Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы 533

циннамоилфениллактата является следствием непродуктивного

связывания, то эффективность гидролиза этих субстратов должна

быть очень велика.

3.2. Кинетико-структурные корреляции

3.2.1. Присоединение субстратов и ингибиторов

Существование дополнительных кинетических путей подразуме-

вает определенные особенности структуры КПА. Субстраты, кото-

рые способны активировать или ингибировать свой гидролиз, долж-

ны связываться более чем на одном центре. Модификаторы, по-ви-

димому, тоже присоединяются одновременно с субстратами.

Комплексы с модификаторами или субстратами, связанными на не-

скольких центрах, не подвергались прямому кристаллографическо-

му изучению. Однако моделирование позволило найти способ свя-

зывания, объясняющий кинетический эффект модификатора,

КБЗ-Gly [2, 3] (рис. 15.12). Если КБЗ-группа этого соединения на-

ходится вблизи остатка Туг-198, а группа COO

взаимодействует

с остатком Arg-71, то возможны помехи ориентации субстрата в

продуктивном комплексе. Для объяснения ингибирования субст-

ратом при гидролизе КГФ было предположено, что вторая молеку-

ла КГФ образует с ферментом те же связи, что и КБЗ-Gly [2, 3]

(рис. 15.12). Однако эта модель не может полностью объяснить ки-

нетику субстратного ингибирования. В предполагаемой области

связывания субстрата трудно разместить более двух молекул ацил-

пептидов, в то время как кинетический анализ указывает на при-

соединение четырех или пяти молекул субстрата в растворе [85]

и более чем двух в кристалле [97]. Высокий кинетический порядок

реакции может объясняться связыванием на других участках мо-

лекулы фермента или более сложным образом [28].

По-видимому, при непродуктивном или конкурентном связыва-

нии используются некоторые из взаимодействий, возникающих в

продуктивном фермент-субстратном комплексе. Так, из пяти свя-

зей, образуемых молекулой Gly-Tyr, только одна — между амино-

группой субстрата и остатком Glu-270 — считается непродуктивной.

Другие неактивные комплексы могут образовываться в результате

смещения субстрата вдоль «связывающей выемки», приводящего

к присоединению карбоксильной группы к атому цинка, или в ре-

зультате «неправильного» связывания, при котором N-ацильный

заместитель ацилдипептида занимает полость, определяющую спе-

цифичность, а концевая группа COO

вступает в контакт с остат-

ком Arg-71 [2, 3].

Структурные и кинетические данные показывают, что присоеди-

нение некоторых ингибиторов общего вида RCOO

осложняется

534

Г лава

наличием множественных типов взаимодействий. Ранее считали,

что (З-фенилпропионат, прототип таких ингибиторов, строго конку-

рентен по отношению к субстрату [26]. Однако более поздние ра-

боты показали, что в ингибировании можно выделить конкурент-

ную и неконкурентную компоненты для одного и того же пептидно-

го субстрата, что подразумевает сложный механизм связывания

Phe-279^ CH

Arg-71

"С —N

Ф"г.г>шЛ3 2п

Tgr-248

Arg-71

Рис. 15.12. Модели связывания, объясняющие активирующий эффект КБЗ-Gly

при гидролизе КБЗ-Gl-Phe (а) и ингибирование избытком субстрата (б).

[8, 95]. Тем не менее данные по ингибированию и связыванию, по-

видимому, согласуются с образованием комплекса типа 1:1с Ki=

= IO

-4

M [76, 98]. Способ связывания, соответствующий этой кон-

станте, требует присутствия цинка. Дополнительные молекулы фе-

нилпропионата присоединяются при концентрациях, больших

-3

М. К сожалению, эти центры нельзя прямо сравнить с обнару-

живаемыми при кристаллографическом исследовании, так как в

кристаллическом состоянии сродство к фенилпропионату на два

порядка ниже и величина Ki составляет примерно Ю

-2

M [97].

Аналог этого соединения, содержащий тяжелый атом, иодфенил-

пропионат, частично занимает два центра при концентрации выше

10~

М. Один из них расположен вблизи остатка Туг-198, а дру-

гой— в полости специфичности (рис. 15.10). В обоих случаях, как

показано методом ЯМР для Mn-КПА, молекула лиганда ориенти-

рована таким образом, что возможно взаимодействие его карбо-

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

535

ксильной группы с атомом металла активного центра [71]. Более

того, в отсутствие цинка сродство центра, расположенного в поло-

сти, уменьшается, а центр вблизи остатка Туг-198 вообще переста-

ет связывать иодфенилпропионат при его концентрации 0,10 М.

При большей концентрации ингибитора кристаллографическим ме-

тодом обнаруживаются два дополнительных места присоединения

иодфенилпропионата, однако они удалены от атома цинка.

Влияние центров, изображенных на рис. 15.10, на кинетику ре-

акции не вполне ясно. Связывание в полости, по-видимому, предпо-

лагает конкурентное ингибирование по отношению к любому суб-

страту, располагающемуся подобно Gly-Tyr. С другой стороны,

возможно, что ингибитор, находящийся вблизи остатка Туг-198,

присоединяется к атому цинка, не создавая стерических препятст-

вий связыванию длинных пептидов, рассмотренному в разд. 2.4.1.

Координационное число атома цинка при таком неконкурентном

взаимодействии, вероятно, становится равным пяти. Данные по

связыванию, из которых вытекает стехиометрия 1:1, казалось бы,

свидетельствуют в пользу того, что ингибитор не может одновре-

менно заполнять оба центра, обнаруживаемые кристаллографиче-

ским методом [70]. Однако факт защиты от модификации двух

тирозиновых остатков при высокой концентрации фенилпропионата

[99] проще всего объясняется одновременным присоединением

двух (или более) молекул ингибитора. Оглядываясь назад, прихо-

дится сожалеть, что ингибитор, ведущий себя столь сложным об-

разом, так часто использовался для изучения активного центра

КПА.

Обсуждение моделей присоединения эфирных субстратов наме-

ренно до сих пор откладывалось. Прямые данные о структуре от-

сутствуют, так как попытки получить кристаллические комплексы

КПА с эфирными субстратами пока не увенчались успехом. Неко-

торые, но не все эфирные субстраты ведут себя иначе, чем пепти-

ды. Например, активаторы гидролиза пептидов ингибируют гидро-

лиз циннамоилфениллактата [79], а ингибирование (3-фенилпро-

пионатом неконкурентно по отношению к пептидам и конкурентно

по отношению к ГФЛ [76]. Исходя из этих различий, было вы-

сказано предположение о том, что продуктивное связывание эфи-

ров и пептидов может происходить различным образом [100].

Полное описание взаимодействия с эфирами потребует эксперимен-

тов, позволяющих установить взаимное расположение важных

групп на ферменте и субстрате, т. е. использования флуоресцент-

ных и резонансных методов или проведения дополнительного рент-

геноструктурного анализа*.

* Недавно рентгеноструктурный методом с разрешением 6 А было показано,

что продукт гидролиза эфира L-p-фениллактат присоединен к КПА так же, как

L-фенилаланин [65].

536

Г лава

3.2.2. Зависимость активности от рН

Влияние рН на ферментативную активность иногда можно объ

яснить в рамках модели, предполагающей, что катализ зависит о

состояния ионизации некоторых аминокислот. Тогда, если зависи

МОСТЬ А?кат /Км от рН описывается колоколообразной кривой, по Hei

можно определить константы ионизации Ku и Kie каталитичесю

важных групп в свободном ферменте. Константы ионизации, отно

сящиеся к комплексу ES, можно получить из зависимости k

Kат

о-

рН [101]. В случае КПА определение величин К\

и K^

было бь

полезным для установления роли тирозина и других остатков, рас

положенных вблизи субстрата. Однако имеющиеся данные доволь

но скудны. Пептидный субстрат КБЗ-Gly-Gly-Phe был исследоваг

недавно в условиях, при которых интерпретация результатов не

осложняется ингибированием или активацией [7]. Кривые зависи-

мости &КАТ/Км ОТ рН оказались колоколообразными, что предпола-

гает участие в катализе как кислой, так и основной групп. Кривые

описывающие влияние рН на &

ат, для этого субстрата имеют точ-

ку перегиба около рН 6. В щелочной области (до рН 10,5) k

Kai

практически постоянна**. Отсутствие данных, указывающих на тит-

рование второй группы в комплексе ES, не исключает возможности

участия в реакции кислотного катализа, если предположить, на-

пример, что соответствующая стадия не лимитирует скорость реак-

ции (ср., однако, работу [103]). Зависимость гидролиза КГФ от

рН представлена в нескольких ранних работах. Данные, получен-

ные при высокой концентрации субстрата, указывают на сложный

характер влияния рН на &

АТ и Км [26]. По зависимости началь-

ной скорости от рН [104] были определены величины P^CES. равные

6,5 и 8,6, однако сравнение с ацилтрипептидами показывает, что эти

данные нуждаются в уточнении. При более низкой концентрации

КГФ влияние рН на /г

кат

менее выражено [85].

Зависимость k^/Кж от рН описывается колоколообразной кри-

вой в случае двух эфирных субстратов — ацетилманделата [92] и

циннамоилфениллактата [91]. Константы ионизации свободного

фермента оказались равными Ю

-6

и IO

-7

, и Ю

-6

и Ю

-9

M со-

ответственно. Не предложено никаких объяснений расхождения

кривых в щелочной области. Предварительное сравнение рН-зави-

симостей начальных скоростей гидролиза ГФЛ и КГФ обнаружи-

* Ku — константа ионизации свободного фермента, определяющая более

«кислую» ветвь колоколообразной кривой, Кге — аналогичная константа для вто-

рой ветви кривой, ^ES — кажущаяся константа ионизации комплекса ES, опреде-

ленная по зависимости й

кат

от рН.

** Опубликована полная сводка данных по влиянию рН на гидролиз грипеп-

тида [102]. Как Ям, так и k

^fKu зависят от состояния ионизации группы

с рК около 9. Этой группой может быть остаток Туг-248, что означало бы, что

он принимает участие в связывании субстрата. Существует несколько предполо-

жений о природе группы с меньшим значением р/С, влияющей на &

ат и йкат/Км.

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

537

ло, как казалось, принципиальное отличие эфиров от пептидов, по-

скольку кривая рН-зависимости для эфиров была сигмоидальная,

а для пептидов — колоколообразная. Однако работы с КБЗ-Gly-

Gly-Phe

ацетилманделатом и модифицированными карбоксипепти-

дазами [105] не подтвердили универсальности этой закономерно-

сти.

Влияние природы субстрата на характер рН-зависимости мож-

но объяснить изменением стадии, лимитирующей скорость [106].

Кроме того, следует иметь в виду, что простейшая модель рН-эф-

фектов не включает конформационные переходы и изменения при-

роды стадии, лимитирующей скорость, при изменении рН [58].

3.3. Химическое изучение роли различных

остатков в активном центре

3.3.1. Модификация остатков в центре связывания

субстратов

Химическая модификация тирозина убедительно доказывает,

что эта аминокислота играет некоторую роль в активном центре

КПА*. Особенно удачной оказалась «дифференциальная модифи-

кация» в присутствии и в отсутствие субстратов или ингибиторов.

Впоследствии она была дополнена определением расположения

центра модификации в аминокислотной цепи. Модификация тиро-

зина включала ацетилирование уксусным ангидридом [104] или

ацетилимидазолом [99], иодирование [107], нитрование тетранит-

рометаном [105] и диазотирование диазоний-1Н-тетразолом [108]

или диазо-п-бензоларсонатом [109]. При реакции с ацетилимида-

золом в КПА модифицируются пять тирозиновых остатков, однако

влияние ацетилирования на активность связывается с модификаци-

ей только двух остатков, которые можно защитить р-фенилпропиона-

том. В результате ацетилирования &

кат

для пептидов (включая

ацилтрипептиды) понижается до 3—6% первоначальной величины

76, 89], в то время как гидролиз ГФЛ (но не ацетилманделата

TlO]) происходит все еще достаточно быстро. Основной эффект

ацетилирования на гидролиз ГФЛ заключается в уменьшении суб-

стратного ингибирования, в результате чего оно появляется при

большей концентрации субстрата [78]. Величины &кат и Км для

ГФЛ увеличиваются при ацетилировании [78, 89].

Реагенты, отличающиеся от ацетилимидазола, селективно моди-

фицируют тот или иной из двух остатков тирозина, что оказывает

разное влияние на пептидазную активность. Нитрование одной ти-

розильной группы приводит к пропорциональному уменьшению ак-

тивности [105], тогда как присоединение 1 моля диазобензоларсо-

* В механизме, рассматриваемом в разд. 3.5.1., тирозину отводится роль

донора протонов.

538

Г лава 10

ната к этому же, по-видимому, остатку вызывает уменьшение ак-

тивности лишь на 50%- Модификация же диазо-1Н-тетразолом

примерно одного остатка тирозина, происходящая при умеренном

избытке реагента, почти не сказывается на пептидазной активно-

сти. Нитро-, арсанилазо- и тетразолиазо-КПА способны гидроли-

зовать эфирный субстрат, ГФЛ, причем они менее чувствительны к

субстратному ингибированию. Дополнительная модификация тет-

разолнлазо-КПА тетранитрометаном приводит к включению одной

нитрогруппы и значительной потере пептидазной активности. От-

сюда был сделан вывод, что при такой двойной модификации КПА

нитро- и тетразолилазогруппы присоединяются к разным остаткам

тирозина [105]. Если это так, то только один из них существен для

гидролиза пептидов, тогда как ингибирование избытком ГФЛ конт-

ролируется обоими. Однако для окончательного установления мест

модификации необходимо определить первичную структуру получа-

ющихся производных.

Отождествление одного из каталитически важных остатков ти-

розина с Туг-248 основывается на пространственном расположении

последнего и аминокислотной последовательности пептида, полу-

ченного иодированием КПА действием

131

I в присутствии фенилпро-

пионата и затем

125

I в его отсутствие. После гидролиза иодирован-

ной КПА пепсином был выделен пептид с наибольшим отношени-

ем

123

131

1. Его аминокислотная последовательность оказалась Ile-

Tyr-Gln-Ala [111], что совпадает только с участком полипептидной

цепи 247—250 [4]. Уменьшение реакционной способности остатка

Туг-248 при связывании фенилпропионата можно объяснить изме-

нением конформации белковой молекулы.

Хотя остаток Туг-198 и удален от расщепляемой пептидной свя-

зи, он может участвовать в вандерваальсовых взаимодействиях с

субстратами, большими, чем глицилтирозин (рис. 15.3 и 15.4). Бо-

ковые цепи других остатков тирозина, расположенных в районе ак-

тивного центра, направлены в сторону от участков присоединения

субстрата. Таким образом, второй остаток этой аминокислоты, ко-

торый, судя по результатам модификации, участвует в образовании

активного центра, вероятно, является остатком 198. Иодфенилпро-

пионат присоединяется в кристаллах КПА к центру, расположен-

ному вблизи фенольной группы Туг-198 (рис. 15.10). Если фенил-

пропионат связывается аналогичным образом, то становится понят-

ным влияние этого ингибитора на модификацию. Высокую реак-

ционную способность остатков Туг-198 и Туг-248 можно частично

объяснить тем, что они находятся в контакте с окружающим рас-

творителем. Кроме того, рК нитруемого остатка тирозина меньше,

чем р/( остальных [112].

Расположение остатка Туг-248 в комплексе КПА с Gly-Tyr

вполне согласуется с предположением о том, что модификация

именно этой аминокислоты оказывает существенное влияние на

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

539

гидролиз пептидов. Так, судя по структуре, в нитро- и арсанилазо-

карбоксипептидазах заместители присоединены к остатку Туг-248.

Изменения спектров, наблюдаемые при прибавлении р-фенилпро-

пионата [109, 112, 113] или глицилтирозина [109] к нативной или

модифицированной КПА, хотя и не могут быть однозначно интер-

претерированы, однако хотя бы отчасти обусловлены переориента-

цией остатка Туг-248 [2, 3]. (Сообщение [114] о том, что спектры

тетразолилазо-КПА, в которой модифицирован не остаток 248

[105], тоже изменяются в присутствии глицилтирозина, подчерки-

вает необходимость определения аминокислотной последователь-

ности соответствующих пептидов в различным образом модифи-

цированной КПА.)

Влияние ацетилирования на гидролиз пептидов объясняется

главным образом уменьшением й

ат, хотя Км тоже может изме-

няться при этом. Для ацетил-КПА величина Км для КГФ в каче-

стве субстрата [78] и Ki для этого же пептида в качестве ингиби-

тора гидролиза ГФЛ [100] на порядок выше значения Км для

превращения КГФ нативной КПА. Ранее сделанный вывод о том,

что влияние ацетилирования на активность КПА связано с нару-

шением способности связывать ГФЛ и дипептиды [115], не согла-

суется с результатами экспериментов по конкуренции и рентгено-

структурными данными об образовании комплекса между Gly-Tyr

и ацетил-КПА. Действительно, присоединение гиппурилфенилала-

нина и КБЗ-Gly-Gly-Phe почти не изменяется при ацетилировании

КПА [76, 78]. Тем не менее из этих данных по модификации не

следует, что тирозин непосредственно участвует в катализе*. Для

проверки постулата об участии остатка Туг-248 в качестве донора

протона [2, 3] было бы полезно исследовать кинетические пара-

метры и рН-зависимость гидролиза пептидов арсанилазо-КПА, в

которой рК этой группы понижено по сравнению с нативной КПА

[116].

Обнаружение взаимодействий субстрата с остатками Glu-270 и

Arg-145 в кристаллическом комплексе стимулировало попытки мо-

дифицировать эти остатки [117]. Реакция примерно трех остатков

аргинина в КПА с бутандионом приводит к значительному (85%)

уменьшению пептидазной активности [118]. При удалении моди-

фицирующей группы с одного остатка аргинина активность восста-

навливается. Так же как при реакциях с тирозином, эстеразная ак-

тивность уменьшается не пропорционально пептидазной. Место мо-

дификации и то, каким образом измеряется й

кат

и Км для гидро-

лиза пептидов, не определены. Модификация карбоксильной груп-

пы И-этил-б-фенилизоксазолий-З'-сульфонатом (К-реагент Вудвор-

* Возможно, что величина Км, измеренная в кинетических экспериментах,

относится лишь к небольшой доле фермента [78]. Несмотря на это, вызывает ин-

терес то, что ацетил-КПА сохраняет значительную часть пептидазной активности,

хотя модифицирующий реагент находится в 500-кратном избытке [76].

540

Г лава

да) сопровождается потерей и пептидазной и эстеразной активно-

сти, причем скорость инактивации уменьшается в присутствии (3-

фенилпропионата или глицилтирозина. Еще одна группа COO

быстро реагирует с этим соединением, что, однако, не влияет на ак-

тивность. Пептид, выделенный после замещения реагента К на

OCH

, по-видимому, содержит остаток Glu-88 [93]. Для химиче-

ского подтверждения роли, приписываемой остатку Glu-270, было

бы очень важно получить монопроизводное белка по этой амино-

кислоте (разд. 3.5).

Химическая модификация дает основания предположить, что,

кроме тирозильной, карбоксильной и аргинильной групп, для фер-

ментативной активности КПА важен гистидин. Фотоокисление ги-

стидина в присутствии метиленового синего [119] или бенгальского

розового [120] или реакция одного остатка этой аминокислоты с

диазо-1Н-тетразолом [108] вызывает потерю пептидазной актив-

ности. Положение реагирующих остатков не установлено, хотя

единственными остатками гистидина, расположенными в активном

центре, являются His-69 и His-196. Исчезновение активности в этих

экспериментах не было просто результатом удаления цинка из фер-

мента. Хотя при окислении метиленовым синим и происходила ча-

стичная потеря цинка, в тетразолилазо-His-KnA металл сохраня-

ется полностью. Последнее производное фермента обладало эсте-

разной активностью, причем величина &

ат для ГФЛ составляла

Примерно ПОЛОВИНу «кат для немодифицированной КПА [108].

3.3.2. Химическая природа лигандов, связанных

с металлом, и дисульфидная связь

Значительные усилия были потрачены на установление природы

лигандов атома цинка до того, как стали известны трехмерная

структура и аминокислотная последовательность КПА. Как и при

изучении связывания субстрата и поиске каталитических групп, в

основном сравнивали реакционные способности различных остат-

ков в присутствии и в отсутствие присоединяемого компонента, в

данном случае иона металла. В результате был сделан вывод, что

атом цинка связан с цистеином и а-аминогруппой. На самом деле

лигандами цпнка являются остаток глутамата и два остатка гисти-

дина. Было бы полезно для будущего проанализировать некото-

рые опасности, подстерегающие при химическом определении при-

роды лигандов.

Результаты изучения реакции КПА с ПХМБ методом разност-

ной спектроскопии согласуются с предположением о появлении в

молекуле фермента при удалении металла одной реакционноспо-

собной сульфгидрильной группы. Вывод о том, что цистеин служит

лигандом цинка, казалось бы, подтверждался влиянием на апо-

фермент феррицианида и конкуренцией за апофермент ионов се-

Карбоксипептидаза А и другие пептидазы

541

ребра и цинка [24]. Поскольку константы устойчивости для ряда

металлов находились в согласии с моделью бидентатного лиганда,

в котором донорами служат атомы азота и серы [121], было изу-

чено влияние реагентов, специфически взаимодействующих с ами-

но- и имидазольными группами. Фотоокисление гистидина вызыва-

ло постепенное уменьшение активности и содержания цинка [119],

однако прибавление цинка не влияло на скорость инактивации, что

послужило основанием для вывода о том, что гистидин не связан

с металлом. Модификация а-аминогруппы, напротив, затруднялась

при образовании металлофермента [119]. Поскольку величину

р/( 7,7, определенную комплексометрическим титрованием апофер-

мента. вполне можно было отнести к а-аминогруппе, было предпо-

ложено, что концевой остаток NH

является лигандом цинка, не-

смотря на то, что его ацетилирование не влияло на ферментатив-

ную активность [122].

Пересмотр этих данных на основании известной структуры КПА

заставляет сделать вывод о том, что при спектрофотометрическом

титровании ПХМБ реагировал с лигандом, связанным с цинком.

Отсутствие SH-групп и высокое сродство центра присоединения

цинка к Hg

+ предполагает, что спектральные изменения вызыва-

ются взаимодействием ПХМБ с имидазольной и (или) карбоксиль-

ной группой. Появление изменений в спектре при 250 нм было ра-

нее отмечено при взаимодействии ПХМБ и ЭДТА [123]. Опыт

изучения КПА должен служить указанием на то, что некоторые

специфические центры связывания металла, не содержащие сульф-

гидрильные группы, могут реагировать с производными ртути, вы-

зывая спектральные изменения. Корреляции с модельными

соединениями следует признать ненадежными, поскольку считается

[124], что трудно подыскать модели, похожие по свойствам на ме-

таллоферменты. Единственным методом строгого установления

взаимодействий металл—фермент в- трехмерном пространстве сей-

час является трехмерный рентгеноструктурный анализ. Действи-

тельно, кристаллография представляет собой наиболее точный ме-

тод установления природы лигандов, связанных с металлом. Одна-

ко из-за трудностей в идентификации боковых цепей аминокислот

[22] для полного описания центра присоединения металла необхо-

димо знать первичную структуру белка.

Вывод [121] об участии сульфгидрильной группы в связывании

цинка привел к тому, что существование дисульфидной связи [1]

оставалось незамеченным. Аминокислотный анализ обнаружил

2 моля цистеина в расчете на 1 моль белка. Поэтому из результа-

тов титрования ПХМБ вытекало присутствие в КПА второй, не-

реакционноспособной SH-группы. Ни одну из этих SH-групп нель-

зя было легко алкилировать без предварительной обработки бел-

ка восстанавливающими агентами, такими, как меркаптоэтанол.

После восстановления и алкилирования в присутствии фенилпро-

542

Г лава

пионата фермент сохранял свою активность и в нем обнаруживал-

ся 1 моль/моль карбоксиметилцистеина. Последующее удаление

фенилпропионата и повторение реакции приводило к появленик

второй карбоксиметильной группы и инактивации фермента. Уча-

сток аминокислотной последовательности, включающий второе

остаток цистеина, был отождествлен с активным центром [125].

После определения первичной структуры алкилирование «цис-

теина» было изучено повторно. С помощью методик выделения

пептидов с высоким выходом было показано, что при восстановле-

нии и алкилировании в присутствии фенилпропионата реагирует

тот или иной из остатков 138 и 161, но не оба сразу. Таким обра-

зом было подтверждено существование дисульфидного мостика,

связывающего эти аминокислоты [126].

3.4. Зачем нужен металл?

Функцию металла в карбоксипептидазе можно рассматривать

в двух аспектах: участие в связывании субстрата и участие в ка-

тализе. Данные свидетельствуют в пользу того, что в активной ме-

талло-КПА ионы металла участвуют как в связывании субстрата,

так и в катализе, однако логически удобно разделить влияние ме-

талла на ориентацию субстрата на поверхности молекулы фермен-

та и его участие в понижении энергии переходного комплекса.

Надежные данные о типах прямых связей, образуемых атомом

металла активного центра с субстратами и ингибиторами, можно

получить с помощью рентгеноструктурного анализа, а также мето-

дом ЯМР. Уширение резонансных линий протонов нескольких ин-

гибиторов общего вида RCOO

при добавлении Mn-КПА можно

объяснить тем, что группа COO

находится во внутренней коорди-

национной сфере иона Mn

+ [66, 71]. Влияние фенилпропионата

на резонанс ядер

, присоединяемых к Mn в Mn-КПА, подтвер-

ждает этот вывод [67, 72]. Однако полное описание влияния ме-

талла на геометрию связывания субстрата или ингибитора требу-

ет точного сравнения геометрии апо-КПА и различных металло-

КПА в присутствии и в отсутствие субстратов.

Оценка прочности взаимодействий субстрат—металл представ-

ляется довольно трудной. Один из методов заключается в сравне-

нии констант прочности в присутствии и в отсутствие цинка. По

различию между этими константами можно определить изменение

свободной энергии, соответствующее взаимодействию металл—суб-

страт, если допустить, что удаление металла не изменяет структу-

ру E и ES. На практике в присутствии цинка вместо значений кон-

стант равновесия приходится использовать значения /См. Некото-

рые пептиды присоединяются к апо-КПА почти с той же констан-

той равновесия, что и к Zn-КПА [86] (табл. 15.4). Прочность свя-

зи пептидов с активными формами КПА, получающимися заменой