Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Ионофоры — хелатирующие агенты для щелочных металлов

273

72а. Miteher L. A., Shayand A. J., Bohonos Л'., Appl. Microbiol., 15, 1002 (1967).

73. Hassall С. H., Magnus К. E., Nature, 184, 1223 (1959).

74. Bevan К, Davies J. S., et al., Experientia, 26, 122 (1970).

75. Goodall M. C., Nature, 225, 1258 (1970).

76. Eisenman G., Ciani 5., Szabo G., J. Memb. Biol., 1, 294 (1969).

77. Haney M. E., Hoehn M. M., Antimicrobial Agents and Chemotherapy-1967,

1968, 349.

78. Agtarap A., Chamberlin J. W., Pinkerton M., Steinrauf L. K., J. Am. Chem.

Soc., 89, 5737 (1967).

79. Pinkerton M., Steinrauf L. K-, J. Mol. Biol., 1970, 49.

80. Steinrauf L. K-, Pinkerton M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 33, 29

(1968).

81. Kubota T., Matsutani S. et al., Chem. Commun., 1968, 1541.

82. Gachon P., Kergomard A.. Veichcnzbre H., Esteve C., Staron T., J. Chem. Soc.

(D), 1970, 1421.

83. Alleaume A., Hiekel D., J. Chem. Soc. (D), 1970, 1422.

84. Berger !., Rachlin A. I., Scott W. E., Sternbach L. H., Goldberg M. W., J. Am.

Chem. Soc., 73, 5295 (1951).

85. Johnson S. M., Herrin J., Liu S. /., Paul I. C., J. Am. Chem. Soc., 92, 428

(1970).

86. Pressman B. C., in «Wirkungsmechanismen von Fungiziden und Antibiotika»

(Biologische Qesellschaft der D. D. R., Sektion Microbiologic), Academie Ver-

lag, Berlin, 1967, p. 3.

87. Harold F. M., Baarda 1., Bacteriology, 94, 53 (1967).

88. Harold F. M., Bact. Rev., 1969, 45.

89. Higgens C. E., Westhead J. E., Gorman M., Hamill R. L., Antimicrobial

Agents and Chemostherapy-1968 (1969).

90. Sliumard R. F., Callender M. E., Antimicrobial Agents and Chemotherapy-1967,

1968, 369.

91. Stafanac Z., Simon W., Microchem. J.. 12, 125 (1967).

92. Pioda L. A. R.. Simon W., Chimia (Switzerland), 23, 72 (1969).

93. Frant M. S., Ross J. W., Science, 167, 987 (1970).

94. Wenner C. E., Harris E. J., Pressman B. C., J. Biol. Chem., 242, 3454 (1967).

95. Gordon E. E., Nordenbrand K, Ernster L., Nature, 213, 82 (1967).

96. Gordon E. E., Bernstein J., Biochim. Biophys. Acta, 205, 464 (1970).

97. Packer L., Allen J. M., Starks M., Arch. Biochem. Biophys., 128, 142 (1968).

98. Shavit N., San Pietro A., Progress in Photosynthesis Research, 3, 1392 (1969).

99. Karlish S. J. D.. Avron M.. FEBS Letters, 1, 21 (1968).

00. Karlisch S. J. D., Avron M., Eur. J. Biochem., 9, 291 (1969).

01. Shavit N., San Pietro A., Biochem. Biophys. Res. Commun., 28, 277 (1967).

.02. Shavit N., Thore A., Keister D. L., San Pietro A., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S.,

59, 917 (1968).

03. Jackson J. B., Crofts A. R., Von Stediggk L. V., Eur. J. Biochem., 6, 3499

(1968).

.04. Junge W.. Witt H. T. 1. Naturforsch., 23b, 244 (1968).

05. Nishimura M., Pressman B. C., Biochemistry, 8, 1360 (1969).

.06. Chappell J. B., C-ojls .4. R., in J. M. Tager et al., (eds.), Regulation of Meta-

bolic Processes in Motochondria, Biochim. Biophys. Acta Library, Amsterdam.

Vol. 7, 1966, p. 293

.07. Harris E. J.. Pressman B. C., Nature, 216, 918 (1967).

08. Tosteson D. C., Andreoli T. E., Tieffenberg E., Cook P., J. Gen. Physiol., 51,

373S (1968).

09. Wyssbrod H. R . Biochim. Biophys. Acta, 193, 361 (1969).

10. W'illbrandt W.. Rosenberg T., Pharmacol. Rev., 13, 109 (1961).

11. Blount J. F., Westley J. W., Chem. Commun., 1971, 927.

12 Czerwinsky E. W., Steinrauf L. K., Biochem. Biophys. Res. Commun., 45, 1284

(1971).

8—2451

ГЛАВА 7

КОМПЛЕКСЫ МЕТАЛЛОВ

С БЕЛКАМИ

Е. Бреслоу

Breslow Esther, Department of Biochemistry, Cornell

University Medical College, New York, USA

1. ВВЕДЕНИЕ

Взаимодействия ионов металлов с белками, естественно, от

личаются от взаимодействий ионов металлов с аминокислотам!

и пептидами, поскольку в белках группы CI-NH

и а-СООН длин

ных полипептидных цепей разделены ковалентными связями ряд;

расположенных между ними остатков. Эти взаимодействия отли

чаются также из-за влияния конформационного состояния пептид

ной цепи, в результате которого потенциальное место присоеди

нения может блокироваться, а удаленная боковая цепь може'

оказаться в подходящем месте для образования хелатного кольца

Примерами подходящего расположения боковой цепи лиганда

делающего возможным образование прочного хелата со специфи

чеоким ионом металла, могут служить металлопротеины и метал

лоферменты, в которых сильное -взаимодействие между мсталло!

и белком играет решающую и специфическую биологическую

роль. Металлопротеины и металлоферменты будут рассмотрен!

в последующих главах. В этой главе в основном будет обсужден

поведение белков in vitro в присутствии ионов металлов, с кото

рыми они не обязательно реагируют в природе. Биологнческа

функция двойных и других описанных здесь комплексов металло

с белками не известна, за исключением комплексов иона меди(II

с альбумином и ионов цинка с инсулином, для которых было пс

стулировано участие в транспорте и хранении соответственно.

Интерес к изучению неопецифических взаимодействий метал

лов с белками возник исторически в связи с использованием ионо

металлов для очистки белков на основании известных эффекто

ингибирования ионами металлов некоторых ферментов, а такж

возможности того, что неспецифические комплексы ионов металло

с белками послужат моделями металлоиротеино®. Учитывая сш

пифичность окружения иона металла в металлопротеинах [Г

в данной главе, посвященной исследованию неспецифически

взаимодействий ионов металлов с белками, будут главным обр£

Комплексы, металлов с белками

275

зом обсуждены механизмы денатурации белков ионами металлов-

посредников и ингибирования ферментов, а также проблема ис-

пользования ионов металлов в качестве структурных зондов, с

помощью которых может быть определена доступность и реакцион-

ная способность потенциальных лигандных групп белка. Повы-

шенная реакционная способность потенциально способного к коор-

динации атома в белке по сравнению с его реакционной способ-

ностью в модельных системах заставляет предположить наличие

рядом с ним в молекуле белка второго донора электронов, кото-

рого нет в используемых моделях. И наоборот, относительно по-

ниженная реакционная способность потенциального места связы-

вания свидетельствует о стерических затруднениях и (или) кон-

формационных изменениях, сопутствующих связыванию. Для тех

эелков, которые, будучи изолированными, находятся в состоянии

: самой низкой свободной энергией, (все такие конформационные

изменения будут связаны с положительными вкладами в свобод-

ную энергию связывания, и поэтому будет наблюдаться более низ-

кая кажущаяся константа связывания, чем та, которая была бы

найдена в отсутствие конформационного изменения.

2. РАССМОТРЕНИЕ КОМПЛЕКСОВ МЕТАЛЛОВ С БЕЛКАМИ

И МЕТОДЫ ИХ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы, используемые для изучения взаимодействия металлов

: белками, зависят от специфики системы и информации, которую

COTHT получить. Однако главным образом задаются следующими

зопросами: сколько связывающих центров имеется для данного

юна металла, какова их сила и через какие атомы — остова или

боковых цепей —происходит координация?

Число связывающих центров и их сродство можно определить

трямыми методами, такими, как равновесный диализ [2] или хро-

«атографическая гель-фильтрация [3]. Во всех исследованиях

такого типа число связанных ионов металла определяется непо-

средственно анализом концентрации комплекса металла с белком

<ак функции равновесной концентрации свободного иона металла.

При изучении связывания с металлом особенно важны значения

эН как для получения достоверных данных, так и для их интер-

третании (разд. 3), и в зависимости от цели исследования значе-

-шя рН могут поддерживаться постоянными или изменяться. По

зозможности следует избегать большинства буферов из-за конку-

ренции между белком и буфером за металл, а также из-за воз-

ложности образования тройного комплекса, включающего металл,

5елок и буфер [4]. Со способами обработки первичных данных

: целью определения числа различных центров связывания и оцен-

<и их сродства можно ознакомиться в специальных руководствах

[5].

276

i лава 2

Определить число имеющихся связывающих центров и оценить

их относительное сродство, кроме того, можно непрямыми мето-

дами исследования, в которых за связыванием наблюдают по из-

менению некоторого свойства системы при координации металла

с белком. Такие методы, из которых наиболее типичными являют

ся потенциометриче-ск-ое титрование (разд. 3) и различные спек

троскопические методы, требуют знания некоторых количествен

ных соотношений между величиной эффекта и степенью связыва

ния. И преимущества этих методов и их ограничения зависят о

степени различия в -свойствах комплексов, образующихся при ко

ординации металла к различным центрам. Например, таким пу

тем можно четко идентифицировать слабый связывающий центр

который -можно и не обнаружить с помощью прямого метода ис

следования; для этого необходимо лишь, чтобы свойства этоп

центра были достаточно характерными.

К числу прямых методов, используемых для идеи тиф

и к а

цш

атомов или боковых цепей, к которым присоединяются ионы ме

таллов, относятся рентгеноструктурный анализ (см. иеследовани

миоглобина) и ядерный магнитный резонанс (см. изучение ион

металла — РНаза, разд. 4.6). Кроме того, для этой цели использу

ют-ся различные непрямые методы. К числу последних -относятся

исследование влияния модификации боковой цепи специфическоп

бел-ка на связывание с металлом, титриметрические определени

значений рK

. участвующих в координации лигандных грун:

(разд. 3), и, по мере возможности, корреляция спектров комплек

са иона металла с белками со -спектрами подходящих модельны

систем. Хотя в случае металл-опротеинов -это последнее и риско

ванно, оно оказалось особенно плодотворным для изучения несп-е

цифических комплексов ионов металлов с белками. Исследовани

влияния модификации белка на связывание с металлом нсс-омнен

но играет полезную роль, однако при этом необходимо учитыват

возможность того, что модификация боковой цепи, которая ране

не участвовала в связывании, может повлиять на него iB результа

те изменения либо общего заряда -на -белке, либо его конфор

мацщ,

3, рН И ДРУГИЕ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ

НА СРОДСТВО ИОНА МЕТАЛЛА К ЛИГАНДУ

Потенциальными местами присоединения ионов металлов

белку являются главным образом способные к ионизации боковы

цепи и группы —NH и —C = O остова пептидной цепи. В некс

то-рых особых случаях нельзя не учитывать вклада в связывани

за счет координации металла с гетероатомами -боковых цепей с<

рина, треонина, цистина и метионина (в цитохроме с одним из ат<

Комплексы, металлов с белками

277

1ов, связывающих железо, по-видимому, является атом серы

яетионина), хотя участие этих групп в образовании неспецифи-

[еских комплексов экспериментально еще не было продемонстри-

ювано. В рамках этой широкой проблемы вероятность того, что

данный ион металла будет взаимодействовать с данным центром,

шределяетея, помимо конформации белка, еще рядом других

факторов. Главные из них — относительное внутреннее сродство

юна металла к различным способным к координации атомам и

>Н. Роль первого фактора подробно обсуждена в работе [6]. Ие-

:ледование взаимодействия между ионом H

и ионами металлов

фи связывании с белками имеет непосредственное отношение как

с проблеме доступности для ионов металлов различных мест свя-

!ывания при различных значениях рН, так и к интерпретации кри-

)ых титрования комплексов металлов с белками. Поэтому имеет

:мысл суммировать главные аспекты этих взаимодействий.

Предположим, что L

— связывающий центр, который может

)еагировать или с одним ионом H+, или с ионом металла M

Зобственные константы ассоциации этого центра с ионом H+ и

: ионом металла соответственно определяются следующими вы-

>ажениями:

(LH)

L-+ H+= LH K

} (

(1)

(LM+)

L- + M

+ = LM+ K

} (М

Ц (2)

Для макромолекулы, содержащей п таких независимых цент-

ров, упомянутые выше равновесия с H+ и M

+ в наиболее общем

зиде можно переписать так:

2toF

KH =

(П

—

V/J

- V

) (H

)

- +

^ ('

„

— / — ~~ ч /.»4.1 I**/

[п— v

— v

) (М

•де v

и V

— число -центров, занятых ионами H+ и M

+ еоответ-

:твенно, a Kh и K

— внутреннее сродство каждого из этих цент-

)ов к ионам H+ и M

+ соответственно. Члены e

+2toZ

и е+

^—

факторы электростатического взаимодействия, представляющие

взаимодействие зарядов на макромолекуле [7], где Z — остаточ-

1ЫЙ заряд белка, отнесенный к иону металла, и со — электроста-

тический фактор, который обратно пропорционален ионной силе-

I размеру молекулы. Комбинируя соответствующим образом урав-

1ения (1) и (2) или уравнения (3) и (4), можно определить ка-

кущуюся зависимую от рН константу Km, которая выражает от-

278

i лава 2

ношение числа связывающих центров, присоединивших металл

к числу центров, не присоединивших металла:

-2aZ (Z )

(LM+) /Cm Km

~ (L- + LH)J(M

) ~ 1 + K

(Н+) - 1

+ Kh

(н+) e-

2wZ

Из уравнения (5) следует несколько важных заключений. Во

первых, кажущееся сродство к иону металла будет меньше, чен

внутреннее сродство, до тех пор, пока рН приблизительно н;

2 единицы или больше выше значения рK

атома, координирующе

го металл. Это приводит к тому, что в случае связывающи;

центров с очень высокими значениями рK

, таких, как боков ьг

цепи аргинина, вклады от их участия в связывании при нейтраль

ных значениях рН 'будут очень незначительными. Во-вторых, дл:

связывающего центра, содержащего единственную ионизируемую

группу, изменение кажущегося сродства иона металла при изме

нении рН можно использовать для определения значения р/С

этой группы. И, наконец, следует ожидать, что для белков, кото

рые содержат несколько потенциальных связывающих цснтрог

обладающих различным сродством к иону H+ и иону металла, от

носительное распределение ионов металлов по этим центрам буде

зависеть от рН. Например, внутреннее сродство карбоксильны

групп к иону H+ и иону Cu(II) соответственно составляет IO

; внутреннее сродство имидазольных боковых цепей к ион

H+ и иону Cu(II) составляет IO

и IO

. Рассчитанное по уравне

нию (5) при рН 4 кажущееся сродство карбоксильных групп

Cu(II) немного больше, чем сродство имидазола к Cu(II), в т

время как при рН 7 наблюдается обратное. Таким образом, мож

но ожидать, что при низких значениях рН ионы Cu(II) буду

главным образом связаны с карбоксильными группами, а по мер

повышения рН до нейтрального значения ионы Cu(II) будут пе

ремещаться к имидазольным группам, как это и наблюдали в дсй

ствительности [4].

Второе следствие, вытекающее из конкуренции между ионам

H+ и ионами металла, состоит в том, что связывание металл

центром, который в отсутствие металла в нормальном состояни

протонирован при тех значениях рН, при которых происходит свя

зывание, сопровождается замещением протона; при значениях рЬ

гораздо более высоких, чем \>К

, протоны не замещаются (за ис

ключением некоторых примеров •незначительного замещения, обус

ловленного изменением общего заряда белка, сопровождающимс

электростатическим влиянием на кислотность). Легко показан

что для любой одиночной координирующей группы отличие в св*

зывании иона H+ незакомплексованной группой по сравнению

полностью закомплексованной определяется ее кривой титровг

ния. Этот факт имеет практическое следствие, заключающееся

Комплексы, металлов с белками 279

гом, что в связанном состоянии, в котором связывающие центры

ie изменяются с изменением рН, можно определить рK

коорди-

нирующей группы (и, следовательно, ее идентифицировать), изме-

эяя уменьшение в замещении протонов как функцию рН. Однако

з тех случаях, когда место связывания изменяется при изменении

эН, титриметрические соотношения гораздо более сложные. На-

пример, изменения при повышении рН в сторону более высоких

значений рК

(относительно рН) будут приводить к увеличению

з замещении протонов как функции рН. Такие случаи будут ил-

люстрироваться специальными примерами. Характерные примеры

констант ассоциации ионов H+, Cu(II) и Zn(II) с типичными

координирующими группами белков приведены в табл. 7.1.

Таблица 7.1

Ионизирующиеся группы белков и их «нормальные» константы ассоциации

с H + , Cu(II)

Zn(II) при

°С

Kft

(PV

Группа

Kft

(PV

Cu(II) Zn(II)

а-СООН

3,1—3,5

3, Y-COOH (Asp,

Glu)

4,4—4,7

1,8 (ацетат) [55J

1,0 (ацетат) [55]

Имидазол (His)

6,4—7,2

3,1—4,4 [10] 2,5 (имидазол) [55],

I-NH

7,8—8

4,9—5,5 [9]

!-NH

(Lys)

9,6—10,5 4,3 (NH

) [55]

2,6 (NH

) [55]

1>енольная ОН

(Туг)

9,6—9,8

— —

^ульфгидрильная

(Cys)

—

7 [6]

"уанндиновая

(Arg)

>12

— —

3начения Ig Kf

представляют нормальные значения, найденные для белков. Значения

I K

определены для модельного комплекса состава 1:1, указанного в скобках и (или) в

аботе, на которую дана ссылка.

4. ВЫБРАННЫЕ СИСТЕМЫ

Неспецифические взаимодействия ионов металлов с белками

!зучены главным образом на примере Cu(II) и Zn(II), которым

I будет уделено здесь основное внимание. Свойства Cu(II) и

^n(II), которые представляют особый интерес при рассмотрении

IX взаимодействий с бел.ками, можно суммировать следующим

280

i лава 2

образом: 1) комплексы Zn(II) в основном тетраэдрические или

октаэдрические, в то время как комплексы Cu(II) квадратно-пло-

скостные или искаженные октаэдрические; 2) координирующиеся

атомы по способности связываться и с Cu(II) и с Zn(II) распо-

лагаются в ряд S>N>0, но при этом каждый из этих атомов

взаимодействует с Cu(II) примерно в 10 раз сильнее, 4eMcZn(II);

3) ассоциация Cu(II) [но это не характерно для Zn(II)] с не-

большими пептидами характеризуется тенденцией к связыванию

с атомами азота пептидной связи с одновременным замещением

пептидного протона [8]. При высоких значениях рН эта тенден-

ция проявляется в образовании комплекса биуретового типа,

в .котором Cu(II) координирована только с атомами азота пеп-

тидной связи. При значениях рН от 5 до 9 она .проявляется в ко-

ординации Cu(II) с CT-NH

-IrpynnaMH и (или) с внутренней цепыс

имидазола и следующим соседним атомам азота пептидной свя-

зи, как в комплексах состава 1 : 1 Cu(II) с Gly-Gly-Gly-Gly-Gly v

ацетил-Gly-Gly-Gly-His соответственно [9, 10]. Таким образом

Cu(II) координируется с а-Ы,Н

-группами Gly-Gly-Gly-GIy-Gly i

замещает протоны трех соседних пептидных связей; соответствую

щие кажущиеся значения рК равны 5,85, 6,95 и 8,1. С ацетил-Gly

Gly-Gly-IIis Cu(II) координируется по атому Ni имидазола и за

мещает протоны пептидных связей; кажущиеся значения рK

рав

ны 6,5, 7,35 и 8,8.

Следует также отметить, что имеется зависимость между сило{

поля атомов*, связанных с Cu(II), и положением главной лолось

поглощения в видимой области для комплексов Cu(II) [8]. 3TI

полосы сдвигаются в более коротковолновую область по мере то

го, как увеличивается число доноров электронов, создающи:

«сильное поле», сдвигаясь от выше чем 700 нм для комплексов

подобных комплексу состава 1:1с имидазолом, до 515 нм дл:

комплексов, в которых донорами электронов являются CT-NH

группа и три атома азота пептидных связей. В общем координи

рующиеся группы в соответствии с силой ноля лигандов можт

классифицировать следующим образом: NH

>N(пептидной свя

зи) >имидазол>кислород.

4.1. Ионы цинка и сывороточный альбумин

Сывороточный альбумин —белок с молекулярной массой при

близительно 69 000, который содержит (наряду с полным наборо!

других аминокислот) 16 остатков гистидина. Проведенное ране

методом равновесного диализа исследование связывания с Zn (II

и влияние этого связывания на равновесие сывороточного альб^

* Речь идет, по-видимому, о «силе поля лигандов», создаваемой данные

атомами. — Прим. ред.

Комплексы, металлов с белками

279

лина с ионом H

было вызвано использованием Zn(II) для разде-

1ения белков крови и привело к заключению, что основной способ.-

связывания Zn(II) при рН от 5,5 до 7,5 — взаимодействие по ти-

iy 1 : I между ионом Zn(II) и каждой из 16-ти имидазольных бо-

ковых цепей [2]. Были получены следующие доводы в подтверж-

],ение такого типа взаимодействия: 1) значительное понижение

)Н, которым сопровождается присоединение Zn(II), показывает,

!то Zn(II) связывается с центрами, которые при рН 5,5 обычно

1'ротоннрованы. Так как карбоксильные группы и остатки лизина

ложно исключить из числа наиболее вероятных мест связывания

[карбоксильные группы имеют слишком низкие значения рKay

1 гуанидирование лизина не влияет на связывание), наиболее ве-

роятными местами связывания остаются имидазольные группы;

2) равновесные значения v

и (H

) показывают, что число моле-

кул имидазола (n—v

), участвующих в равновесии с ионами H+

то уравнению (3), уменьшается на единицу на каждый моль свя-

(анного Zn(II). И наконец, предположение о взаимодействии

^n(II) с имидазолом по типу 1 : 1 приводит к хорошему согласию

лежду значениями K

, рассчитанными по уравнениям (3) и (4),

\ известной первой константой ассоциации Zn(II) с имидазолом

три тех же условиях.

Pao и Лал [11, 12] усомнились в справедливости этих выводов,

ртметив, что первоначальное значение K

получено исходя из

ршибочного значения Kh и что исправленное среднее значение K

'ораздо выше для взаимодействия 1 : 1 Zn(II) с имидазолом. Бо-

iee того, их собственные исследования с применением электрофо-

реза и полярографии [11, 12] показали, что приблизительно в

;вух местах Zn(II) связывается сильнее, чем в остальных, и что

зеличины сродства только более слабых связывающих центров

совместимы с образованием комплекса Zn(II)—имидазол соста-

?а 1:1. На основе наблюдаемого выделения одного протона при

связывании каждого из двух первых ионов Zn(II) при рН 6,6 эти

!вторы предположили, что каждый из двух наиболее сильных

!,ентров связывания Zn(II) состоит из имидазольной группы и

сарбоксильной группы боковой цепи или из имидазольной группы

1 карбонильного кислорода пептидной связи. Здесь уместно за-

метить, что эти два наиболее сильных центра связывания Zn(II),,

ю-видимому, не идентичны двум наиболее сильным центрам свя-

•,ывания Cu(II) (разд. 4.5), так как вытеснение протона Cu(II)

I Zn(II) из этих наиболее сильных центров связывания протекает

ю-разному [12] и высокая концентрация Zn(II) не блокирует

!заимодействие Cu(II) с местом, где она прочнее всего связыва-

ется.

Другие аспекты взаимодействия Zn(II) с сывороточным аль-

бумином также не совсем понятны. Главный из них — спорное вли-

282 i лава 2

яние этерификации карбоксильной группы на связывание с Zn(II)

[12, 13] и влияние температуры. Инкубация сывороточного мер-

каптальбумина при 37

C приводит к увеличению числа связываю-

щих центров, при этом их число превышает число имидазольный

групп [14]. Новые центры не были идентифицированы.

4.2. Взаимодействие цинка с инсулином

Гормон инсулин выделяют из веществ биологического проис-

хождения в виде комплекса с Zn(Il). Этот комплекс можно пере

кристаллизовать, в нем содержится как минимум два атома Zn(Il)

на элементарную ячейку в 36 000 дальтон [15]. Инсулин, пе со

держащий цинка, биологически активен, и, по-видимому, повтор

ная ассоциация с Zn(II) in vivo не обязательна для его биологи

ческой активности.

Мономер инсулина (молекулярная масса 6000) содержит две

неодинаковые пептидные цепи А и В, связанные дисульфидным*

мостиками; каждая молекула мономера содержит два остатке

гистидина в положениях B

и Вю соответственно. В растворе ш

содержащий Zn(II) инсулин существует в виде смеси частиц <

разными молекулярными массами, из которых главной, по-види

мому, является димер [16]. Добавление 0,7 атома Zn(II) на моле

кулу димера приводит к монодисперсному гексамеру [16], чт<

находится в согласии с кристаллической структурой. Хотя с мо

лекулой гексамара может 'быть связано больше двух атомо]

Zn(II), первые два атома Zn(II) являются особыми в том смыс

ле, что они представляют тот минимум, который необходим дл?

кристаллизации, и их нельзя удалить диализом [17].

Проведенное ранее Тэнфордом и Эпштейном [18] титрованш

инсулина и комплекса Zn(Il) с инсулином показало, что ком

плекс Zn(II) — инсулин при титровании ведет себя двояко — кри

вая «прямого» титрования будет обратимой при значениях рН о'

3,5 до 8, а метастабильная кривая «обратного» титрования полу

чается после выдерживания при значениях рН ниже 2 или вы

ше 11, как это показано на рис. 7.1. Кривая «прямого» титровани:

представляет титрование кристаллического вещества и имеет не

посредственное отношение к настоящей дискуссии. Было показа

но, что из ее рассмотрения следуют два очевидных вывода [18]

Во-первых, в комплексе Zn(II) — инсулин по сравнению с инсу

л ином между рН 8 и 12 титруются дополнительно два протона н;

молекулу димера; это было приписано диссоциации воды, нахо

дящейся в координационной сфере связанного Zn(II). Во-вторых

две боковые цепи в молекуле димера, которые >в инсулине титру

ются около рН 6,5 (идентифицированные как имидазольные)

в присутствии Zn(II) депротонируются при рН 4. Наиболее прям-

это можно наблюдать, исследуя различие в связывании H+ инсу