего уменьшения

габаритов и веса

микроспектрофлуориметра ряд стандартных узлов его электрической схемы (блоки 27, 28, 29, 30)

может быть заменен на более экономичные и малогабаритные устройства собственного

изготовления. Некоторые из примеров узлов такого типа описаны ниже.

П1.4. Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным

светофильтром переменной длины волны

Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным светофильтром

переменной длины волны [368]. Дальнейшее уменьшение габаритов и веса

микроспектрофлуориметра возможно при замене диспергирующего элемента призменного типа на

интерференционный фильтр переменной длины волны. Такого типа микрофлуориметры

использовали в биологических исследованиях [196, 369, 370]. Отличительной особенностью их

является исключительная простота, и потому они заслуживают подробного описания.

Принципиальная схема одной из

модификаций микроспектрофлуориметра с

интерференционным светофильтром переменной длины волны приведена на рис. 1.7. В основу

прибора положен люминесцентный микроскоп типа МЛД (МЛ-3) с некоторыми конструктивными

изменениями. Первым из них является уже описанная выше замена единственной «желтой»

светоделительной пластинки на узел 9 сменных («желтой» и «синей») пластинок. Второе изменение в

конструкции микроскопа заключается

в установке на его станину системы развертки спектра,

состоящей из электродвигателя 30, коробки скоростей 29 и конической передачи 28 с гибкими

валиками привода.

Таким образом, люминесцентный микроскоп работает в обычном стандартном режиме и

позволяет наблюдать люминесценцию объекта 11 через окуляр 14 при введенном в ход лучей зеркале

13. При выведении зеркала 13

из хода лучей люминесцентное изображение микрообъекта

проецируется в плоскость щелевой диафрагмы 16, ограничивающей размеры подлежащего

исследованию участка микрообъекта 11. При введенной в ход лучей поворотной призме 17

изображение объекта и щель 16 рассматриваются с помощью окуляра 18, и изменением

горизонтального и вертикального размера щели 16 окончательно устанавливаются размеры

исследуемого участка.

Перед щелевой диафрагмой 16 на пути светового потока, создающего

люминесцентное изображение микрообъекта, в специальном кожухе установлен линейный

интерференционный светофильтр 15 переменной длины волны. Спектральная характеристика

использованного в данном приборе интерференционного светофильтра переменной длины волны

приведена на рис. 1.8 в виде кривой 1, огибающей зарегистрированные на спектрофотометре

«Shimadzu МРS-50 L» спектры пропускания участков шириной 1 мм, выбираемых вдоль по пластине

фильтра.

В пределах от 400

до 700 нм фильтр обладает удовлетворительной по своей линейности

характеристикой (рис. 1.8, 1) и пропускает 40% падающего на него света. При этом ширина

выделяемого спектрального диапазона составляет на полувысоте 16 нм на 1 мм длины фильтра (рис.

1.8, 2).

Следует особенно отметить наличие вторых гармоник фильтра. Это выражается в том, что,

например, при установке линейки фильтра

в синей области в спектре его пропускания помимо

полосы с максимумом 390 нм (рис. 1.8, 3) имеется дополнительная (и довольно интенсивная) полоса

пропускания в красной (720 нм) области спектра (рис. 1.8, 3'). Соответствующие вторые гармоники

имеются и у других полос пропускания. Например, полоса пропускания 400 нм (рис. 1.8, 4) имеет

вторую гармонику с максимумом 750-760 нм (рис. 1.8, 4').

Такая особенность линейного фильтра

переменной длины волны может привести к грубым ошибкам, если не принять соответствующих мер

по полному устранению красной компоненты из возбуждающего люминесценцию излучения ртутной

дуговой лампы 1 (рис. 1.7). Это обстоятельство вызывает необходимость тщательного контроля при

настройке микроспектрофлуориметра.

Рис. 1.7. Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным

светофильтром переменной длины волны.

–

источник света;

–

коллектор;

–

жидкостный фильтр;

–

светофильтры;

–

апертурная диафрагма;

–

линза;

–

полевая диафрагма;

–

линза;

– сменная светоделительная

пластинка;

– микрообъектив;

– предметный столик с

препаратом;

– запирающие светофильтры;

– зеркало;

– окуляр;

– интерференционный светофильтр

переменной длины волны;

– щелевая диафрагма;

– поворотная призма;

– окуляр;

– фотоумножитель;

– усилитель ЛПУ-0,1;

– двухкоординатный самописец;

– блок питания ФЭУ;

– электронный стабилизатор сетевого

напряжения;

– блок питания источника света;

– проекционная система (2-8);

– реечная передача;

– реохорд;

– коническая передача;

– коробка скоростей;

– двигатель СД-0,9.

Рис. 1.8. Спектральные характеристики

интерференционного фильтра

переменной длины волны. По оси

ординат – пропускание в %; по оси

абсцисс – длина волны в нм.

Таким образом, в описываемом устройстве анализ спектра люминесценции объекта

производится путем перемещения светофильтра переменной длины волны системой развертки

спектра (30, 29, 28) перед щелевой диафрагмой 16. При выведенной из хода лучей поворотной призме

17 пропущенный светофильтром 15 свет люминесценции микрообъекта попадает на фотокатод

фотоумножителя 19 типа ФЭУ-51 и через усилитель-согласователь 20 (

может быть использован рН-

метр ЛПУ-01) подается на ось Y двухкоординатного самописца 21, на ось Х которого снимается

напряжение с линейного потенциометра, пропорциональное длине перемещения светофильтра 15, т.

е. длине волны пропускания. В результате двухкоординатный самописец 21 регистрирует спектр

люминесценции исследуемого участка микрообъекта 11.

В качестве высоковольтного источника 22 питания ФЭУ может

быть использован

стабилизированный выпрямитель ВС-22, в то время как для питания дуговой ртутной лампы 1

применяется сильноточный источник низкого напряжения 24. Вся электрическая схема прибора

подключается к сети через электронный стабилизатор сетевого напряжения 23 типа St-2000. Таким

образом, может быть использована электрическая система питания и регистрации, применявшаяся в

описанных выше микроспектрофлуориметрах.

При необходимости дальнейшего уменьшения габаритов и веса прибора усилитель-

согласователь 20 типа ЛПУ-01 может быть заменен малогабаритным усилителем на полевых

транзисторах, монтируемым непосредственно в кожухе делителя напряжения ФЭУ. Такого типа

усилители постоянного тока могут быть собраны по различным схемам. Возможные варианты

представлены на рис. 1.9 и 1.10.

Рис. 1.9. Принципиальная схема усилителя

с высоким входным сопротивлением.

Рис. 1.10. Принципиальная схема усилителя

с полевым транзистором на входе.

Усилитель постоянного тока (рис. 1.9) представляет собой усилитель с обратной связью,

выполненной на микросхеме К284 УД1В с высоким входным сопротивлением. Резисторы R

-R

служат для установки нуля на выходе усилителя при отсутствии сигнала на входе. На выходе

усилителя включен делитель напряжения R

-R

, позволяющий ступенчато изменять глубину

обратной связи и тем самым - коэффициент усиления сигнала.

Аналогичный описанному выше усилитель может быть выполнен на основе интегральной

микросхемы операционного усилителя К1УТ401А (рис. 1.10). Входной каскад, собранный на

униполярном полевом транзисторе КП1ОЗА по схеме истокового повторителя, служит для

повышения входного сопротивления устройства. Делитель R

-R

создает необходимое смещение на

одном из входов (10) операционного усилителя, на второй вход которого подается сигнал с нагрузки

истокового повторителя R

). Цепочка R

введена для предотвращения самовозбуждения усилителя

на высоких частотах. С выхода усилителя напряжение обратной связи подается через сопротивление

на затвор истокового повторителя. Применение двух независимых источников питания позволяет

существенно снизить дрейф нуля усилителя.

Полное устранение дрейфа нуля возможно, по-видимому, только при переходе на усиление по

переменному току. При этом модуляцию сигнала можно производить различными способами:

периодически прерывая световой поток, модулируя ток ФЭУ или используя вибропреобразователь

для модуляции

выходного тока ФЭУ, как это и осуществляется при использовании ЛПУ-01 в

качестве согласующего усилителя. Помимо этих способов для модуляции выходного сигнала ФЭУ

может быть использован транзисторный прерыватель [371].

Для дальнейшего уменьшения габаритов и веса установки возможна также замена источника

22 высоковольтного питания ФЭУ малогабаритным и экономичным блоком преобразователя, одна из

схем которого

приведена на рис. 1.11.

Особенностью всех описанных выше микроспектрофлуориметров является применение

механической щелевой диафрагмы 16 (рис. 1.7) в плоскости люминесцентного изображения

микрообъекта. Единственным критерием выбора этой системы явилась возможность

самостоятельного изготовления ее в любой механической мастерской, хотя зондовая система с

диафрагмой, представляющей собой свободный от отражающего покрытия участок сферического

зеркала, типа применяемой

в микроскопах МУФ-5 и МУФ-6 [21], несомненно, более удобна в работе.

В этом случае исследователь имеет возможность рассматривать при поиске необходимого участка

микрообъекта все поле зрения. Сейчас, когда налажен серийный выпуск фотоэлектрических насадок

типа ФМЭ-1 и ФМЭЛ-1 [21], представляется возможным применить эту систему при изготовлении

микроспектрофлуориметров.

Рис. 1.11. Принципиальная

схема высоковольтного

преобразователя напряжения

для питания ФЭУ.

Одним из примеров может служить модификация описанного выше экспедиционного

микроспектрофлуориметра (рис. 1.7), в которой механическая щелевая диафрагма 16 заменена

зондовой системой 18 фотоэлектрической насадки типа ФМЭЛ-1. Тогда все устройство остается

неизменным, но становится более удобным в работе. Конечно, узел визуального наблюдения (см.

рис. 1.7, 13, 14) является излишним и может быть удален (вместе

с согласующей линзой ФМЭЛ-1) из

состава микроскопа МЛД (МЛ-3). Однако, имея в виду возможность фотографирования объекта при

снятой зондовой системе, этот узел может быть и сохранен.

В описании экспедиционного микроспектрофлуориметра необходимо отметить возможность

использования при работе с ним унифицированного сканирующего предметного столика.

Эксплуатация этого прибора в экспедиционных установках показала его высокую

надежность.

Сборка и надстройка системы после транспортировки до места назначения производится за 1-2 ч.

П1.5. Бесщелевой микроспектрофлуориметр с фоторегистрацией

Бесщелевой микроспектрофлуориметр с фоторегистрацией. Рассматривая описание

различных конструкций микроспектрофлуориметров, уместно уделить некоторое внимание одной

интересной системе бесщелевого малогабаритного микроспектрофлуориметра. Его оптическая схема

приведена на рис. 1.12. Источник света 1 освещает коллекторную линзу 2. Ограниченный щелевой

диафрагмой 3 равномерно светящийся участок линзы 2 проектируется микрообъективом 6 в