Карнаухов В.Н. Люминесцентный анализ клеток
Подождите немного. Документ загружается.
В.Н. Карнаухов
Люминесцентный анализ
клеток
Пущино 2002
Электронная версия учебного пособия В.Н.Карнаухова «Люминесцентный анализ клеток»
подготовлена в Электронном издательстве «Аналитическая микроскопия» под редакцией проф.
А.Ю.Буданцева (рег. № издательства в Министерстве РФ по делам печати, телерадиовещания и
средств массовой информации Эл №6072 от 4 февраля 2002 г.)
Техническая работа: редактор 1 категории Т.М.Бондарь
Администратор Сервера http://cam.psn.ru : Р.В.Гуркин
© Электронное издательство “Аналитическая микроскопия”
Карнаухов Валерий Николаевич 1939 г.
рождения, окончил Физический факультет Московского
Государственного университета им. М.В.Ломоносова,
кандидат биологических наук, Зам. Директора Института
биофизики клетки РАН (Пущино), заведующий
Лабораторией микроспектрального анализа клеток и
клеточных систем, член Научного совета по биофизике
РАН, член редколлегии журнала «Биофизика», вице-
президент Академии проблем сохранения жизни. Область
научных интересов: биология клетки, аналитическая
микроскопия, спектральный анализ, клеточный мониторинг
окружающей среды. Автор более 400 научных работ, в том
числе 7 монографий.
Карнаухов Николай Иванович
Г.Каунас, 1944
Сергеева (Бобринская)Тамара Александровна
и автор. г. Сталиногорск, 1945
Светлой памяти родителей своих, отца – Карнаухова Николая
Ивановича (
1913-1971) и мамы – Сергеевой Тамары Александровны
(
1916-1987) с любовью и благодарностью посвящаю
От автора…
Об учебном пособии В.Н.Карнаухова “Люминесцентный анализ клеток”
Учебное пособие В.Н.Карнаухова “Люминесцентный анализ клеток” представляет
краткое изложение второй части большой учебной Программы «Спектральный анализ
клеток» (полностью Программа приведена в составе данного пособия) посвященной
Спектральному анализу клеток, внутриклеточных органелл и популяции клеток.
В целом Программа «Спектральный анализ клеток» предназначена для
ознакомления студентов с методами спектрального анализа внутриклеточных органелл,
одиночных клеток и клеточных популяций как в живых, так и в фиксированных препаратах.
Необходимость использования этих методов обусловлена большими достижениями
биохимии в исследованиях выделенных из клеток и тканей физиологически активных
макромолекул. Эти достижения во многом базируются на использовании методов
классического спектрального анализа чистых (нерассеивающих) растворов.
Для дальнейшего движения в понимании принципов функционирования живых клеток,
данные биохимии, полученные методами классического спектрального анализа,
необходимо “привязать” к функционирующим одиночным клеткам, и их популяциям,
используя методы спектрального анализа для изучения таких многокомпонентных и
гетерогенных систем, как клетка.
Эти особенности клетки как объекта спектральных исследований создают
определенные ограничения и особенности и методов регистрации и способов
интерпретации полученных результатов.
В то же время использование методов спектрального анализа клеток представляет
уникальные возможности решения как фундаментальных проблем биологии, так и
прикладных задач в области медицины, биотехнологии и экологии, что иллюстрируется
оригинальными примерами.
В предлагаемом курсе должно быть показано соотношение результатов спектрального
анализа клеток с результатами методов классической биохимии, цитохимии и электронной
микроскопии. Особое внимание уделено задачам, решение которых невозможно без
применения спектрального анализа клеток.
В основу данного учебного пособия легла монография В.Н.Карнаухова
«Люминесцентный спектральный анализ клетки», опубликованная в Серии
«Теоретическая и прикладная биофизика» в Издательстве «Наука», М., в 1978 г. В течение
30 лет книга В.Н.Карнаухова сыграла важную роль в подготовке специалистов в области
клеточной биофизики связанной с использованием микроспектрального анализа клеток.
Мы надеемся, что данное издание учебного пособия будет также необходимо и полезно
для магистрантов, аспирантов и молодых специалистов в их освоении этого важного и
интересного раздела экспериментальной биофизики клетки.
Учебное пособие, посвященное первой части Программы «Спектральный анализ
клеток», в котором будут обсуждены вопросы абсорбционного спектрального анализа
клеток, внутриклеточных органелл и клеточных популяций в настоящее время готовится
автором и будет выпущена в нашем Электронном издательстве.
Январь-декабрь 2002 г. А.Ю.Буданцев
ПРЕДИСЛОВИЕ
Бурное развитие биохимии и молекулярной биологии за последние два десятилетия
выдвинуло на передний план задачу изучения молекулярной организации функциональных
механизмов живой клетки и процессов регуляции, интегрирующих их в единую живую
систему. Именно эти механизмы обеспечивают возможность выполнения плеткой функций:
рост, смену поколений, приспособление к меняющимся условиям среды и к
взаимодействию клеток.
Огромное количество ферментных процессов, протекающих в клетке,
координируется системами регуляции, и потому они строго разграничены не только в
пространстве в специальных структурных элементах клетки (ядро, митохондрии,
эндоплазматический ретикулум, лизосомы, пероксисомы и т. д.), но достаточно четко
распределены также и во времени. Таким образом, число реакций, одновременно
протекающих в том или ином органоиде клетки, не настолько велико, чтобы отказаться от
попыток установить их последовательность и взаимосвязь в живой системе.
Это тем более необходимо, что нарушения в системах регуляции, обеспечивающих
временную и пространственную организацию биохимических реакций в клетке, являются,
по-видимому, причиной различных патологических явлении, включая сердечно-сосудистые
заболевания и рак.
Постановка задачи об изучении внутриклеточной регуляции обмена веществ и
энергии требует, естественно, развития и внедрения в значительной мере новых методов и
новой техники эксперимента. Важнейшими из них являются методы спектрального
анализа, позволяющие изучать физико-химические процессы, протекающие
непосредственно в живой клетке и ее органоидах.
Возможности спектрального анализа связаны, прежде всего, с тем
обстоятельством, что многие молекулы, входящие в состав функциональных механизмов
клетки, обладают весьма характерными спектрами поглощения, а зачастую — и
люминесценции. В ряде случаев эти спектральные характеристики подвергаются
значительным изменениям, отражая те изменения в структуре данной молекулы и ее
окружения, которые служат физико-химической основой биологической функции.
Например, регистрация люминесцентных характеристик таких ключевых компонентов
окислительного метаболизма, как НАД⋅Н и флавопротеины, открывает возможность
тонкого слежения за состоянием энергетического аппарата клетки.
В тех же случаях, когда собственные спектральные характеристики
представляющих интерес компонентов клетки оказываются недостаточно
выразительными, имеется возможность использования специфических красителей-меток.
В их числе оказываются как старые, хорошо известные в люминесцентной микроскопии и
цитохимии флуорохромы-метки нуклеиновых кислот, белков, липидов и др., так и класс
относительно новых меток-флуорохромов, тонко реагирующих на изменение структуры
помеченных ими молекул, входящих в состав полимолекулярных комплексов,
осуществляющих элементарные функции в живой системе.
Все эти вопросы в той или иной мере представлены в соответствующих разделах
данной монографии. Однако при относительно большом объеме ее не может быть сделана
попытка одинаково подробного рассмотрения всех возможных аспектов применения столь
широкого и перспективного по своим возможностям метода, как люминесцентный
спектральный анализ. Поэтому представлялось полезным в каждой главе выделить для
иллюстрации основных положений, методических подходов, проблем и перспектив метода
одну из задач молекулярной физиологии клетки за счет краткого, по необходимости,
рассмотрения остальных.
Реализация широких возможностей метода во многом зависит от наличия
рационально построенных систем регистрации. Поэтому техническому и приборному
обеспечению уделено достаточно большое внимание не только в специальной главе, где
рассматриваются вопросы общего характера, но и в остальных главах, где оказывается
уместным обсудить некоторые технические и методические приемы более узкого
назначения.
Монография не ставит своей задачей описание развития различных идей в
историческом плане, и потому в ней цитированы только те из известных автору работ,
знакомство с которыми, по его мнению, будет полезно читателю в практической
деятельности.
Автор считает приятным долгом выразить глубокую благодарность своим
сотрудникам, участвовавшим в создании описываемой техники и методов
люминесцентного анализа клеток, проводившим ряд различных экспериментов и
помогавшим при оформлении рукописи: В.А. Яшину, В.И. Кулакову, В.В. Дудареву, Е.В.
Мельниковой, В.П. Зинченко, О.Е. Лебедеву, П. П. Марценюку и многим другим, совместная
работа с которыми позволила накопить опыт, предлагаемый вниманию читателя.
В.Н.Карнаухов
Оглавление
Предисловие
Глава 1. Определения и общие закономерности люминесценции
1.1. Физические основы люминесценции
1.2. Возбуждение и измерение интенсивности люминесценции клетки
Глава 2. Собственная люминесценция клеток
2.1. Спектральные характеристики собственной люминесценции клеток
2.2. Функциональная активность клетки и регуляция энергетического
аппарата
Глава 3. Люминесцентные красители. 1. Изучение внутриклеточного обмена веществ
3.1. Двухволновые методы определения соотношения концентрации нуклеиновых
кислот
3.2. Определение соотношений различных веществ в клетке
3.3. Анализ спектральных характеристик
Глава 4. Люминесцентные красители. 2. Исследование динамики функциональной
организации клеточных структур
4.1. Взаимодействие контрактильных белков в процессе мышечного сокращения
4.2. Изучение динамики кальция при функционировании клеток
4.3. Исследование структуры мембраны при генерации потенциала действия
4.4. Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот
ПРИЛОЖЕНИЕ
Приборы и техника люминесцентного спектрального анализа клеток
Введение
Приложение 1
П1. Микроспектрофлуориметры
П1.1. Микроспектрофлуориметр на базе стандартных деталей и узлов
П1.2. Микроспектрофлуориметр для морфологических исследований
на базе стандартных узлов
П1.3. Малогабаритный инвертированный микроспектрофлуориметр
П1.4. Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным
светофильтром переменной длины волны
П1.5. Бесщелевой микроспектрофлуориметр с фоторегистрацией
П1.6. Высокоапертурный бесщелевой спектрофлуориметр
П1.7. Микроспектрофотометр для изучения фосфоресценции клеток
Приложение 2
П2. Микрофлуориметры
П2.1. Трехканальный микрофлуориметр
П2.2. Двухканальный импульсный микрофлуориметр
П2.3. Двухканальные поляризационные микрофлуоримегры
П2.4. Двухканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением
Приложение 3
П3. Приборы и методы автоматического анализа клеточных популяций
Приложение 4
Энергетическая яркость в отдельных линиях ртутных
ламп [мВт/см
2
ср
⋅нм]
Приложение 5
Энергетическая яркость ламп со сплошным спектром и фона
ртутных ламп [362].
Список первоисточников
Приложение 6
Программа курса «СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОК»
Список рекомендуемой литературы
Глава 1. Определения и общие закономерности
люминесценции
1.1. Физические основы люминесценции
В монографии небольшого объема нет ни возможности, ни необходимости подробно
рассматривать физические основы люминесценции, которым посвящены большие разделы солидных
учебников и монографий [1—16]. Однако некоторые сведения общего характера, полезные для
дальнейшего изложения, следует, по-видимому, напомнить.
В стационарных условиях молекула вещества обладает конфигурацией электронных орбит с
наиболее низкой из возможных потенциальной энергией
и находится, как принято говорить, в
основном, состоянии. Тепловое движение приводит к колебаниям атомов внутри молекулы и
вращению ее как целого, что сопровождается флуктуациями потенциальной энергии основного
состояния. Для иллюстрации удобно воспользоваться примером двухатомной молекулы,
допускающей еще двухмерное изображение (рис.1). Низший энергетический уровень или основное
состояние описывается кривой S
o
, на которой горизонтальными линиями схематически показаны
энергетические подуровни, соответствующие разным колебательным состояниям молекулы в
основном состоянии (S
o
) ее электронной орбиты.
Рис. 1. Зависимость потенциальной
энергии двухатомной молекулы от
расстояния между атомами для
разных энергетических уровней
.
Если теперь молекула сможет получить извне дополнительную порцию энергии, то она
переходит в состояние с избытком потенциальной энергии и оказывается, как принято говорить, в
возбужденном состоянии. Это состояние является неустойчивым, и через некоторое время (10
-8
с),
отдав тем или иным способом избыточную энергию, система возвращается в исходное основное
состояние. Излучение света молекулой вещества при переходе ее из возбужденного состояния в
основное называется люминесценцией.
Хотя с теоретической точки зрения способ передачи молекуле дополнительной энергии и
перевод ее в возбужденное состояние не имеет особого значения, на практике
по этому признаку
различают фотолюминесценцию (возбуждение световым излучением), рентгенолюминесценцию
(возбуждение рентгеновыми лучами), катодолюминесценцию (возбуждение пучком ускоренных
электронов) и т. д. Несколько особняком стоят химические способы возбуждения. Различают
хемилюминесценцию, характеризующуюся тем, что молекула оказывается в возбужденном состоянии
в результате экзотермической химической реакции. Частным случаем хемилюминесценции является
биолюминесценция, наблюдаемая в живой
природе. Возможен также случай, когда возбуждение
молекулы (А) происходит в результате безызлучательного переноса электронного возбуждения от
другой предварительно возбужденной молекулы-донора (D):
D* + A
→
D + A*
Излучение молекулы-акцептора (A*) в этом случае называется сенсибилизированной
люминесценцией.
Возвращаясь к рассмотрению основных закономерностей явления люминесценции, следует,
прежде всего, отметить, что поступающая извне избыточная энергия возбуждения может быть
поглощена молекулой с переходом в возбужденное состояние только в том случае, если ее величина
равна разнице энергий основного (S
o
) и одного из возбужденных состояний данной молекулы. В
частном случае фотолюминесценции, приведенном на рис.1, это означает, что для перехода
молекулы с основного уровня S
o
на первый возбужденный уровень S
1
(с разницей энергии
Δ
E
1
необходим квант света с такой же энергией:
Δ
E
1
= h
ν
1
(1),
где h — постоянная Планка, равная 6,62⋅10
-27
эрг⋅с,
ν
- частота электромагнитных колебаний света (с
-
1
). Или, учитывая, что
ν
=c/
λ
, (2),
где с — скорость света в вакууме, а
λ
— длина волны возбуждающего излучения,
Δ
E
1
= hc/
λ
1
(3).
При соблюдении этих условий молекула может поглотить квант света и за время, равное
периоду световых колебаний (10
-15
с), переходит из основного состояния S
o
в возбужденное
состояние S
1
как это показано вертикальной стрелкой «Возбуждение» на рис.1. Ввиду того, что за
столь малый отрезок времени (10
-15
с) расстояние между составляющими молекулу атомами не
успевает существенно измениться, согласно принципу Франка - Кондона, молекула оказывается на
одном из высших колебательных подуровней возбужденного состояния S
1
и требуется определенное
время для рассеяния соответствующей порции энергии
Δ
E
k 1
, чтобы молекула оказалась в низшей
точке энергетической кривой S
1
. Как уже упоминалось выше, возбужденное состояние молекулы S
1
является нестабильным, и через некоторое время (t
≈
10
-8
с) она возвращается в исходное основное
состояние S
o
, излучая избыточную энергию
Δ
E
2
в виде кванта света с длиной волны
λ
2
, определяемой
уравнением
Δ
E
2
= hc/
λ
2
. При возвращении молекулы в основное состояние она вновь оказывается, в
соответствии с принципом Франка - Кондона, на одном из высших колебательных подуровней
основного состояния и рассеивает порцию энергии
Δ
E
kо
, чтобы оказаться в низшей точке
энергетической кривой S
o
.
Таким образом, излучаемая в виде кванта света энергия
Δ
E
2
оказывается меньше
поглощенной при возбуждении энергии
Δ
E
1
на величину
Δ
E
k 1
+
Δ
E
k2
и в соответствии с уравнением
(3) длина волны излучения
λ
2
оказывается больше длины волны возбуждающего кванта
λ
1
. Это
характерное для люминесценции соотношение лежит в основе установленного эмпирическим путем
закона Стокса. Существуют, однако, случаи, когда за счет внутреннего перераспределения энергии
длина волны люминесценции оказывается меньше длины волны возбуждающего кванта. Эта
разновидность носит название антистоксовой люминесценции.
Рассмотренные переходы между основным S
o
и возбужденным S
1
состояниями
характеризуются одной весьма важной особенностью, а именно - неизменностью состояния спинов
электронов в молекуле. Обычно молекулы в основном состоянии содержат четное число электронов
со «спаренными» спинами, т.е. число электронов со спином s = + ½ равно числу электронов со
спином s = - ½, и, следовательно, суммарный спин S всех электронов молекулы равен 0. В результате
мультиплетность молекулы
М = 2S + 1, где S — суммарный спин молекулы, оказывается равной 1,
или, как говорят, молекула находится в синглетном состоянии.
Наиболее вероятными энергетическими переходами являются переходы без изменения
мультиплетности, т. е. cинглет → синглетный (S
o
→ S
1
) переход при поглощении кванта возбуждения
и обратный переход S
1
→ S
o
при дезактивации молекулы. Этот тип люминесценции называется
флуоресценцией.
Может, однако, оказаться, что в результате некоторого внутреннего энергетического перехода
спин одного из электронов молекулы изменит знак и в ее составе появятся два неспаренных
электрона. Тогда суммарный спин молекулы S
1
= ½+ ½ = 1 и мультиплетность М == 2S + 1 = 3. Такое
состояние молекулы принято называть триплетным.
Внутренняя потенциальная энергия первого триплетного состояния (кривая Т) ниже энергии
первого синглетного состояния (S
1
), и поэтому доля энергии
Δ
E
3
, излучаемой в виде света при
переходе молекулы из возбужденного триплетного состояния (T
1
) в основное синглетное состояние
(S
o
), ощутимо уменьшается, а длина волны излучаемого при этом света (см. уравнение 3)
увеличивается по сравнению с флуоресцентньм переходом S
1
→ S
o
(
Δ
E
2
). Этот тип люминесценции
(триплет-синглетный переход) называется фосфоресценцией.
Помимо большей длины волны излучаемого света фосфоресценция отличается от
флуоресценции и большим временем жизни молекулы в возбужденном состоянии. Это связано с тем
обстоятельством, что переходы между энергетическими уровнями с изменением мультиплетности
являются «запрещенными», т. е. вероятность их очень мала. Ввиду большой длительности времени
жизни возбужденной
молекулы в триплетном состоянии (T
1
) появляется вероятность того, что за
счет поглощения тепловой энергии она может возвратиться на возбужденный синглетный уровень S
1
и уже с него перейти на основной уровень S
o
, излучая квант света. Поскольку разница энергий в этом
случае составляет
Δ
E
2
, длина волны излучения остается такой же, как и в обычном случае
флуоресценции, и только время жизни возбужденного состояния оказывается большим (за счет
пребывания на триплетном уровне T
1
), и этот тип флуоресценции называется замедленной
флуоресценцией.
Из изложенного выше становится ясной принципиальная значимость такого параметра
люминесценции, как время жизни молекулы в возбужденном состоянии. Для определения этого
параметра существуют различные способы, наиболее прямой из которых состоит в том, что после
прекращения возбуждения интенсивность люминесценции уменьшается по закону
I = I
o
e
-t/
τ
(4),
где I —интенсивность люминесценции в момент времени t после прекращения возбуждения; I
o
-
интенсивность люминесценции до прекращения возбуждения; τ - среднее время жизни
возбужденного состояния.
Из выражения (4) следует, что величина τ представляет собой время, за которое
интенсивность люминесценции уменьшится до 1/е от исходного значения.
Даже из весьма поверхностного рассмотрения ясно, что флуоресценция и фосфоресценция
значительно различаются по своей внутренней природе и, как следствие,
по своим закономерностям.
Поэтому нежелательно употребление этих терминов без точного установления природы излучения; и
более правильным в случаях, когда нет полной уверенности в том, является ли изучаемое свечение
флуоресценцией или фосфоресценцией, является употребление термина люминесценция.
При этом необходимо отметить, что, хотя, как это упоминалось выше, фосфоресценция в
растворах имеет обычно
значительно большее время жизни возбужденного состояния τ, знание этого
параметра может оказаться недостаточным при изучении люминесценции клеточных структур, так
как он отражает только наличие «запрета» на триплет-синглетный переход в растворе. В
специальным образом упорядоченной среде клеточных структур стерические взаимодействия
люминесцирующей молекулы со средой могут, по-видимому, приводить к снятию запрета
и
значительному уменьшению времени жизни фосфоресценции, делая ее мало различимой по этому
параметру от флуоресценции. Лабильность же биологических структур в процессе их
функциональных перестроек может приводить к вариабельности τ фосфоресцирующей молекулы, и
это следует иметь в виду.
Одним из важнейших параметров люминесценции молекулы является ее квантовый выход k,
определяемый как
отношение числа квантов люминесценции (n
л
) к числу поглощенных за то же
время молекулой квантов возбуждающего излучения (n
п
):
k = n
л
/n
п
(5),
При отсутствии каких-либо процессов, кроме люминесценции, число поглощенных квантов
равно числу квантов люминесценции и k = 1. Однако молекула может вернуться из возбужденного
состояния не только путем излучения избыточной энергии в виде света. Возможны такие процессы,
как передача энергии возбуждения другой молекуле, фотохимическая реакция, рассеяние энергии в
виде тепла
при участии окружающей среды и т. д. Все эти процессы приводят к тому, что доля
молекул, дезактивация которых происходит за счет люминесценции, уменьшается, а может и вообще
стать близкой к нулю.
Следует иметь в виду, что молекула люминесцирующего вещества, взаимодействуя со
специфически организованными биологическими макромолекулами и их комплексами, может резко
менять свой квантовый выход как в сторону уменьшения (например, за счет миграции энергии
возбуждения), так и в сторону увеличения. Например, краситель аурамин 00, практически не
люминесцирующий в растворе ввиду исключительной способности к рассеянию энергии
безызлучательным путем за счет большой подвижности частей своей молекулы, после
взаимодействия с белком приобретает жесткость молекулярной структуры и
как следствие - высокий
квантовый выход.
1.2. Возбуждение и измерение интенсивности
люминесценции клеток
Как было упомянуто выше, один из основных способов возбуждения люминесценции состоит
в использовании квантов света с более короткой, чем у люминесцентного излучения, длиной волны.
При этом существуют различные способы возбуждения люминесценции микрообъекта для
последующего микроскопического изучения его. Простейший способ представлен на рис. 2, I и
заключается в том, что из суммарного светового
потока источника (1), сформированного
коллекторной линзой (2), узкополосным фильтром (3) вырезается необходимое для возбуждения
излучение, лежащее в узком спектральном интервале. Это излучение конденсором (4) фокусируется
на микрообъект (5) и возбуждает его люминесценцию. Свет люминесценции объекта (5) и
прошедшее через объект возбуждающее излучение (на 2-3 порядка более интенсивное, чем
люминесценция) собирается микрообъективом (6),
формирующим изображение микрообъекта в
фокальной плоскости окуляра (8), Расположенный между микрообъективом (6) и окуляром (8)
запирающий светофильтр (7) предназначен для полного устранения прошедшего через микрообъект
(5) возбуждающего излучения, что дает возможность рассматривать через окуляр (8) изображение
микрообъекта в свете его люминесценции.
Рис. 2. Способы возбуждения и
регистрации люминесценции
микрообъекта:
I – наблюдение в проходящем свете;
II – система с темнопольным пораболоид-
конденсором;
III – освещение по методу темного поля с
кардиоид-кон
денсором.
Недостатки этого способа, называемого возбуждением люминесценции в проходящем свете,
очевидны. Во-первых, наиболее ярко люминесцируют нижние слои микрообъекта, в то время как
наиболее удобны для наблюдения верхние слои, т.е. способ применим только для достаточно тонких
срезов. Вторая особенность, хотя и не носит принципиального характера, тем не менее накладывает
серьезные
ограничения на применение этого метода и состоит в трудности отделения проходящего
через объект интенсивного возбуждающего излучения.
Именно с целью отделения возбуждающего излучения от люминесценции объекта и были
разработаны системы темнопольного возбуждения с применением параболоидных (рис. 2, II) и
кардиоидных. (рис. 2, III) конденсоров. Как видно из приведенных на рис. 2 схем, прямое
возбуждающее излучение в этих
случаях не попадает в микрообъектив (6), а рассеянное
микрообъектом (5) возбуждающее излучение малой интенсивности достаточно легко устраняется
запирающим светофильтром (7). К числу недостатков этих схем относится малая толщина
микрообъекта и определенные ограничения на возможность использования высокоапертурных
конденсоров и микрообъективов, что снижает яркость люминесценции объекта, хотя при работе с
тонкими флуорохромированными
срезами и микрообъектами они позволяют получить хорошие
результаты.
Необходимость исследования толстых образцов, а тем более клеток in situ (т.е. лежащих на
поверхности органа, не выделенного из организма живого животного), привела к разработке схем
фронтального возбуждения падающим на объект излучением (рис. 3).
Применение с этой целью эпиобъективов (рис. 3, I), хотя и позволяет решить поставленную
задачу исследования толстых препаратов, однако, достигается это достаточно дорогой ценой -
уменьшением апертур как осветителя конденсора (4), так и микрообъектива (6), что приводит к
значительному снижению яркости люминесценции микрообъекта.