Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы 553

мером в 14 остатков, образуемая дисульфидной связью, по-види-

мому, гомологична участку 65—79 в КПА [148, 152]. Если это так,

то лиганды у цинка — His и Giu, занимающие в КПА положения

69 и 72,—сохраняются и в КПВ. Более того, остатки 66 и 79 в

КПА, которые гомологичны остаткам цистеина, образующим упо-

мянутую петлю в КПВ, расположены поблизости друг от друга.

В активном центре этих белков есть еще одна гомологичная после-

250 255

КПА: Thr-Ile-Tyr-Gln-Ala-Ser-Gly-Gly-Ser-Ile-Asp-Trp

КПБ: Thr-I Ie-Tyr-Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Ser-Asp-Asp-Trp

Рис. 15.14. Гомологичные аминокислотные последовательности в активных цент-

рах карбоксипептидаз А и В быка.

довательность. Под действием афинного реагента 4-бромацетил-

амидобутилгуанидина, в активном центре КПВ модифицируется

остаток тирозина [155]. Сравнение обнаруживает высокую степень

гомологичности последовательностей около этой аминокислоты и

Туг-248 в КПА, как показано на рис. 15.14 [153]. С другой сторо-

ны, гомологичность последовательностей у С-конца (14 остатков)

выражена слабее.

Известна последовательность еще одного участка КПВ, содер-

жащего сульфгидрильную группу [156]. Единственный остаток ци-

стеина в КПВ алкилируется иодацетамидом в отсутствие восста-

навливающих агентов при условии, если удален цинк. Таким об-

разом, для КПВ химические данные более определенно указывают

на то, что цистеин служит лигандом цинка. Однако последователь-

ность [157] вокруг этого остатка цистеина гомологична последова-

тельности КПА не в районе третьего лиганда цинка (His-196), а

в начале спирального участка у С-конца. Остаток цистеина соот-

ветствует остатку А1а-290, а-углеродный атом которого удален от

атома цинка на 11 А. Если считать, что химические данные до-

казывают участие цистеина в связывании металла, то возникает

следующая дилемма: или две высокогомологичные последователь-

ности расположены в двух белках в разных положениях, или их

третичные структуры не одинаковы. Объяснение противоречия мо-

жет заключаться в том, что остаток цистеина, как и А1а-290,

спрятан внутри молекулы и вступает в реакцию только после не-

которого ее разворачивания, вызываемого удалением цинка. Ско-

рее всего, цистеин не является лигандом цинка, однако обращение

к истории установления природы лигандов металла в КПА (разд.

3.3.2) показывает, что разумнее отложить этот вопрос до установ-

ления полной первичной структуры КПВ и сравнения третичных

структур прямыми методами.

554

Г лава

4.2. Другие карбоксипептидазы

и прокарбоксипептидазы

Ферменты с карбоксипептидазной активностью выделены из ря-

да источников [21, 158]. Некоторые из них, как, например, фер-

менты свиньи [19, 141] и колючей акулы, обитающей в Тихом оке-

ане [159, 160], по специфичности очень похожи на карбоксипепти-

дазы быка [21], тогда как другие отличаются от них. Фермент из

Pseudomonas, названный карбоксипептидазой G, быстро отщепля-

ет глутамат от С-конца пептидов [161, 162]. Все вышеупомянутые

карбоксипептидазы содержат цинк [21] или по крайней мере нуж-

даются в нем для проявления активности [161]. Модификация ти-

розина в некоторых из них влияет на активность [21]. Молеку-

лярные массы в тех случаях, когда они определены, близки к

35 000 [21]. Размер же молекул проферментов очень зависит от

источника. Так, про-КПА свиньи и акулы представляют собой мо-

номеры молекулярной массы чуть больше 40 000 [19, 159], что

соответствует размеру субъединицы I про-КПА быка [11]. Другие

карбоксипептидазы как бактериального [163], так и растительно-

го [164, 165] происхождения также частично охарактеризованы.

Некоторые из них не ингибируются хелатирующими агентами

[165], тогда как остальные предположительно являются металло-

ферментами [163].

Центры связывания металла и субстрата обнаружены в

про-КПА быка [114, 166]. При выделении этот белок сохраняет

около 1 моля цинка. Однако комплексометрическое титрование

про-КПА обнаруживает существенные различия между центрами

присоединения металла в КПА и про-КПА. Стерические требова-

ния для связывания субстрата двумя белками также неодинаковы

[166]. Активация прокарбоксипептидаз интенсивно изучалась, и

библиографию по этому вопросу можно найти в нескольких недав-

но опубликованных работах [21, 167, 168].

4.3. Лейцинаминопептидаза

Лейцинаминопептидаза (ЛАП) является экзопептидазой, от-

щепляющей аминокислоты от N-конца пептидной цепи. Субстра-

тами могут служить только пептиды, оканчивающиеся !.-аминокис-

лотами со свободной NH

-Tpynnoft. Следующая аминокислота может

иметь D-конфигурацию [32, 164]. N-Ацетилпептиды не гидролизу-

ются. Название фермента связано с тем, что пептиды, имеющие на

N-конце лейцин, и их аналоги, удобные для измерения активности,

такие, как лейцил-и-нитроанилид, гидролизуются быстрее всего.

Однако специфичность ЛАП очень низка. Сообщалось, что субст-

ратами могут быть даже ь-лизинамид и ь-пролинамид, причем ак-

тивность по последнему соединению составляет

% активности по

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

555

лейцинамиду [169, 170]. Эфирные аналоги, такие, как н-бутил-ь-

лейцинат [169], гидролизуются медленно [171]. р-Аланинамид в

отличие от лейцил-р-аланинамида не является субстратом [170].

Систематических определений /См и &кат не производилось, поэто-

му неизвестно, в какой степени специфичность определяется проч-

ностью фермент-субстратных комплексов. Исследование серии пеп-

тидов с D- иь-аланином на конце показало, что активный центр

ЛАП, по-видимому, может взаимодействовать по крайней мере с

четырьмя остатками субстрата [32].

Самым доступным источником ЛАП служат почки свиньи [172].

Молекулярная масса этого фермента больше молекулярной массы,

карбоксипептидазы и составляет 200 000 [172, 173]. Описан также

препарат из хрусталика быка [174, 175]. Детальное изучение ЛАП

затруднено неустойчивостью фермента при выделении, присутстви-

ем сопутствующих эндопептидаз [176, 177] и существованием мно-

жественных молекулярных форм [173, 178]. Ионы Mn

+ и Mg

стабилизируют и активируют белок, вследствие чего выделение

обычно проводят в присутствии одного из этих металлов, чаще все-

го Mg

+. Зависимость степени активации ЛАП от концентрации

+ [170] хорошо описывается кривой связывания при п=

(чис-

ло катионов на молекулу) и /C

= 3,3• 10

-1

. На основании этих

данных и ингибирующего действия цитрата и ЭДТА ЛАП была

недавно отнесена к Mg(Mn)-активируемым или Mg (Mn)-содержа-

щим металлоферментам, хотя данные о наличии в ней этих метал-

лов отсутствуют.

Модификация [173] метода выделения ЛАП из почек свиньи

позволяет получить активный фермент, содержащий 4—6 молей

цинка в расчете на молекулярную массу 300 000, и очень малые

количества других металлов [180]. ЛАП, выделенная этим мето-

дом, устойчива в отсутствие Mg

+, однако этот ион необходим во

время очистки. Таким образом, ЛАП, по-видимому, представляет

собой металлофермент. Ингибирование о-фенантролином и бипи-

ридилом и отсутствие ингибирования фторидом и ЭДТА подтверж-

дают это предположение [180]. Пока не удалось получить свобод-

ную от металла форму фермента, способную к реактивации,

однако некоторые ионы, например Ca

+, замещают цинк с одно-

временным изменением активности. Интересно, что замена немно-

гим более половины цинка на Mn

+ приводит к видимому увели-

чению активности по отношению к лейцил-я-нитроанилиду. Дан-

ные [170] по влиянию на активность ионов некоторых других

металлов, включая Cd

+, Со

+ и Ni

+, нуждаются в пересмотре.

Согласно предложенным схемам гидролиза, незаряженная ами-

ногруппа субстрата связывает ион металла (Mg

+ или Mn

+) [129,

170, 181]. Химическая информация об активном центре почти от-

сутствует. Известно только, что гидрофобные соединения являются

очень сильными ингибиторами [170]. Судя по этому, а также по

556

Г лава

субстратной специфичности, активный центр имеет гидрофобную

природу. Число активных центров в молекуле неизвестно [175].

По-видимому, ЛАП может быть хорошим объектом для изучения

взаимодействий металла с субстратом методами ЯМР. Транспеп-

тидазная активность у ЛАП отсутствует [182], что следует учиты-

вать при создании гипотетических механизмов ее действия.

4.4. Некоторые другие металлсодержащие протеиназы

Наряду с сериновыми, сульфгидрильными и кислыми протеина-

зами металлопептидазы составляют отдельный большой класс про-

теолитических ферментов [183]. Существуют списки пептидаз, тре-

бующих для своей активности присутствия цинка, кобальта пли

марганца [181, 184]. Хотя многие из известных металлопептидаз

являются экзопептидазами или дипептидазами, из этого правила

есть исключения. Недавно было показано, что две эндопептнда-

зы — термолизин [185] и нейтральная протеаза В. subtilis [186] —

содержат цинк. Ионы Ca

+ стабилизируют оба эти фермента. Их

молекулярная масса составляет 35 000—40 000 [186, 187]. Термо-

лизин гидролизует лучше всего пептидные связи, образованные

аминогруппами гидрофобных аминокислот [44, 188—190]. Похо-

жей специфичностью обладает протеаза В. subtilis [186], хотя для

этого фермента трудно получить удобные низкомолекулярные суб-

страты [191]. Нет сомнений в том, что другие бактериальные про-

теиназы окажутся металлоферментами [185]. По мере увеличения

числа хорошо охарактеризованных металлопептидаз будет получен

ответ на интересный вопрос о том, в какой степени механизмы ка-

тализа являются для них общими.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Reeke U. N., Hartsuek J. A., Ludwig М. L., Quioeho F. A., Steitz Т. А.,

Lipscomb W. N., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 58, 2220 (1967).

2. Lipscomb W. N., Hartsuck J. A., Reeke G. N., Quiocho F. A. et al., Brookhaven

Symp. Biol., 21, 24 (1968).

3. Lipscomb W. N., Reeke G. N., Hartsuck J. A., Quiocho F. A., Bethge P. H.,

Phil. Trans. R. Soc., B257, 177 (1970).

4. Bradshaw R. A., Ericsson L. H., Walsh K. A., Neurath H., Proc. Natn. Acad.

Sci. U. S., 63, 1389 (1969).

5. Dennard A. E., Williams R. J. P., Transition Metal Chemistry. A Series of

Advances, Vol. 2, Marcel Dekker, New York, 1966, p. 115.

6. Shulman R. G., Navon G., Wyluda B. J., Douglass D. C., Yamane T., Proc.

Natn. Acad. Sci. U. S., 56, 39 (1966).

7. Auld D. S., Federation Proc., 28, 346 (1969).

8. Latt S. A., Auld D. S., Vallee B. L., Federation Proc., 29, 666 (1970).

9. Ludwig M. L., Hartsuck J. A., Steitz T. A., Muirhead H., et al., Proc. Natn.

Acad. Sci. U. S., 57, 511 (1967).

10. Yamasaki M., Brown J. R., Cox D. I., Greenshields R. N., Wade R. D., Neu-

rath Ii., Biochemistry, 2, 859 (1963).

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

557

11. Freisheim L H., Walsh К. A., Neurath H., Biochemistry, 6, ЗОЮ (1967).

12. Anson М. L., J. Gen. Phisiol., 20, 663 (1937).

13. Allan В. J., Keller P. J.. Neurath H.. Biochemsitry

3, 40 (1964).

14. Сох D. L, Bovard F. С., Bargetzi J. P., Walsh К A., Neurath H., Biochemistry,

3, 44 (1964).

15. Vallee В. L., Neurath H., J. Biol. Chem., 217, 253 (1955).

16. Thompson Е. О. P., Biochim. Biophys. Acta, 10, 633 (1953).

17. Petra P. H., Neurath H., Biochemistry, 8, 2466 (1969).

18. Petra P. H., Neurath H., Biochemistry, 8, 5029 (1969).

19. Folk J. E., Schirmer Е. W., J. Biol. Chem., 238, 3884 (1963).

20. Sampath Kumar К• S. V., Clegg J. В., Walsh К. A., Biochemistry, 3, 1728

(1964).

21. Neurath H., Bradshaw R. A., Petra P. H., Walsh K A., Phil. Trans. R. Soc.,

B257, 159 (1970).

22. Lipscomb W. N., Hartsuck J. A., Quiocho P. A., Reeke G. N., Proc. Natn. Acad.

Sci. U. S., 64, 28 (1969).

23. Petra P. H., Bradshaw R. A., Walsh K. A., Neurath H., Biochemistry, 8, 2762

(1969).

24. Vallee B. L., Coombs T. L., Hoch F. L., J. Biol. Chem., 235, PC45 (1960).

25. Schechter I., Eur. J. Biochem., 14, 516 (1970).

26. Neurath H., Schwert G. W., Chem. Rev., 46, 69 (1950).

27. Smith E. L., Adv. Enzymol., 12, 191 (1951).

28. McClure W. O., Neurath H., Walsh K. A., Biochemistry, 3, 1897 (1964).

29. Bender M. L., Whitaker J. R., Menger F., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 53, 711

(1965).

30. Ambler R. P., in S. P. Colowick, N. O. Kaplan (eds.), Methods in Enzymolo-

gy, Vol. 11, Academic Press, New York, 1967, p. 436.

31. Abramowitz N., Schechter I., Berger A., Biochem. Biophys. Res. Comrnun., 29,

862 (1967).

32. Schechter I., Berger A., Biochemistry, 5, 3371 (1966).

33. Yanari S., Mitz M. A., J. Am. Chem. Soc., 79, 1150 (1957).

34. Smith E. L., Hanson H. T., J. Biol. Chem., 179, 802 (1949).

35. Vallee B. L., Neurath H., J. Am. Chem. Soc., 76, 5006 (1954).

36. Coombs T. L., Felber J. P., Vallee B. L., Biochemistry, 1, 899 (1962).

37. Felber J. P., Coombs T. L., Vallee B. L., Biochemistry, 1, 231 (1962).

38. Vallee B. L., Rupley J. A., Coombs T. L., Neurath H., J. Am. Chem. Soc., 80,

4750 (1958).

39. Vallee B. L., Rupley J. A., Coombs T. L., Neurath H., J. Biol. Chem., 235, 64

(1960).

40. Coleman J. E., Vallee B. L., J. Biol. Chem., 235, 390 (1960).

41. Colleman J. E., Vallee B. L., J. Biol. Chem., 236, 2244 (1961).

42. Nomoto M., Srinivasan N. G., Bradshaw R. A., Wade R. D., Neurath H.. Bio-

chemistry, 8, 2755 (1969).

43. Bradshaw R. A., Babin D. R., Nomoto M., Srinivasin N. G., et al., Biochemistry,

8, 3859 (1969).

44. Bradshaw R. A., Biochemistry, 8, 3871 (1969).

45. Putnam F. W., Neurath H., J. Biol. Chem., 166, 603 (1946).

46. Lipscomb W. N., Coppola J. C., Hartsuch J. A., Ludwig M. L. et al., J. Mol.

Biol., 19, 423 (1966).

47. Diamond R., Acta Cryst., 21, 253 (1966).

48. Ramachandran G. N., Ramakrishnan C., Sasisekharan V., J. Mol. Biol., 7 95

(1963).

49. Edsall J. T., Flory P. J., Kendrew J. C., Liquori A. M. et al, J. Biol. Chem.,

241, 1004 (1966).

50. Pauling L., Corey R. B., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 37, 251, 729 (1951).

51. Blake C. C. F., Mair G. A., North А. С. T., Phillips D. C., Sarma V. R.,

Proc. R. Soc., B167, 365 (1967).

558

Г лава

52. Hartsuck J. A., Lipscomb W. N., in Boyer P. D. (ed.), The Enzymes, 3rd edn.,

Vol. Ill, Academic Press, New York, 1971, p. 1.

53. Van der Helm D., Nicolas H., Acta Cryst., 26B, 1858 (1970).

54. Kretsinger R. H., Cotton F. A., Bryan R. F., Acta Cryst., 16, 651 (1963).

55. Harding M. Af., Cole 5. J., Acta Cryst., 16, 643 (1963).

56. Yanari 5., Mitz M. A., J. Am. Chem. Soc., 79, 1154 (1957).

•57. Kauzmann W., Adv. Protein Chem., 14, 1 (1959).

58. Дженке В., Катализ в химии и энзимологии, «Мир», M., 1972.

.59. Eyring H., Lumry R., Spikes J. D., in W. D. McElroy

В. Glass, (eds.), The

Mechanism of Enzyme Action, Johns Hopkins, Baltimore, 1954, p. 123.

60. Lumry R., in P. D. Boyer, H. Lardy, K. Myrback (eds.), The Enzymes, 2nd

edn., Vol. 1, Academic Press, New York, 1959, p. 157.

61. Pauling L., Am. Scient., 36, 51 (1948).

62. Jencks W. P., in N. 0. Kaplan, E. P. Kennedy (eds.), Current Aspects of Bio-

chemical Energetics, Academic Press, New York 1966, p. 273.

63. Koshland D. E., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 44, 98 (1958).

64. Koshland D. E., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 28, 473 (1963).

65. Quiocho F. A., Bethge P. H., Lipscomb W. N., Studebaker J. F. et al„ Cold

Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 36, 561 (1971).

66. Snoke J. E., Neurath H., J. Biol. Chem., 181, 789 (1949).

67. Hanson H. T., Smith E. L., J. Biol. Chem., 175, 833 (1948).

68. Smith E. L., J. Biol. Chem., 175, 39 (1948).

69. Stahmann M. A., Fruton J. S., Bergman J., J. Biol. Chem., 164, 753 (1946).

70. Steitz T. A., Ludwig M. L., Quiocho F. A., Lipscomb W. N., J. Biol., Chem., 242,

4662 (1967).

71. Navon G., Shulman R. G., Wyluda B. /., Yamane T., Proc. Natn. Acad. Sci.

U. S., 60, 86 (1968).

72. Navon G., Shulman R. G., Wyluda B. J., Yamane T., J. Mol. Biol., 51, 15

(1970).

73. Bishop W. H., Quiocho F. A., Richards F. M., Biochemistry, 5, 4077 (1966).

74. Brill A. S., Kirkpatrick P. R., Scholes C. P., Venable J. H., Jr., Proc. Fourth

Johnson Foundation Colloq., University of Pennsylvania, 1969, Academic Press,

New York, 1970.

75. Snoke J. E., Schwert G. W., Neurath H., J. Biol. Chem., 175, 7 (1948).

76. Auld D. 5., Vallee B. L., Biochemistry, 9, 602 (1970).

77. Kaiser E. T., Awazu S., Carson F. W., Biochem. Biophys. Res. Commun., 21,

444 (1964).

78. Whitaker J. R., Menger F., Bender M. L., Biochemistry, 5, 386 (1966).

79. Awazu 5., Carson F. W., Hall P. L., Kaiser E. T., J. Am. Chem. Soc., 89, 3627

(1967).

80. Davies R. C., Auld D. S., Vallee B. L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 31,

628 (1968).

81. Thoma J. A., Koshland D. E., J. Am. Chem. Soc., 82, 3329 (1960).

82. Izumiya N., Uchio H., J. Biochem. (Japan), 46, 235 (1959).

83. Blake C. C. F., Johnson L. N., Mair G. A., North А. С. T., Phillips D. C., Sar-

ma V. R., Proc. R. Soc., B167, 378 (1967).

84. Rupley J. A., Gates V., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 57, 496 (1967).

85. Lumry R., Smith E. L., Glantz R. R., J. Am. Chem. Soc., 73, 4330 (1951).

86. Coleman J. E., Vallee B. L., J. Biol. Chem., 237, 3430 (1962).

87. Wyman J., Adv. Protein Chem., 19, 223 (1964).

88. Coleman J. E., Vallee B. L., Biochemistry, 1, 1083 (1962).

89. Davies R. C., Riordan J. F., Auld D. 5., Vallee B. L., Biochemistry, 7, 1090

(1968).

90. McClure W. O., Neurath H., Biochemistry, 5, 1425 (1966).

91. Hall P. L., Kaiser B. L., Kaiser E. T., J. Am. Chem. Soc., 91, 485 (1969).

92. Carson F. W., Kaiser E. T., J. Am. Chem. Soc., 88, 1212 (1966).

93. Petra P. H., Neurath H., Federation Proc., 29, 666 (1970).

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

559

94. Kaiser Е. Т., Carson F. W., Biochem. Biophys. Res. Commun., 18, 457 (1965).

95. Lumry R., Smith Е. L., Discuss. Faraday Soc., 20, 105 (1955).

96. Neurath H., DeMaria G., J. Biol. Chem., 186, 653 (1950).

97. Quiocho F. A., Richards F. M., Biochemistry, 5, 4062 (1966).

98. Coleman J. E., Vallee B. L., Biochemistry, 3, 1874 (1964).

99. Simpson R. T., Riordan J. F., Vallee B. L., Biochemistry, 2, 616 (1963).

100. Vallee B. L., Riordan J. F., Bethune J. L., Coombs T. L., Auld D. 5., Sokolov-

sky M., Biochemistry, 7, 3547 (1968).

101. Alberty R. A., Massey V., Biochim. Biophys. Acta, 13, 347 (1954).

102. Auld D. 5., Vallee B. L., Biochemistry, 9, 4352 (1970).

103. Bruice T. C., Schmir G. L., J. Am. Chem. Soc., 81, 4552 (1959).

104. Riordan J. F., Vallee B. L., Biochemistry, 2, 1460 (1963).

105. Riordan J. F., Sokolovsky M., Vallee B. L., Biochemistry, 6, 3609 (1967).

106. Bender M. L., Clement C. E., Biochem. Biophys. Res. Commun., 12, 339

(1963).

107. Simpson R. T., Vallee B. L., Biochemistry, 5, 1760 (1966).

108. Sokolovsky M., Vallee B. L., Biochemistry, 6, 700 (1967).

109. Kagan H. M., Vallee B. L., Biochemistry, 8, 4223 (1969).

110. Quiocho F. A., unpublished results.

111. Roholt O. A., Pressman D., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 58, 280 (1967).

112. Riordan J. F., Sokolovsky M., Vallee B. L., Biochemistry, 6, 358 (1967).

113. Fujuoka H., Imahori K, J. Biol. Chem., 237, 2804 (1962).

114. Behnke W. D., Federation Proc., 29, 462 (1970).

115. Coleman J. E., Pulido P., Vallee B. L., Biochemistry, 5, 2019 (1966).

116. Sokolovsky M., Riordan J. F., Vallee B. L., Biochem. Biophys. Res. Commun.,

27, 20 (1967).

117. Vallee R. L., Riordan J. F., Brookhaven Symp. Biol., 21, 91 (1968).

118. Riordan J. F., Federation Proc., 29, 462 (1970).

119. Coombs T. L., Omote Y., Vallee B. L., Biochemistry, 3, 653 (1964).

120. Freude K. A., Biochim. Biophys. Acta, 167, 485 (1968).

121. Vallee B. L., Williams R. J. P., Coleman J. E., Nature, 190, 633 (1961).

122. Ando T., Fujioka H., J. Biochem. (Japan), 52, 363 (1962).

123. Boyer P. D., in Boyer P. D., Lardy H., Myrback K. (eds.), The Enzymes, 2nd

edn., Vol. 1, Academic Press, New York, 1959.

124. Vallee B. L., Williams R. J. P., Proc, Natn. Acad. Sci. U. S., 59, 498 (1968).

125. Walsh K- A., Sampath Kumar K- S. V., Bargetzi J. P., Neurath H., Proc. Natn.

Acad. Sci. U. S., 48, 1443 (1962).

126. Walsh K. A., Ericsson L. H., Bradshaw R. A., Neurath H., Biochemistry, 9, 219

(1970).

127. Epstein I. R., Lipscomb W. N., personal communication.

128. Vallee B. L., Riordan J. F., Coleman J. E., Proc. Nant. Acad. Sci. U. S., 49, 109

(1963).

129. Smith E. L., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 35, 80 (1949).

130. Meriwether L., Westheimer F. H., J. Am. Chem. Soc., 78, 5119 (1956).

131. Buckingham D. A., Davis C. E., Foster D. M., Sargeson A. M., J. Am. Chem.

Soc., 92, 5571 (1970).

132. Blow D. M., Steitz T. A., A. Rev. Biochem., 39, 63 (1970).

133. Angelici R. J., Leach B. E., J. Am. Chem. Soc., 90, 2499 (1968).

134. Robinson D. R., J. Am. Chem. Soc., 92, 3138 (1970).

135. Гинодман Л. M., Мальцев H. И., Орехович В. H., Биохимия, 31, 1073 (1966).

136. Hall P. L., Kaiser Е. Т., Biochem. Biophys. Res. Commun., 29, 205 (1967).

137. Sealock R. W., Laskowski M., Jr., Biochemistry, 8, 3703 (1969).

138. Kaiser В. L., Kaiser E. Т., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 64, 36 (1969).

139. Ballou D., Ludwig M. L., Palmer G., unpublished observation.

140. Folk J. E., J. Am. Chem. Soc., 78, 3541 (1956).

141. Folk J. E., Gladner J. A., J. Biol. Chem., 231, 379 (1958).

142. Wintersberger E., Cox D. J., Neurath H., Biochemistry, 6, 1069 (1962).

560

Г лава

143. Kycia J. H., Elzinga M., Alonzo N., Hirs С. Н. W., Arch. Biochem. Biophys.,

123, 336 (1968).

144. Folk J. E., Piez К. A., Carroll W. R., Gladner J. A., J. Biol. Chem., 235, 2272

(1960).

145. Folk J. E., Wolff E. C., Sehirmer E. W., J. Biol. Chem., 237, 3100 (1962).

146. Elzinga M., Hirs C. H. W., Arch. Biochem. Biophys., 123, 343 (1968).

147. Elzinga M., Lai C. Y., Hirs C. H. W., Arch. Biochem. Biophys., 123, 353

(1968).

148. Elzinga M., Hirs C. H. W., Arch. Biochem. Biophys., 123, 361 (1968).

149. Cox D. J., Wintersberger E., Neurath H., Biochemistry, 6, 1078 (1962).

150. Wolff E. C., Sehirmer E. W., Folk J. E., J. Biol. Chem., 237, 3094 (1962).

151. Folk I. E., Gladner J. A., Biochim. Biophys. Acta, 33, 570 (19591.

152. Bradshaw R. A., Neurath H., Walsh K. A., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 63,

406 (1969).

153. Plummer T. H., Jr., J. Biol. Chem., 244, 5246 (1969).

154. Lipscomb W. N., Accounts Chem. Res., 3, 81 (1970).

155. Plummer T. H., Jr., Lawson W. B., J. Biol., Chem., 241, 1648 (1966).

156. Wintersberger E., Neurath H., Coombs T. L., Vallee B. L., Biochemistry, 4,

1526 (1965).

157. Wintersberger E., Biochemistry, 4, 1533 (1965).

158. Reeck G. R., Winter W. P., Neurath H., Biochemistry, 9, 1.398 (1970).

159. Lacko A. G., Neurath H., Biochem. Biophys. Res. Commun., 26, 272 (1967).

160. Prahl J. W., Neurath H., Biochemistry, 5, 4137 (1966).

161. Goldman P., Levy C. C., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S„ 58, 1299 (1967).

162. Levy C. C., Goldman P., J. Biol. Chem., 243, 3507 (1968).

163. Izaki K., Strominger J. L., J. Biol. Chem., 243, 3193 (1968).

164. Zuber H., Nature, 201, 613 (1964).

165. Wells J. R., Biochem. J., 97, 228 (1965).

166. Piras R., Vallee B. L., Biochemistry, 6, 348 (1967).

167. Freisheim J. H., Walsh K. A., Neurath H., Biochemistry, 6, 3020 (1967).

168. Brown J. R., Greenshields R. N. et al., Biochemistry, 2, 867 (1963).

169. Smith E. L., Hill R. L., in P. D. Boyer, H. Lardy, K. Myrback (eds.), The Enzy-

mes, Vol. 4, Academic Press, New York, 1960, p. 37.

170. Smith E. L.. Spackman D. H., J. Biol. Chem., 212, 271 (1955).

171. Bryce G. F., Rabin B. R., Biochem. J., 90, 509 (1964).

172. Spackman D. H., Smith E. L., Brown D. M., J. Biol. Chem., 212, 255 (1955).

173. Himmelhoch S. R., Peterson E. A., Biochemistry, 7, 2085 (1968).

174. Hanson H., Glaeser D., Kirschke H., Z. Physiol. Chem., 340, 107 (1965).

175. Kretschmer K., Hanson H., Z. Physiol. Chem., 249, 831 (1968).

176. Folk J. E., Gladner J. A., Viswanatha T., Biochim. Biophys. Acta, 36, 356

(1959).

177. Frater'R., Light A., Smith E. L., J. Biol. Chem., 240, 253 (1956).

178. Beckman L., Bjorling G., Christodoulou C., Acta. Genet., 16, 223 (1966).

179. Johnson M. J. et al., J. Biol. Chem., 116, 515 (1936).

180. Himmelhoch S. R., Arch. Biochem. Biophys., 134, 597 (1969).

181. Bryce G. F., Rabin B. R., Biochem. J., 90, 513 (1964).

182. Hill R. L., Smith E. L., J. Biol. Chem., 224, 209 (1957).

183. Hartley B. S., A. Rev. Biochem., 29, 45 (1960).

184. Vallee B. L., Coleman J. E., in M. Florkin, E. H. Stotz (eds.), Comprehensive

Biochemistry, Vol. 12, Elsevier, Amsterdam, 1964, p. 194.

185. Latt S. A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 37, 333 (1969).

186. Keay L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 36, 257 (1969).

187. Ohta Y., Ogura Y., WadaA., J. Biol. Chem., 241, 5919 (1966).

188. Matsubara H., Singer A., Sasaki R., Jukes T. A., Biochem. Biophys. Res. Com-

mun, 21, 242 (1965).

189. Matsubara H., Biochem. Biophys. Res. Commun., 24, 427 (1966).

190. Matsubara H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 34, 719 (1969).

191. McConn J. D., Tsuru D., Yasunobu K-, J. Biol. Chem., 239, 3706 (1964).

ГЛАВА 16

КАРБОАНГИДРАЗА

Дж. Э. Коулмен

Coleman J. E., Department of Molecular Biophysics

and Biochemistry, Yale University, New Haven,

Connecticut, USA

1. ВВЕДЕНИЕ

Карбоангидраза — первый металлофермент, в котором был об-

наружен цинк. Данные о том, что в эритроцитах имеется белок,

способный катализировать гидратацию — дегидратацию CO

, впер-

вые были получены в лаборатории Рафтона [1—4]. Кейлин и

Манн [5, 6] очистили фермент из эритроцитов быка и обнаружили

в его препаратах 0,33% цинка. Молекулярная масса этого фермен-

та около 30 000 [7—9]. В расчете на это значение, содержание цин-

ка в белке колеблется от 0,92 до 1,52 г-атом/моль [5, 10, 11]. Было

показано, что агенты, связывающие в комплекс металл (особенно

анионы — цианид, сульфид, азид [4] и тиоцианат [12] и 2,3-димер-

каптопропанол-1 [13]), являются сильными ингибиторами фермен-

та. Эти данные указывали на важную роль ионов цинка для функ-

ционирования фермента из эритроцитов.

Ранние исследования растительной карбоангидразы также сви-

детельствовали о наличии цинка и об ингибировании фермента

анионами [14—18], хотя и не так убедительно, как для фермента

из эритроцитов. Данные последних лет о растительной и бактери-

альной карбоангидразах обсуждаются в разд. 2.

Манн и Кейлин [19] обнаружили сильное ингибирование фер-

мента из эритроцитов сульфамидами. Это свойство — особенность

карбоангидразы, так как больше ни один из известных ферментов

не ингибируется этими соединениями так же специфично. Посколь-

ку эти ингибиторы сыграли очень важную роль в физико-химиче-

ских и энзимологических исследованиях фермента, разд. 4 посвящен

детальному обсуждению свойств сульфамидных комплексов кар-

боангидразы. Хотя по своей природе сульфамиды не являются

агентами, связывающими металлы в комплекс, последние данные

свидетельствуют о том, что в молекуле фермента центр связыва-

ния сульфамидов содержит ион цинка в качестве одной из коорди-

нирующих групп. Металл взаимодействует с группой —SO

[20—23].

36—2451

562

Г лава

О карбоангидразе часто упоминали как о самом специфичном

из всех известных ферментов, так как считалось, что единственной

ее функцией является катализ обратимой гидратации CO

а) H

O + CO

<—H+ + HCOJ

к—i

k,, _ (1)

б) ОН" + COo HCO

k-2

Реакция может быть написана с водой или с гидроксилом в ка-

честве активных частиц. Как это происходит с ферментом, окон-

чательно пока не известно, однако имеется вполне убедительные

данные в пользу того, что атаку на CO

осуществляет гидроксил,

координированный у цинка (разд. 7).

В последние годы было показано, что, кроме реакций (1), кар-

боангидраза катализирует некоторые процессы гидролиза и гидра-

тации, затрагивающие карбонильную группу (гидролиз п-нитро-

фенилацетата [24—27] и сультона 2-окси-5-нитро-а-толуолсульфо-

кислоты [28—30] и гидратацию ацетальдегида [31—33]). Эти

реакции детально обсуждаются в разд. 7.

2. ИЗОФЕРМЕНТЫ И ВИДОВЫЕ ВАРИАНТЫ —

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

В последние 10 лет в нескольких лабораториях были разрабо-

таны методы получения высокоочищенной карбоангидразы из эрит-

роцитов [34—42]. Они заключаются в осаждении гемоглобина

смесью хлороформ—этанол [37, 39, 42] с последующей хромато-

графией на колонке, заполненной ДЭАЭ-целлюлозой [34, 37, 42],

ДЭАЭ-сефадексом [43] или гидроксилапатитом [37, 39, 42]. Белок

хорошо переносит лиофилизацию, и в большинстве методов она

используется на той или иной стадии выделения. Накопленный

опыт препаративной работы выявил некоторые особенности мето-

дов очистки фермента. Обработка смесью хлороформ—этанол су-

щественно не меняет большинство физико-химических свойств. Но,

как показал рентгеноструктурный анализ, воздействие этой смеси

на фермент С человека снижает качество кристаллов [22, 23]. Для

удаления гемоглобина лучше использовать гель-фильтрацию [37]

или хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе [43]. Качество кристал-

лов повышается, если проводится электрофоретическая очистка

фермента [23] и если не применяется лиофилизация [22, 23].

С помощью этих методов удалось выделить в чистом виде

много различных типов карбоангидразы из эритроцитов животных.

Некоторые из них получены в кристаллическом виде [39, 44, 45]

(рис. 16.1). Для фермента В человека кристаллы легче получают-