Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Металлоферменты.

453

2.3. Парамагнитные эффекты на скорости ядерной

магнитной релаксации ядер лигандов

2.3.1. Общие положения

Этот сложный метод не будет детально обсуждаться в данном

разделе, однако некоторые его аспекты требуют более подробного

рассмотрения. Наиболее подробно метод обсуждается в обзорах

[75, 76, 76а], а также в гл. 18.

В присутствии некоторых парамагнитных ионов, например

+, наблюдается парамагнитный вклад в продольную (\/Т\

) и

поперечную

) скорости ядерной магнитной релаксации, на-

пример протонов воды [77, 78]:

_J рд 1

~ T

+ х

os (4)

рд 1

2М

+ х

(5)

где р — отношение концентрации парамагнитного иона и концен-

трации лиганда; q — координационное число лиганда; 1/тм — ско-

рость обмена лиганда на парамагнитном ионе; \/Т

(\1Т

2М

) —

скорости релаксации ядра связанного лиганда; 1/T°

(\[T%

) —

вклад в скорость релаксации, обусловленный диполь-дипольным

взаимодействием парамагнитного иона с внешней координацион-

ной сферой ядра (внешнесферная релаксация). Следует заметить,

что уравнение (5) имеет силу для Mn

+, но применимо не для всех

парамагнитных ионов [77]. Уравнения (4) и (5) содержат не-

сколько важных для анализа каталитической роли ионов метал-

лов параметров при условии их применимости для высокомоле-

кулярных комплексов. Во-первых, сравнением q для протонов во-

ды в комплексах E—М

ж+

и E — M

+ — субстрат определяют схе-

му координации при этих взаимодействиях. Во-вторых, сравнени-

ем 1/тм обмена субстрата в комплексе E — М

ж+

— субстрат с чис-

лом оборотов фермента в катализе можно выяснить, достаточно

ли быстро происходят образование и диссоциация этого комплек-

са, чтобы он мог участвовать в каталитических актах. В-третьих,

можно установить, образуется ли комплекс E — M

+ — лиганд,

рассчитав расстояние г между протонами лиганда и парамагнит-

ным ионом. Этот расчет можно провести исходя из \/T

в случае,

если известна величина времени корреляции (т

), описывающая

это диполь-дипольное взаимодействие [79, 80]. И, наконец, из

значений 1/Т

2М

и 1/Т

могут быть получены константы сверх-

тонких взаимодействий с учетом величины времени корреляции

(т

), описывающей эти сверхтонкие взаимодействия [79, 81]. Этот

последний параметр исключительно важен для доказательства не-

посредственной координации, поскольку сверхтонкие взаимодей-

454

Г лава 10

ствия могут происходить только через химические связи [66]. Та-

ким образом, измеряя одновременно

/Г

1р

и \/Т

2р

, можно полу-

чить в одном и том же эксперименте как кинетические, так и

структурные данные при условии, что они оказывают доминирую-

щее влияние на релаксационные процессы. Однако получение по-

добной информации часто затруднено в связи с тем, что в первую

очередь необходимо установить, какие процессы оказывают основ-

ное влияние на скорость релаксации. Например, 1 JTi

может опре-

деляться как 1/Т

, так и 1/тм или

JT°

, а в свою очередь

IJTim может содержать вклад l/t

(время релаксации спина элек-

трона), 1/ти (вращательное время корреляции) или 1/тм [81]. Ес-

ли имеется вклад только одного процесса в скорости релаксации,

то обычно можно идентифицировать этот процесс изучением час-

тотной и температурной зависимостей наблюдаемых скоростей ре-

лаксации, хотя малая температурная устойчивость большинства

биологических систем ограничивает возможности изучения темпе-

ратурной зависимости. Милдван и Кон [76] суммировали в таб-

лицы возможное в этом случае поведение для ряда примеров. Од-

нако, если скорости релаксации отражают вклад более чем одно-

го процесса, вышеописанный анализ становится невозможным.

В плане исследований, проводимых в настоящее время, важно

подчеркнуть три аспекта. Во-первых, чтобы установить, что вклад

тм доминирует в скорости процесса релаксации, необходимо нали-

чие как отрицательной температурной зависимости \/Т

1р

, так и

равенства IJTi

и 1 JT

*. Доминирование T

в 1 JT

или в IJT

также может привести к возрастанию отрицательной температур-

ной зависимости скорости релаксации, но в этом случае

/Т

2р

> IJTip [76, 82]. Во-вторых, если для протонов воды в ряде ком-

плексов E •— M*+ — лиганд вклад тм доминирует в значениях

IJTi

или 1 JT

, то относительные числа гидратации могут быть

определены сравнением IJTi

—• (1IT

) при данной температуре,

только если для тм наблюдаются сходные энергии активации [82].

В-третьих, в большинстве случаев должны быть установлены вре-

мена корреляции диполь-дипольных взаимодействий (т

) между

ионом металла и магнитным ядром лиганда в комплексе E—М

ж+

—

лиганд. Если в качестве магнитных ядер используются протоны, то

часто величины, полученные для расстояния металл — лиганд, не

дают возможности идентифицировать лигандные группы, хотя и

согласуются с возможностью прямой координации. Эта проблема

может быть решена прямым определением т

из частотной зави-

симости IITi

и (или) IJT

, однако наилучшим решением проб-

* Поскольку доминирование тм в IyT

может сохраниться и после исчезно-

вения доминирования для l/T

, этот критерий может быть сформулирован более

точно либо как равенство

и 1/Т\р, либо как достижение равенства при

низкой температуре. Надо заметить, что такой подход применим только тогда,

когда металл обладает большим т„, например в случае Mn

Металлоферменты.

455

лемы является изучение парамагнитных эффектов на скорости

релаксации магнитных ядер (

O), которые близко располо-

жены к иону металла. В случае

C такой подход облегчается на-

личием больших химических сдвигов, наблюдаемых для этого

ядра.

2.3.2. Явление усиления и его применение

В исследованных к настоящему времени методом ядерного маг-

нитного резонанса (ЯМР) биологических системах много инфор-

мации дало изучение явления усиления, открытого Эйзингером

и др. [81] для комплексов ДНК с некоторыми парамагнитными

ионами, например Mn

+, Cr

+ и Cu

+, Кои и Леем [9, 21] для ком-

плексов различных ферментов с Mn

+ в присутствии или в отсут-

ствие субстратов. Фактор усиления для IIT

(ei) определяется из

следующего уравнения [81]:

UTtp l/H-l/rip)

~ UT

-UT

(6)

где 1/Тцо) — скорость релаксации, наблюдаемая в отсутствие па-

рамагнитного иона, а звездочкой отмечены скорости релаксации,

измеренные в присутствии макромолекулы. Фактор усиления для

1/7^2 (ег) определяется аналогично. В том случае если 1 /7"! измере-

но для протонов воды (СРП), то для ионов металла, например

+, наблюдается величина ei больше 1,0, причем т

зависит от

времени вращательной корреляции т

[81]:

j !_

_L (

Г M

В данной ситуации т

определяется временем полного поворота

молекулы комплекса. Поскольку высокомолекулярный комплекс

гораздо медленнее вращается, чем гидратированный ион металла

(акво-катион), образование такого комплекса может привести к

ei>1,0 при условии, что увеличение вклада времени корреляции

превышает уменьшение вклада в результате замены ионов воды

в ходе комплексообразования. И хотя в отдельных случаях т

мо-

жет определять величину т

как для акво-катионов, так и для вы-

сокомолекулярных комплексов, в большинстве случаев понижение

при образовании высокомолекулярного комплекса может быть

таким, что T

или тм становятся определяющими в значении т

В таком случае, следовательно, наблюдаемая для протонов воды

величина Ei не будет иметь большого значения. Аналогичные рас-

суждения можно привести и для фактора усиления скоростей ре-

лаксации протонов лиганда. Однако этот параметр может прине-

456

Г лава

сти пользу в качественной оценке, во-первых, доступности иона

металла для растворителя и, во-вторых, того, какую из трех воз-

можных ролей, описанных в разд. 1, выполняет ион металла в

ферментативной реакции. Как установлено Кон [21], фактор уси-

ления (ei) протонов воды для бинарного комплекса E-M

+ (еь)

может быть больше, чем £[ для тройного комплекса E — M

+ —

лиганд (тип II) (i£c). И наоборот, ферменты, образующие комплек-

сы E — лиганд — M

+ (тип I), проявляют небольшое взаимодейст-

вие фермент — ион металла (либо вообще его не проявляют) и

имеют величину е

>€ь«1,0, в то время как в комплексах M

+—

E — лиганд (тип III) лиганд может оказывать небольшое влияние

на окружение иона металла и еь~е

- Хотя эти закономерности

наблюдались для большинства комплексов типов I и II [21], из-

вестны исключения. Изучением скоростей релаксации протонов

субстрата в присутствии Mn

+-—фермента для ФДП-альдолазы

из дрожжей доказано существование мостиковых комплексов

E — Mn

+ — субстрат (разд. 9), хотя и наблюдались небольшие

изменения для Ei протонов воды при образовании этих комплек-

сов (т. е. еь~е

). Следовательно, хотя сравнение величины ei про-

тонов воды для бинарных и тройных комплексов фермента, метал-

ла и лиганда дает простой и быстрый метод определения типа

образующегося комплекса, однако эти результаты должны рассмат-

риваться как предварительные и подтверждаться с помощью дру-

гих методов, например определением г и A/h (константы сверхто-

нок взаимодействия) путем измерения скоростей релаксации маг-

нитного ядра лиганда. Быстрый метод определения констант дис-

социации комплексов дает также наблюдение за изменениями ei

протонов воды при взаимодействии фермента с Mn

+ и лигандом

[21].

2.4. Замена металла на другой металл

В большинстве исследований по металлактивированным фер-

ментам делались попытки оценить специфичность взаимодействия

либо изучением степени активации фермента различными ионами

металлов в стандартных условиях, либо в ряде случаев измере-

нием кажущихся констант активации и максимальных скоростей

для тех ионов металлов, которые вызывают существенную акти-

вацию. Из этих исследований можно сделать некоторые обобще-

ния. Например, большинство киназ и синтетаз активируются в

значительной степени только под действием Mg

+, Mn

+, Со

+ и

в некоторых случаях Ca

+, в то время как другие ферменты, на-

пример дегидрогеназы, лиазы, в большинстве случаев проявляют

более широкую специфичность по отношению к активации под

действием M

+. Подобные высокие степени активации под дейст-

вием Mg

+ или Mn

+ наблюдались во многих случаях, хотя в об-

Металлоферменты.

457

щем величина кажущейся KA ДЛЯ Mn

+ на порядок выше, чем для

+ (как и можно было бы ожидать из сравнения констант

устойчивости комплексов этих двух металлов с небольшими мо-

лекулами [3]).

По предположению Кон [21] наблюдение за поведением фер-

мента при добавлении Ca

+ может служить критерием для выбора

схемы координации. Ферменты, образующие комплексы E — суб-

страт — M

+, например креатинкиназы, активируются Ca

+, в то

время как на ферменты, образующие комплексы E — M

+ — суб-

страт, Ca

+ обычно действует как ингибитор. Основой этого эмпи-

рического критерия является быстрая скорость обмена лигандов

в Са

+-комплексах [84], поскольку для Ca

+ комплекс с мостико-

вым металлом неустойчив. Однако недавние исследования нукле-

азы стафилококка по связыванию Ca

+, а также рентгенострук-

турные работы показали, что этот ион взаимодействует с фермен-

том, включаясь в центр связывания нуклеотидов или очень близко

к нему [85, 86]. Следовательно, в данном случае, по-видимому,

имеет место образование мостикового комплекса фермент —

+ — нуклеотид, хотя не исключено и участие комплекса с фер-

ментом в качестве мостика (М

+ — Е —лиганд).

Аналогичные исследования по замещению металла были про-

ведены для таких металлоферментов, как карбоксипептидаза [6],

карбоангидраза [88], щелочная фосфатаза [89] и алкогольдегид-

рогеназа из печени [90]. Для всех этих ферментов замена иона

металла в природном ферменте другим металлом может быть до-

стигнута следующим образом: 1) получением апофермента и по-

следующей его рекомбинацией с ионом металла [4]; 2) прямой

заменой металла на металл в тщательно контролируемых усло-

виях [91] или 3) для ферментов микробного происхождения рос-

том микроорганизмов в среде, содержащей высокую концентрацию

металла, включение которого требуется в фермент [92]. Интерес-

но, что получение апофермента обычно сводится к обработке очи-

щенного природного фермента, например длительному диализу

против хелатирующих агентов [4], хотя апощелочная фосфатаза

была получена из Escherichia coli [93], а апогалактозооксидаза —

из Dactylium dendroides [93а], когда эти микроорганизмы были

выращены в условиях, «свободных от металла».

Сравнительное изучение каталитических свойств различных

металлоферментов в начале было главным образом ограничено

оценкой их относительной каталитической активности. Однако

детальное изучение катализа и связывания лиганда для серии

металлоферментов может пролить свет на роль иона металла, ес-

ли при отсутствии каталитической активности сохраняется связы-

вание металла. Этот подход был недавно использован для объяс-

нения наблюдаемой каталитической неактивности Cd(II)-щелоч-

ной фосфатазы [94].

458

Г лава 10

3. ДЕГИДРОГЕНАЗЫ

3.1. Содержание металла и некоторые общие подходы

при обнаружении и количественной оценке

ионов металла, связанных с белком

Общий вид реакций, характерных для этого класса ферментов,

изображен ниже:

X-H + НАД+ (НАДФ+) т—>- X + НАДН (НАДФН) + H+ (8)

Некоторые дегидрогеназы катализируют специфические виды этих

реакций и являются цинксодержащими металлоферментами; при-

мером могут служить алкогольдегидрогеназа из печени [95, 96,

96а] и из дрожжей [97], малатдегидрогеназа из сердца свиньи

[98] (см. [99]), глутаматдегидрогеназа из печени млекопитающих

[100] и лактатдегидрогеназа из скелетных мышц кролика [101].

Однако, за исключением алкогольдегидрогеназы, наличие связан-

ного цинка, в которой тщательно изучено [95—97], достоверность

остальных ранних сообщений вызывает сомнение. Так, при деталь-

ном изучении лактатдегидрогеназы из печени крысы [102] и серд-

ца свиньи [103], глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из мышц

кролика [104] и из дрожжей [105], глюкозо-6-фосфатдегидроге-

назы из дрожжей [106] и глутаматдегидрогеназы из печени быка

[106а] было продемонстрировано отсутствие в значительных ко-

личествах иона этого металла. Последние исследования глюкозо-

6-фосфатдегидрогеназы [104] показали отсутствие в очищенных

препаратах магния, кальция, хрома, марганца, железа, кобальта,

меди и молибдена.

Значительные трудности встретились при определении соотно-

шения металл — белок в алкогольдегидрогеназе из печени. Име-

ются сообщения, что этот фермент содержит либо 2 г-атома [97],

либо 4 г-атома [107, 108] цинка па 1 моль фермента. Алкоголь-

дегидрогеназа из печени содержит два центра связывания НАДН

[109, 110], в то время как фермент из дрожжей содержит четыре

центра связывания этого кофермента [111]. Недавно обширные

исследования [91] пролили свет на эту путаницу в отношении

стехиометрии соотношения цинк — белок и было однозначно по-

казано, что содержание цинка в алкогольдегидрогеназе из дрож-

жей составляет 4 г-атома/моль фермента, однако два из этих

атомов цинка играют в большей степени структурную, чем ката-

литическую роль [91, 107]. Однако при проверке этого вывода

изучением связи между содержанием цинка и каталитической

активностью были получены противоречивые данные [91, 108].

Эти разногласия не могут быть связаны с разными образцами

ферментов, так как изоферменты алкогольдегидрогеназы дрожжей

содержат одинаковое количество цинка [113].

Металлоферменты.

459

Множество проблем, описанных выше для алкогольдегидроге-

назы, не являются особенностью этого фермента. Аналогичные

трудности могут встретиться для любого металлофермента, если

не применять со всей строгостью критерии Вейлли [4], предло-

женные для идентификации таких ферментов, а именно: 1) проч-

ное связывание иона металла белком; 2) повышение соотношения

металл — белок и специфической активности фермента в ходе его

очистки; 3) постоянное число грамм-атомов металла на моль

очищенного фермента и 4) постоянное соотношение между содер-

жанием металла и содержанием кофактора (или его связывани-

ем). Хотя эти критерии вполне применимы для идентификации

простых металлоферментов, например алкогольдегидрогеназы из

дрожжей, в которой связанный металл и активные центры присут-

ствуют в эквимолярных количествах, они могут привести к ошиб-

кам в более сложных случаях, примером чего может служить

история исследований алкогольдегидрогеназы из печени. В по-

следнем случае получению ошибочных результатов также способ-

ствовала неопределенность в молекулярной массе и молярном

коэффициенте поглощения фермента [91], и надо заметить, что

неточность в определении этих параметров также приводит к оши-

бочному определению соотношения металл — белок.

Кроме ферментов, в которых весь связанный металл либо его

часть играют в большей степени структурную, чем каталитическую

роль, -известны ферменты, содержащие два различных металла,

которые, по-видимому, играют одинаковую каталитическую роль,

например алкогольдегидрогеназа, выделенная из дрожжей, выра-

щенных в присутствии CoCl

[92] (разд. 5). В таких случаях сме-

шанная стехиометрия может быть результатом либо наличия двух

металлоферментов в соответствующем соотношении, либо образо-

вания истинного гибридного металлофермента. Нет простых мето-

дов, чтобы установить разницу между этими двумя возможностя-

ми, кроме тех случаев, когда в результате замещения металла

происходит изменение свойств белка. И хотя включение несколь-

ких металлов в фермент является обычно результатом заранее

обдуманного введения этих металлов в пищу или в питательную

среду, однако такие же ситуации могут иметь место и в природе,

и, таким образом, могут возникать те же проблемы оценки числа

активных центров.

В том случае, если последней стадией очистки металлофермен-

та является его отделение от другого металлопротеина, содержа-

щегося в более высокой концентрации и содержащего тот же ме-

талл, описанный выше критерий (2) не может быть применен.

В данном случае повышение степени очистки фермента сопровож-

дается уменьшением соотношения металл — фермент, как и на-

блюдалось для цинка, связанного пируваткарбоксилазой из пе-

карских дрожжей [114]. Поскольку в таких ситуациях критерий

460

Г лава

(2) более неприменим, сравнение соотношения каталитической

активности и содержания белка и металла может быть осущест-

влено фракционированием очищенного фермента по размеру или

заряду частиц. При фракционировании на колонке очищенного

фермента постоянство соотношения металл — ферментативная ак-

тивность должно сохраняться по всему пику белка. Кроме того,

если в качестве метода разделения применяется гель-фильтрация,

пик, содержащий металл, должен выходить в соответствии с мо-

лекулярной массой (или стоксовым радиусом) фермента и с уче-

том свободного объема колонки.

Трудно переоценить важность применения перечисленных выше

критериев для идентификации металлоферментов. Действительно,

правильная информация не может быть получена простым опре-

делением содержания металла в ферментах различной степени

очистки. Следует отметить, что данные, полученные при исследо-

вании ингибирования или активации ферментов металлхелатирую-

щими агентами, взаимодействующими со связанными металлами,

могут привести к ошибочной интерпретации. Например, причины

инактивации фермента при его инкубации с 1,10-фенантролином

могут быть следующими: взаимодействие хелатирующего агента

со связанным ионом металла или его удаление; окисление сульф-

гидрильных групп (как было продемонстрировано для ФДП-аль-

долазы [115]); включение в гидрофобную область белка плоской

молекулы 1,10-фенантролина. Было показано также, что актива-

ция фруктозо-1,6-дифосфатазы и замедление агрегации вируса

табачной мозаики, происходящие в присутствии ЭДТА, по-видимо-

му, не являются результатом взаимодействия ЭДТА со связанны-

ми ионами металла [116, 117]. В других случаях активация под

действием ЭДТА или других хелатирующих агентов может быть

обусловлена удалением ингибирующих ионов металла в ходе вы-

деления фермента [118]. Хотя эффекты ингибирования хелатирую-

щими агентами наблюдались для многих дегидрогеназ [119, 120],

только алкогольдегидрогеназа была достоверно классифицирована

как металлофермент.

3.2. Каталитическая роль связанного металла

Хотя каталитическая роль связанного цинка в алкогольдегид-

рогеназе изучалась в течение последних двух десятилетий, эта

проблема осталась неразрешенной, несмотря на то, что были вы-

двинуты многочисленные предположения [121]. Были предложе-

ны механизмы, в соответствии с которыми цинк алкогольдегидро-

геназы принимает участие в связывании субстратов [122, 123],

коферментов [121, 124] и субстратов и коферментов одновремен-

но [125, 128]. Более того, в этих различных гипотезах [124—128]

были предложены все возможные центры координации ионов ме-

Металлоферменты.

461

талла с НАД+. До сих пор не была предположена всего лишь од-

на оставшаяся возможность (см., однако, работу Уильямса и Вейл-

ли [129]), когда цинк не участвует непосредственно во взаимо-

действии ни с субстратами, ни с коферментом. Так как подобная

путаница часто возникает при попытках интерпретации косвенных-

доказательств, представляет интерес обсудить имеющиеся данные.

Изучение начальных скоростей для алкогольдегидрогеназы из:

дрожжей [130] или из печени [131] показало, что обратимое ин-

гибирование 1,10-фенантролином является конкурентным для

НАД+ (НАДН) и неконкурентным по отношению к субстратам.

Эти данные по ингибированию были интерпретированы Вейлли

[121] как указание на то, что связанный цинк взаимодействует

только с НАД+ (НАДН) и не играет роли в связывании с субст-

ратом. Эта интерпретация была подвергнута сомнениям по двум

причинам. Во-первых, Дэлзиел [132] указал на то, что приведен-

ные примеры ингибирования согласуются также с предположени-

ем, что цинк связывается одновременно и с субстратом и с кофер-

ментом. Однако рассмотрение последовательности реакций, пред-

ложенной для алкогольдегидрогеназы (9) [133—135], показывает,

что данные по ингибированию не дают возможности однозначно

определить центры связывания субстрата или кофермента:

НАД

OH CH

CHO НАДН

В соответствии с последовательным механизмом (9) любой инги-

битор, реагирующий со свободным ферментом (E), должен прояв-

лять себя как конкурентный по отношению к НАД+(НАДН) и не

являться конкурентным по отношению к субстратам [60]. Конку-

рирующее поведение по отношению к НАД+ или НАДН подразу-

мевает конкуренцию на тех же участках фермента, но не обяза-

тельно на тех же активных центрах. Во-вторых, аналоги 1,10-фе-

нантролина, например 1,5-фенантролин, 5,6-(или 7,8)-бензохино-

лин, не являющиеся хелатирующими агентами, тем не менее кон-

курентно ингибируют НАД+ и столь же или даже более активны,

чем 1,10-фенантролин [136]. Как 1,5-, так и 1,10-фенантролин да-

ют при взаимодействии с алкогольдегидрогеназой из дрожжей

одинаковые дифференциальные спектры, однако только 1,10-фе-

нантролин показывает такой же спектр при взаимодействии с

[Zn(H

]

+ [136]. Центр связывания 1,10-фенантролина на ал-

когольдегидрогеназе определяют как место взаимодействия фер-

мента с никотинамидным кольцом НАД+. Это устанавливается

изучением взаимодействия между этим ингибитором и аналогами

462

Г лава

части молекулы НАД+, которые сами по себе являются конкурент-

ными ингибиторами НАД+, например N'-метилникотинамидхлори-

дом [137] и АДФ-рибозой [138]. Однако, учитывая, что хелати-

рующие свойства не коррелируют с эффективностью ингибирова-

ния, возможно, что связывание в большей степени является

результатом гидрофобных взаимодействий, чем координации со

связанным цинком. Далее, некоторую ясность вносят исследования

связывания НАД+ и аналогов НАД+ со свободной от цинка апо-

алкогольдегидрогеназой. При выделении апофермента диализом

против ЭДТА при рН 6,0 удаление связанного цинка не сопровож-

дается изменениями в степени связывания НАД+ алкогольдегид-

рогеназой [139]. Однако другие исследования показали линейную

зависимость между содержанием цинка и связыванием НАД+

(или АДФ-рибозы) при удалении связанного цинка диализом при

рН 5,0 [108]. Известно, что алкогольдегидрогеназа неустойчива

при низких значениях рН [91] и наблюдаемое уменьшение спо-

собности к связыванию НАД+ может являться результатом вто-

ричных изменений в конформации фермента, происходящих при

удалении связанного цинка [140].

Хотя эти данные, по-видимому, свидетельствуют против широ-

ко признанной роли цинка в этой металлдегидрогеназе, т. е. про-

тив образования комплекса фермент — Zn

+ — НАД(НАДН)

[121], они недостаточны для определения истинной каталитиче-

ской роли этого металла. Результаты, полученные Милдваном и

Винером [122, 141], могут быть интерпретированы в пользу об-

разования комплексов фермент — Zn

+ — субстрат [8], хотя, учи-

тывая имеющиеся данные, такая интерпретация является доволь-

но рискованной. В этих исследованиях при использовании спин-

меченого аналога АДФ-рибозы было определено расстояние между

неспаренным электроном спиновой метки и протонами субстрата

[121]. Если бы Zn

+ в центре связывания металла можно было за-

менить на парамагнитный ион металла, то можно было бы мето-

дом ЭПР измерить степень спин-спинового взаимодействия и, та-

ким образом, определить расстояние между спиновой меткой и

связанным металлом [72, 74а] (разд. 2.2). Опубликовано сообще-

ние о замене Zn

+ на Со

+ в алкогольдегидрогеназе из печени, и

при этом Со

+-фермент проявлял каталитическую активность [90].

Аналогичная замена Zn

+ на Mn

+ может непосредственно проде-

монстрировать наличие мостикового комплекса E—M

+ — субст-

рат изучением скоростей ядерной магнитной релаксации протонов

субстрата (разд. 2.3). Возможно использование ЯМР

Cl для изу-

чения влияния субстратов и коферментов на свойства связанного

цинка в нативном ферменте [143]. Этот метод был использован

для изучения связанного Zn

+ в пируваткиназе [144], и он являет-

ся одним из немногих методов изучения окружения диамагнит-

ного атома цинка.