Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Металлоферменты. 473

ше на СРП воды (еб=14—33), которое снижается при добавле-

•ши или ФЕП, или НДФ (ФЕП-карбоксикиназа, пируваткиназа)

[35, 38, 222]. В случае ФЕП-карбоксилазы это снижение еьявляет-

:я временным, так как в этих же условиях протекает вся реакция

[222]. Эти последние данные предполагают, но не доказывают, что

общей чертой этих механизмов реакции является образование мо-

стикового комплекса фермент — Mn

+ —- ФЕП, как показано на

Рис. 14.4. Возможный механизм действия ФЕП-карбоксилазы, описывающий

роль M

+ в ферментах карбоксилирования ФЕП и в пируваткиназе [222].

рис. 14.4 для ФЕП-карбоксилазы. Исследования, продемонстри-

ровавшие образование мостикового комплекса пируваткиназа —

+ — субстрат, обсуждаются в гл. 18. СРП-исследования

ФЕП-карбоксикиназы [222] показали еще один подвох при интер-

претации таких данных. Отрицательный температурный коэффи-

циент наблюдался для XlTi

протонов воды в присутствии как

E — Mn

+, так и тройных комплексов с ФЕП и НДФ. Следователь-

но, предполагая доминирующее влияние х

на 1 IT

(разд. 2.3),

соотношение е

/еь (при 25°С) было использовано для вывода, что

НДФ заменяет одну, а ФЕП — две молекулы воды в координа-

ционной сфере Mn

+, связанного с ферментом. Однако для этих

трех комплексов наблюдается большая разница в энергиях акти-

вации для Iyr

протонов воды [222]. В этой ситуации вычислен-

ное для любой данной температуры соотношение ег/еь является

ошибочным и по отношению к схеме координации [82], и, таким

образом, механизм на основе этих данных для ФЕП-карбоксики-

назы [222] является неверным.

Недавно проведенные исследования также дают повод для сом-

нений относительно места, которое занимает ФЕП-карбоксифосфо-

трансфераза в этой гомологичной группе ферментов. Данный фер-

мент очень чувствителен к ингибированию широким набором хела-

тирующих агентов, например ЭДТА, 1,10-фенантролином, CN

[226]. Изучение ингибирования ЭДТА различных стадий и учет

влияния других хелатирующих агентов показывают, что образо-

474

Г лава

вание комплекса фермент — ФЕП требует связанного иона метал-

ла [227]. Однако прямые попытки продемонстрировать присутст-

вие связанного металла в этих ферментах до сих пор давали лишь

двусмысленные и неопределенные результаты [228].

5.3. Рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилаза

Карбоксилирование рибулозо-1,5-дифосфата, в результате ко-

торого образуются 2 моля 3-фосфоглицерата [реакция (23)], ка-

тализируется ферментом, который, как принято считать, требует

активации ионом двухвалентного металла [229, 230] (однако см.

Андерсон и др. [231]):

Рибулозо-1,5-дифосфат -f-CO

> 2,3-фосфоглицерат + H

(23)

Потенциальный ингибитор, 2-карбоксирибит-1,5-дифосфат (I), ко-

торый является аналогом предполагаемого промежуточного про-

дукта в реакции рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы (II) [232],

прочно связывается с ферментом только в присутствии M

+ [233]:

OP CH

I I I

C(OH)COO- C(OH)COO" C(OH)CN

C=O H-C-OH н—с—он

I I I

н—с—он н—с—OH Н—С—OH

Л I

OP CH

II I III

Однако прочное связывание рибулозо-1,5-дифосфата в присутствии

CN- [возможно, в виде аддукта рибулозо-1,5-дифосфатцианида

(III)] не требует присутствия M

+ [234]. Эти данные позволяют

предположить, что M

+ играет роль в стабилизации промежуточ-

ного соединения II в реакции рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы.

Более ранние сообщения об образовании стабильного комплекса

фермент — Mg

+—CO

не подтвердились [233].

Кроме того, было показано, что связанный Cu

+ является

структурным компонентом рибулозодифосфаткарбоксилазы из

шпината [236]. Этот связанный ион металла не играет непосред-

ственной роли в механизме катализа, так как его удаление не вы-

зывает уменьшения каталитической активности. Однако наблюда-

лись некоторые тонкие изменения при связывании природным

ферментом рибулозодифосфата плюс цианид или 2-карбоксирибит-

дифосфата по сравнению с ферментом, свободным от Cu

+ [233].

Следовательно, связанный Cu

+ участвует в поддержании конфор-

мации рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы.

Металлоферменты.

475

5.4. Декарбоксилазы

Помимо металлактивируемых оксалатдекарбоксилаз (разд.

>.1), имеется ряд других декарбоксилаз, которым необходима ак-

ивация M

+, например оротидин-5-фосфатдекарбоксилаза [237],

шридоксиндекарбоксилаза [238]. Роль ионов двухвалентных ме-

•аллов в механизме действия этих декарбоксилаз детально не ис-

:ледована. Однако следует заметить, что необходимость иона ме-

талла является скорее исключением, чем правилом среди фермен-

тов этого типа [239].

6. ТИАМИНПИРОФОСФАТЗАВИСИМЫЕ ФЕРМЕНТЫ

Ферменты, использующие ТДФ как кофактор, катализируют ре-

акции, в которых расщепление углерод-углеродной связи (или ее

синтез) сопровождается образованием аддукта между частью рас-

щепленного субстрата и ТДФ; примером могут служить ферменты

декарбоксилирования а-кетокислот, транскетолазы, фосфокетола-

зы, глиоксалаткарболигазы [240]. Для многих ТДФ-зависимых

ферментов требуется активация ионом M

+ [240], однако имеется

ряд примеров, где для работы ферментов этого типа либо вообще

не требуется присутствия ионов M

+, как, например, для транске-

толазы из печени крысы [241], бензоилформиатдекарбоксилазы

[242], либо проявляется только частичная зависимость активно-

сти от добавления M

+, как, например, для пируватдекарбоксила-

зы из ростков пшеницы [243], оксидазы а-кетокислот с разветвлен-

ной цепью [243а, 244]. Наблюдалось широкое разнообразие в ха-

рактере взаимодействия этих апоферментов с ТДФ и (или) M

Эти кофакторы связываются очень прочно с некоторыми ТДФ-за-

висимыми ферментами, например с пируватдекарбоксилазой, и

удалить их можно только в специальных условиях [245]. В противо-

положность другим ферментам оксалил-КоА-декарбоксилаза и

глиоксалаткарболигаза, не проявляющие активности в отсутствие

ТДФ и M

+, связываются с кофакторами обратимо [246, 247а]. Ес-

ли фермент после отделения ТДФ оказывается лишенным связан-

ного M

+, как в случае с пируватдекарбоксилазой из ростков

пшеницы [243], нельзя сделать вывода, нужен ли M

+ наряду с

ТДФ для активации полученного апофермента.

Изучение пируватдекарбоксилазы [248] подтвердило предпо-

ложение о включении M

+ в образование комплекса фермент —

ТДФ [249]. После отделения природного фермента от ТДФ и Mg

холофермент может снова образоваться лишь при инкубации апо-

фермента с избытком ТДФ и M

+ [250]. Как скорость образова-

ния, так и стабильность полученного холофермента зависит от

природы иона двухвалентного металла, хотя каталитическая ак-

476

Г лава 10

тивность одинакова для всех изученных M

+ (Ca

+, Mg

+, Mn

/Ca

Со

+). Например, комплекс E и образуется, и диссоциируе

ТДФ

быстрее, чем соответствующий Mg

+-кoмплeкc [250], как и был

предсказано из изучения свойств простых комплексов этих ионо

металлов [84]. Исследование концентрационных зависимостей прс

цессов рекомбинации показало, что ТДФ и Mg

+ взаимодействую

независимо с апоферментом и первоначально образуется диссоци

ирующий тройной комплекс (IV), который затем в результате мед

ленной и квазинеобратимой реакции превращается в другой трой

ной комплекс (V), который и является каталитически активныл

холоферментом [251]:

,E-Mg

ТДФ ТДФ

E E <—" E (24)

Ч-ТДФ^

а+ x

IV V

Превращение IV в V можно блокировать действием ЭДТА [244].

Однако еще не определены ни природа медленной реакции прев-

ращения IV в V, ни какие-либо группы ТДФ, которые являются

лигандами по отношению к иону металла. Кроме того, неясно, при-

меним ли механизм реакции, предложенный в уравнении (24), к

другим ТДФ-зависимым ферментам, особенно к тем, в которых

этот кофактор легко диссоциирует, например к глиоксалаткарболи-

газе [246, 247], или же в этом случае ион металла не только облег-

чает связывание с ТДФ, но и играет какую-то дополнительную

роль в реакции.

7. ИЗОМЕРАЗЫ

7.1. Пентозизомеразы

Ферменты, катализирующие изомеризацию таких Сахаров, как

L- и D-арабиноза [252, 253], D-ксилоза [254], D -ликсоза [255] и

ь-рамноза [256], согласно уравнению (25), проявляют максималь-

ную активность только в присутствии иона двухвалентного метал-

ла, например Mn

+, и в большинстве случаев неактивны в отсутст-

вие M

альдопентоза < > кетопентоза (25)

Металлоферменты.

477

!ногие эти ферменты действуют менее эффективно в Качестве гек-

озизомераз. Изотопные исследования ряда пентозизомераз ука-

ывают на промежуточное образование цыс-ендиолов в ходе реак-

ции [257]:

н>У

он н он

^ — I — W

,.-С

OH !с он X о

В реакции (26) электрофильный агент, например M

+, должен об-

легчать реакцию путем поляризации карбонильной группы альдо-

зы или кетозы в ходе образования промежуточного цыс-ендиольно-

го производного [257].

Механизм активации этой группы ферментов под действием M

наиболее тщательно был изучен для о-ксилозизомеразы, которая

активируется Mn

+, но практически неактивна в присутствии Mg

[258]. Изучение начальных скоростей позволило предположить, что

мостиковый комплекс фермент — Mn

+ — D-ксилоза образуется

главным образом при добавлении D-ксилозы вслед за Mn

[259] (рис. 14.1, II, А). Это предположение об образовании комп-

лекса с мостиковым металлом было подтверждено ЯМР-исследова-

ниями [260]. Мп

-ксилозизомераза оказывает повышенное влия-

ние на I/Ti

протонов воды (еь=4), которое уменьшается при

добавлении как субстратов (D-ксилоза, D-глюкоза), так и инги-

биторов ( D-КСИЛИТ, D-сорбит) в диапазоне концентраций, соответ-

ствующем константам диссоциации, которые получены при изуче-

нии начальных скоростей [259]. Фермент также усиливает влияние

+ на скорости релаксации протона при C-I ксилозы. На ос-

новании изменений

/Т

р этого протона можно определить расстоя-

ние от Mn

+ до протона при С-1, равное 5,3±2,4 А,

что соответствует непосредственному связыванию D-КСИЛО-

зы через C-I с образованием мостикового комплекса фермент —

+ —субстрат [260]. Возможно, что в связывании участвует гид-

роксильная группа и (или) кислород гликозидного кольца, хотя

детальная структура этого комплекса не определена. Механизм,

описывающий роль M

+ в этой реакции, был предложен, основы-

ваясь на такой структуре мостикового комплекса, в которой обе

эти группы связаны как лиганды с ионом металла [8]. Интересно,

что в этих исследованиях изучался реакционноспособный комплекс,

что было возможно благодаря равновесному соотношению альдо-

за : кетоза, равному примерно 3 : 1 (рН 7,0) [258]. Всего лишь еще

один реакционноспособный объект был изучен так же тщательно

ЯМР-методом — это мостиковый комплекс пируваткарбоксилаза—

+ — оксалоацетат [194] (разд. 5.1).

478

Г лава

Необходимо заметить, что п-ксилозизомераза обратимо дезак

тивируется при добавлении хелатирующих агентов, наприме

ЭДТА или 1,10-фенантролина [261], хотя и не доказано наличи

связанного иона металла в этом ферменте.

7.2. Гексозо- и пентозофосфатизомеразы

В противоположность пентозизомеразам большинство гексозо

или пентозофосфатизомераз полностью активны в отсутствие HOHOI

двухвалентных металлов, хотя в нескольких случаях изотопны*

исследования указывают на промежуточное образование цис-ен

диольного производного [261а]. Недавно фосфоманнозизомеразг

из дрожжей была строго идентифицирована как цинксодержащш

металлофермент, в котором ферментативная активность зависит от

присутствия связанного иона металла [262]. И хотя факт непосред-

ственного участия Zn

+ в механизме катализа не установлен, за-

манчивым является предположение, согласно которому этот ион

металла играет ту же роль, которая предложена для Mn

+ в реак-

циях, катализируемых D-ксилозизомеразой [8]. В противополож-

ность ферменту, выделенному из дрожжей, фосфоманнозизомера-

за из красных кровяных телец является металлактивируемым фер-

ментом [262а]. Это наблюдение, а также тот факт, что Zn

+ уско-

ряет неферментативную изомеризацию маннозо-6-фосфата во

фруктозо-6-фосфат [2626], должны помочь разъяснить роль M

в ферментативной реакции.

Другие гексозо- и пентозофосфатизомеразы, например фосфо-

глюкозизомераза [262, 263] и фосфорибозизомераза [264], не со-

держат связанного иона металла, хотя для фосфоглюкозизомеразы

[261а] было показано промежуточное образование ^ис-ендиольно-

го производного. Возможно, что в этих ферментах вместо M

+ име-

ется другой электрофильный центр.

7.3. Другие изомеразы

Описан ряд изомераз, действующих на другие субстраты и про-

являющих частичную необходимость в активации ионами двухва-

лентных металлов. Примером могут служить изопентилпирофосфа-

тизомераза [265], цис.цис-муконатлактоназа [266], оксалоацетат-

кетоенолтаутомераза [267] и манделатрацемаза [267а]. До сих

пор не проводилось детальных исследований по выяснению роли

ионов металлов в этих реакциях.

8.МУТАЗЫ И ТРАНСФЕРАЗЫ

8.1. Фосфоглюкомутаза и другие мутазы

Ферментам, которые катализируют реакции переноса между

двумя атомами углерода в гексозо- или пентозофосфатах (мута-

зы), необходим для активации ион двухвалентного металла, как

Металлоферменты.

479

[оказано в реакции (27) [268—270] для фосфоглюкомутазы, хотя

фугие мутазы полностью активны и в отсутствие M

+ (например,

|эосфоглицератмутаза [271]):

глюкозо-1,6-дифосфат, M

глюкозо-1-фосфат глюкозо-6-фосфат (27)

Ход реакции, катализируемой фосфоглюкозомутазой и установ-

ленный на основании изучения начальных скоростей, изображен на

£+

глюпозо-1,В-дифосфат

E- глюкозо-1,6-дифосфат

,ф глюкозо-1- фопфот\\ ф ф

/ <=± / <

V . E

+ N \ +

глюкозо-1-фосфат

глюкозо-6- фосфат глюкозо-6-фосфат

Рис. 14.5. Ход реакции, катализируемой фосфоглюкомутазой (Ф—фосфат) [272].

рис. 14.5 [272]. Эти же исследования показали, что Mg

+ может

быть добавлен как к фосфо- или дифосфоферментам, так и к любо-

му из промежуточных комплексов. При этом оказалось безразлич-

ным, добавлять ли Mg

+ и глюкозо-1-фосфат (или глюкозо-6-ди-

фосфат) к фосфоферменту или Mg

+ и глюкозо-1,6-дифосфат к не

содержащему фосфора ферменту [273]. Однако скорость отщеп-

ления Mg

+ от любой из этих форм фермента примерно на три

порядка меньше скорости диссоциации Mg-комплекса любого из

гексозофосфатов [274]. Таким образом, обычные выводы, следую-

щие из отсутствия влияния порядка добавления реагентов на ско-

рости реакций, становятся несостоятельными, поскольку фосфоглю-

комутаза в данных условиях ведет себя как комплекс фермент—

Ранее предполагалось, что фосфоглюкомутаза проявляет час-

тичную активность и в отсутствие M

+ [275], а также что предва-

рительная инкубация с Mg

+ плюс хелатирующий агент приводит

к зависящей от времени активации этого фермента [275]. Теперь

известно, что эти эффекты являются результатом присутствия в

виде примесей прочно связанных ионов металлов [274]. После уда-

ления ионов металлов образовавшийся каталитически неактивный

апофермент проявляет широкую специфичность к активации M

причем наиболее эффективным являются Mg

+ и Ni

+ [277]. Эф-

фективность активации коррелирует со скоростью диссоциации

комплекса фермент — M

+. Так, Mg

+, который является наиболее

эффективным активатором, и отщепляется от комплекса с наиболь-

480

Г лава

шей скоростью [277]. Некоторые менее эффективные ионы, напри

мер Mn

+, Cd

+, Zn

+, взаимодействуют с фосфоглюкомутазой i

образованием двойных комплексов, которые проявляют себя Kai

металлоферменты, в противоположность двойному комплекс]

+ — фосфоглюкомутаза. Имеются данные, указывающие на не

большое различие в механизме катализа между металлактивируе'

мыми ферментами и металлоферментами в случае фосфоглюкому

тазы [277].

Попытки определить роль M

+ в реакциях, катализируемых

фосфоглюкомутазой, путем сравнения свойств различных металло-

фосфоглюкомутаз не имели успеха. Все изученные ионы металлов

давали одинаковые дифференциальные спектры при взаимодейст-

вии с апоферментом, и это взаимодействие сопровождалось неболь-

шими изменениями конформации фермента, что было показано

путем замены растворителя [278]. Дифференциальные спектры,

отвечающие образованию промежуточного комплекса (рис. 14.5),

изменяются при добавлении ионов металлов, причем степень изме-

нения этих спектров в районе тирозина обратна эффективности

активации различными M

+ [279].

Недавно были измерены скорости ядерной магнитной релакса-

ции протонов воды в присутствии как Мп(П)-фосфоглюкомутазы,

так и тройных комплексов этого фермента с различными субстра-

тами [279а]. Эти исследования показали, что при образовании

тройных комплексов координационные молекулы воды при Mn(II)

замещаются на прочно связывающиеся субстраты, например глю-

козофосфат или ксилозофосфат. Однако замены координационной

воды при Mn

+ не происходит, если образуется тройной комплекс

или с довольно прочно связанными субстратами, например с фрук-

тозофосфатом, галактозофосфатом или с неорганическим фосфа-

том, который является конкурентным ингибитором фосфоглюкому-

тазы [2796].

Эти исследования показали, что ион металла может играть как

непосредственную, так и непрямую роль в ориентации субстратов

в каталитическом центре, а также что активатор не принимает

прямого участия в каталитическом процессе. Однако, поскольку

фосфоглюкомутаза не проявляет активности в отсутствием

+[277],

очевидно, что для проявления каталитической активности необхо-

димо сохранение конформации активного центра, которая зависит

от присутствия M

+ [279].

8.2. Трансферазы

Описаны многие нуклеотидил- и пентозилтрансферазы, которым

необходима активация ионом двухвалентного металла [обычно

+ и (или) Mg

+] [280], однако нет исследований, проливающих

свет на роль иона металла в реакциях этого типа.

Металлоферменты 481

9. АЛ ЬДOJlАЗЫ

ФДФ-альдолазы, которые катализируют реакцию (28), могут

лть разделены на два основных класса.

ФДФ < > диоксиацетонфосфат

-j-

глицеральдегид-3-фосфат (28)

ласс II ФДФ-альдолаз, обнаруженный в грибах, бактериях,

рожжах и сине-зеленых водорослях, в значительной степени пи-

кируется в присутствии таких хелатирующих агентов, как ЭДТА

1,10-фенантролин [280, 281]. Подобное действие хелатирующих

гентов было объяснено участием связанных ионов металлов в ка-

ализе альдолазами класса II [281]. Это предположение подтверж-

ается тем фактом, что ФДФ-альдолаза из дрожжей содержит

вязанный цинк в соотношении примерно 2 г-атома на 1 моль фер-

[ента [282, 283]. Хотя большинство ФДФ-альдолаз класса II ведет

ебя как металлоферменты, некоторые ферменты этого класса об-

разуют менее стабильные комплексы с M

+ и могут быть выделены

I виде апоферментов. Так, для ФДФ-альдолаз, выделенных из Clo-

:tridium perfringens [284] и Anacystis nidulans [285], необходима

жтивация добавлением M

+, например Fe

+, Со

В отличие от этого класса ФДФ-альдолазы класса I, характер-

гые для высших животных и растений, простейших и кишечнопо-

лостных, нечувствительны к ингибированию хелатирующими аген-

тами и не содержат связанного иона металла [280, 281]. ФДФ-аль-

долазы класса I проявляют типичную субстратзависимую

инактивацию при выдерживании комплекса фермент — диоксиаце-

тонфосфат в боргидриде [286]. Инактивация происходит в резуль-

тате восстановления основания Шиффа, которое образуется при

конденсации диоксиацетонфосфата с е-ЫН

-группой остатка лизина

в активном центре фермента [287]. В соответствии с этим механиз-

мом действия ФДФ-альдолаз класса I основания Шиффа играют

роль электрофильных центров и заменяют ион металла, который

играет эту роль в случае ФДФ-альдолаз класса II [281,

288]. Это предположительное сходство механизмов действия про-

иллюстрировано на рис. 14.6 и подтверждается тем, что ФДФ-аль-

долазы класса I и II катализируют сходные реакции обмена

H и

O в субстратах [288]. Сходство механизмов действия оснований

Шиффа и связанных с ферментом ионов металла, изображенное

на рис. 14.6, распространяется и на другие типы реакций, особен-

но на декарбоксилирование а-кетокислот [28, 289, 289а]. Для та-

кого сходства механизмов действия ФДФ-альдолаз необходимо,

чтобы ферменты класса II образовывали мостиковый комплекс

фермент

—-

+ — субстрат.

При удалении из ФДФ-альдолазы из дрожжей связанного цин-

ка с помощью диализа против ЭДТА получен каталитически не-

активный апофермент, молекулярные свойства которого сходны со

29—2451

482 Г лава

свойствами холофермента [290]. Апоферменту может быть возвр

щена активность путем инкубации как с ионами Со

+, Fe

+, Mn

+, так и с Zn

+, причем образуется серия металлоальдолаз. 3

мена природного Zn

+ на другие M

+ приводит к заметным измен

ниям в максимальных скоростях катализа. Однако такое замещ

ние не изменяет существенным образом ни значения Км для ФДс

А. Класс I

Рис. 14.6. Сравнение стадий механизмов реакций, предложенных для ФДФ-аль-

долаз классов I и II [281, 288, 289а].

ни степени активации под действием K

[291]. Эти данные показы-

вают, что ион металла участвует в скоростьлимитирующей стадии

реакции, но мало, либо вообще не играет никакой роли в поддер-

жании активной конформации фермента. Mn

+- и Со

+-альдолазы

были изучены методом ЯМР; в результате этих исследований од-

нозначно показано существование мостикового комплекса фер-

мент— M

+ — субстрат, участвующего в механизме, изображенном

на рис. 14.6. Хотя СРП-исследования не показали взаимосвязи

между эффектом усиления и связыванием Mn

+ в двойных и трой-

ных комплексах, которую можно было бы ожидать для комплек-

сов с мостиковым металлом (ср. разд. 2.3) [83], образование та-

ких комплексов однозначно доказано измерением скоростей релак-

сации протонов ФДФ и диоксиацетонфосфата. Найденное расстоя-

ние Mn

+ — протоны субстрата (из l/Ti

) и константа сверхтонкого

взаимодействия (из 1/Т

2р

и 1/Т\

) согласуются с предполагаемым

образованием тройного комплекса [292]. Более того, сравнение