Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Комплексы, металлов с белками 281

ином и !кристаллическим комплексом Zn(II) —инсулин в интер-

але рН от 4,5 до 7,5. При рН 4,5 связывание Zn(II) приводит

освобождению двух протонов из инсулина; число освобождае-

'ис. 7.1. Кривая титрования ионами водорода комплекса цинка с инсулином при

C и ионной силе 0,075 [18].

«прямое» титрование; ¢) «обратное» титрование, кислотное; ф «обратное» титрование,

:новное; кривая титрования инсулина в отсутствие цинка. Области частичной не-

(створимости на кривых «прямого» и «обратного» титрований показаны стрелками ниже

и выше соответственно.

ых протонов уменьшается до нуля в интервале рН 5,5—7,5, это

эответствует области титрования имидазола в отсутствие цинка,

одержание Zn(II) составляет 0,7 атома на молекулу димера; на

284

i лава 2

этом основании можно заключить, 'что каждый атом Zn(II) CBS

зан с тремя остатками имидазола и тремя молекулами воды [19'

(Уместно отметить, что первоначальное заключение — два ими;

азола на один атом цинка — основывалось на ошибочном опр<

делении содержания цинка, которое предполагалось равным одш

му атому Zn на молекулу димера.)

Марккер с сотр. [20, 21] выразили сомнение в том, что цин

координируется с имидазольными группами, и предложили BMI

•сто этого гексамерную модель, в которой каждые два атома Zn(I)

связаны с CT-NH

-TpynnaMH из В-цепи каждого из трех димеро

Их модель основывалась на имеющихся реитгеноструктурнь

данных, согласно которым предполагали, что каждая элемента]

ная ячейка содержит три молекулы димера, имеющие ось вращ<

ния третьего порядка [21], и на химических данных, которые н<

казали, что модификация a-NH

-rpynn В-цепей сохраняет молек;

лярную массу постоянной при связывании Zn(II) [20]. Однан

Брилл и Венейбл [19], впоследствии повторно анализируя да!

ные прямого титрования Тэнфорда, указали, что а-ЫН

-группы \

могут быть центрами связывания Zn(II), так как при рН 7,3 (nf

этом значении рН a-NH

-rpynnbi в отсутствие цинка в значител

ной степени протонированы) не меньше протонов связывает<

кристаллическим комплексом Zn(II)—инсулин, чем самим инс

.лином (рис. 7.1). Кроме того, они показали, что кривая прямо!

титрования комплекса Zn(II)—инсулин удовлетворительно соо

ветствовала модели, в которой каждый из двух атомов цинка

гексамере связан с тремя имидазольными группами, причем ко

•станта связывания второго атома цинка (10

) была больше, чс

константа связывания первого (Ю

Последние рентгеноструктурные данные, полученные при ра

решении 2,8 А [22], хорошо согласуются с химическими данным

Эти данные показали, что каждая элементарная ячейка компле

са Zn(II) —инсулин содержит три димера инсулина, которые ра

положены в виде шестимерной структуры вокруг оси симметр!

третьего порядка и связаны двумя ионами цинка. Каждый ж

Zn(II) связан с тремя Вю-имидазольными группами (по одной -

каждого димера) и еще с тремя дополнительными группами, пре

варительно идентифицированными как молекулы воды; распол

жение координирующих атомов не создает правильного октаэдр

Теперь стала также понятна причина, по которой a-NH

-rpynr

В-цепи 'были ошибочно определены как лиганды цинка [20]. П

видимому, она состоит в том, что в положении 1 В-цепи диме{

гексамера очень тесно контактируют между собой, почти сплете!

вместе; такой контакт был бы затруднен при модификации a-NI-

групп.

И, наконец, в свете имеющихся рентгеноструктурных данш

полезно вновь рассмотреть полученные константы связывай

285

Zn(II) с инсулином. Кооперативность связывания легко объясня-

ется тем, что уменьшение энтропии, связанное с переводом беспо-

рядочно агрегированных димеров не содержащего Zn(II) инсули-

на в гексамерную конфигурацию, обусловлено связыванием пер-

зого атома Zn(II) [19], !второй же атом Zn(II) практически

трисоединяется к только что возникшему грыс-имидазольному

центру. Хотя еще не имеется удовлетворительной модели второго

центра связывания Zn(II), наблюдаемую константу связывания

разумно сопоставить со значением IO

, найденным для свя-

зывания Zn(II) с бмс-имидазольным лигандом [23].

4.3. Комплексы иона меди с окситоцином и вазопрессином

Окситоцин и вазопреесин близки по структуре к полипептид-

дым гормонам (рис. 7.2), которые обнаружены в гипоталамусе и

задней доле гипофиза млекопитающих и некоторых низших орга-

12 3

S—Cys—Туг—I Ieu

I I

S-Cys-Asn-Qln

[6 5 4

Pro—Leu—Gly-амид

7 а

окситоцин

12 3

S—Cys—Tyr—Phe

I " I

S—Cys—Asn—Qln

16 5 4

Pro—Lys—Gly-амид

7 8

лизинпроизводное вазопрессина

MC. 7.2. Первичные структуры окситоцина и лизинпроизеодкого вазопрессина.

!измов. В то время как можно спорить по поводу того, относить

ш гормоны к большим пептидам или малым белкам, в их реак-

щонной способности по отношению к Cu(II) проявляются особен-

юсти, свойственные белкам.

Оба гормона обладают высоким сродством к Cu(II) [24, 25],

)бразуя при рН 8 комплекс розового цвета с единственной поло-

:ой поглощения в видимой области при 525 нм. Титрование

(II)-комплексов окситоцина (рис. 7.3) и вазопрессина [25] по-

сазывает, что связывание иона меди сопровождается выделением

[етырех протонов — одного из a-NH

-npynnbi (положение 1) и

рех протонов из других групп, которые при рН 8 обычно прото-

шрованы. Участие ;а-ЫН

-группы в авязывании подтверждается

-ем, что Cu(II) не образует никакого комплекса с дезаминиро-

!анным окситоцином, в котором a-NH

-rpynna замещена водоро-

дом, а также с N-ацетиллизинвазопрессином, в котором CT-NH

руппа анетилирована [25]. То, 'что фенольные гидроксилы не

'частвуют в связывании, было доказано тем, что замена тирозина

ia фенилаланин никак не влияла на комплексообразование

рис. 7.3). Три дополнительные группы, депротонируемые Cu(II),

>ыли идентифицированы как атомы азота из пептидных связей

286

i лава 2

(или атомы азота амидных груши). Основанием для такой иден-

тификации послужило сходство спектров комплексов гормонов

с Cu(II) и комплекса, образуемого Cu(II) с Gly-Gly-Gly-Gly, в ко-

тором Cu(II) координируется к a-NH

-rpynne и трем соседним

рН

Рис. 7.3. Непрерывные кривые кислотного титрования окситоцина и 2-фенилала

нинпроизводного окситоцина (в котором тирозин в положении 2 замещен фени-г

аланином) и их комплексов с Cu(II) [24].

Д онситоцин; Jh окситоцин+СиС1

; О 2-фенилаланинокситоцнн: 9 2-феннлаланинокситоцин-

CuCI

; 25 °С, ионная сила 0.16.

атомам азота пептидных связей [24]. Для комплекса Cu(II) с ва

зопрессином была предложена специфическая структура, вклк

чающая координацию Cu(II) с а-1\Н

-группой и тремя следующг

ми пептидными связями, точно так же, как в комплексе Cu(II

с Gly-Gly-Gly-Gly ,[25].

Однако маловероятно, что комплексы Cu(II) с гормонами бь

ли в точности аналогичны комплексам простых линейных пепп

дов. Кажущиеся значения рК для диссоциации протона из третье

пептидной связи в комплексах Cu(II) —вазопрессин и Cu(II)-

окситоцин равны 6,8 и 7,4 соответственно [24, 25] (рис. 7.3). Эт

величины значительно ниже значения 8,1, найденного для ко\

плекса с пентапептидом, таким, как тетраглпцилглицин [9]. Kpt

Комплексы, металлов с белками

287

? того, наклон кривых титрования как комплекса Cu(II) с окси-

•цином (рис. 7.3), так и комплекса Cu(II) с вазопрессином [25]

>и рН примерно 6,5 указывал на кооперативное участие трех

'птидных атомов азота противоположно их ступенчатому вовле-

•нию в комплексообразование, наблюдаемому для линейных пеп-

[дов [9]. Принцип «все или ничего» в комплексах с гормонами —

о факт, установленный на основании спектральных данных,

зторые показывают, что частицы, образующиеся при всех значе-

гях рН выше 6, спектрально почти идентичны конечному ком-

тексу [24, 25]. Возможное объяснение этих данных состоит в

)М, что в кольцевую структуру этих гормонов входит один и

злее пептидный (или амидный) атом азота, который по отноше-

ию к CT-NH

-Tpynne расположен благоприятнее, чем в линейных

гптидах. Такое влияние конформации означает, что атомы азота

ептидных связей, участвующие в координации вместе с O-NH

эуппой, не обязательно должны быть смежными с ней. Так, не-

авно выполненные ЯМР-исследования показали, что комплекс

u(II) с окситоцином — трансаннулярный, в котором в координа-

ии с Cu(II) участвуют a-NH

-rpynna и атомы азота пептидных

вязей из положения 6 цистеина, из положения 2 тирозина и из

оложения 5 аспарагина [26].

4.4. Взаимодействие метмиоглобина кашалота

с ионами меди и цинка

Метмиоглобин (метМЬ) кашалота был первым белком, трех-

[ерная структура которого была установлена методом рентгено-

труктурного анализа [27]. Вследствие этого он вскоре стал мо-

.елью для интерпретации взаимодействий металлов с белками,

!есколько аспектов химии миоглобина непосредственно касаются

го взаимодействия с ионами металлов.

Единственная полипептидная цепь метМЬ (рис. 7.4) представ-

[яет выеокоупорядоченную структуру с молекулярной массой

7 000, содержащую 75% а-спирали, которая легко и обратимо

искручивается под действием ионов H+ при рН около 4,5. Связь

: гемом осуществляется посредством координации железа к гисти-

шну (F

), ионного взаимодействия между карбоксильными груп-

тами боковых цепей гема и положительно заряженными группа-

ми белка, а также посредством неполярного взаимодействия меж-

Iy протопорфириновым кольцом гема и неполярными боковыми

цепями аминокислот. Денатурация сопровождается изменением

:пектра гема и ориентацией в сторону растворителя 4—6 гистиди-

новых боковых цепей, которые в нативном состоянии нереакцион-

носпособны ни по отношению к ионам H+, ни к карбоксиметили-

рованию [28].

Совершенно очевидно, что метмиоглобин претерпевает обра-

тимую денатурацию в присутствии ионов Cu(II) и Zn(II); это

Комплексы металлов с белками

289

ствует из изменения в спектре тема [29], из выраженной нерас-

)римости комплекса иона металла с белком [29], из размаски-

зки имидазольных остатков [29] и, наконец, из уменьшения со-

эжания а-спирали ИЗО]. Движущей силой денатурации, по-ви-

мому, является то, что денатурированная форма имеет более

сокое сродство к металлу, чем нативная структура _[29]. Одна-

денатурация проявляется только при значениях v

выше 1

9] и первый ион металла, по-видимому, связывается с центром

тивной структуры [29, 31].

Места присоединения первых ионов Cu(II) и Zn(II) к натив-

|й структуре при рН б были определены 'кристаллографически

1]. Интересно, что хотя связывание Cu(II) и Zn(II) конкуриру-

щее [21], первые ионы Cu(II) и Zn(II) присоединяются к час-

тно совпадающим, но не идентичным центрам (рис. 7.4). Так,

[евидно, что когда Zn(II) присоединяется к имидазольному ос-

1тку His-GHi, он находится очень близко (но не прямо связы-

1ется) с Lys-Aj

и с Asn-GH

. Cu(II) же связывается с His-Аю и

этом соседствует с Lys-Ai

и Asn-GH

, причем различия меж-

Y этими двумя металлами главным образом обусловлены их раз-

ичными стереохимическими требованиями. Несмотря на то что

отношении координации с иными группами, чем имидазольные,

езультаты ренггеноетруктурных исследований не однозначны,

анные о связывании [29] заставляют предположить участие в

вязывании [по крайней мере с Cu(II)] других доноров электро-

ов. Данные о связывании при рН 6,8 можно интерпретировать

ледующим образом: значение Km для первого иона Cu(II) равно

:,5-10

, в то время как внутреннее сродство Cu(II) к имидазолу

(авно только IO

. Маловероятно, чтобы вся дополнительная стаби-

низация возникала только за счет карбонильных атомов кислоро-

Ia аспарагина, к тому же результаты титрования (рис. 7.5) неод-

нозначны в отношении участия в связывании лизина. Эта неод-

нозначность еще больше усиливается, если учесть, что центры

связывания первых ионов Cu(II) при рН выше 7 изменяются, что

следует из увеличения вытеснения протонов первыми ионами

Cu(II) и также из данных ЭПР [32].

Изучение титрования особенно полезно для выяснения природы

мест связывания Cu(II) в денатурированном состоянии [29]. Вы-

теснение протонов Cu(II) из денатурированного кислотой метмио-

глобина показано на рис. 7.5. Согласно этим данным, при рН 5

Рис. 7.4. (¢2) Изображение молекулы миоглобина в виде диаграммы по Дикер-

сону [56] и (б) увеличенное изображение части молекулы миоглобина, ограни-

ченной прямоугольником на рис. а, показывающее отношения между ионами

Cu(II) и Zn(IiI) и потенциальными связывающими группами [31].

19—2451

290

i лава 2

Натив-

HblU

Ленатуриро-

ванный

2,0

•

4,0

•

4,2

4,6

tf"

рН

Рис. 7.5. Число вытесненных протонов (Av^) на ион связанной Cu(II) как фут

ция рН при различных значениях v

(где V

— число молей связанных ионо

меди на 1 моль белка) [29].

Для нативного метМЬ приведено суммарное число вытесненных протонов, наблюдаемое пр

добавлении Cu(II) к нативному белку. Для денатурированного метМЬ приведено число пр(

тонов, вытесненных Cu(II) из денатурированного кислотой метМЬ. Условия: 25 °С, ионна

сила 0,16.

на каждые из четырех авязанных ионов Cu(II) выделяются дв;

•протона, а при рН 7 — только один протон. Таким образом, дв(

группы, которые в нормальном состоянии при рН 5 протонирова

иы, связываются с каждым первым из четырех ионов Cu(II); однг

из этих групп титруется при рН 5—7 и ее, следовательно, можнс

идентифицировать как имидазол. Это заключение подтвержда

ется уменьшением связывания Cu(II) при модификации молекуль:

гистидина [33]. Идентификация второй группы, депротонируемой

Cu(II) при рН 5, будет обсуждаться ниже. Здесь уместно отме-

тить, что исследования титрования и связывания показывают, что

места связывания большей части ионов Cu(II) на метмиоглобине

Комплексы металлов с белками

291

до и после кислотной денатурации остаются одними и теми же.

а'ким образом, вытеснение меньшего числа протонов Cu(II) из

ативного метМЬ при рН 5 (рис. 7.5) можно объяснить присоеди-

гнием иона Cu(II) к двум группам, которые в нормальном со-

гоянии при рН 5 протонированы, а также обычным поглощением

ротона, сопровождающим размаскировку при денатурации ос-

овного имидазола [29].

Вторая группа, из которой Cu(II) вытесянет протон при рН5—

, по-видимому, представляет собой атом азота пептидной связи,

отя кажущееся значение рК диссоциации этой группы в комплек-

ах метМЬ ниже, чем в модельных комплексах [34]. Лизины мож-

0 не считать источником протонов, так как их гуанидирование

е влияет на связывание с Cu(II) [29]. Участие в связывании

томов азота пептидных связей особенно подтверждается спектра-

ми поглощения в видимой области комплексов Cu(II) с апомио-

лобином, которые показывают, что при рН 5,5 вместе с каждым

:мидазольным остатком в связывании должен участвовать по

райней мере еще один лиганд сильного поля [35]. Кроме того,

1 данные титрования (рис. 7.5), и спектральные данные [35] по-

дзывают, что число пептидных связей, участвующих в связыва-

ши с Cu(II), увеличивается по мере того, как рН повышается

!ыше 8. Однако следует отметить, что по крайней мере при рН 11

)дно из первых четырех мест связывания Cu(II), по-видимому,

юлжно содержать концевую a-NH

-rpynny [34].

Возможное связывание Cu(II) с имидазолом и атомом азота

тептидной связи при нейтральных значениях рН предполагает еди-

ный механизм для индуцируемой Cu(II) денатурации метМЬ, так

как было показано, что структурные требования a-спирали несов-

местимы с таковыми в аналогичных комплексах Cu(II) [36]. Од-

нако Zn(II), который, как известно, мало склонен к координации

с атомами азота пептидных связей, также денатурирует метМЬ,

вызывая изменения и в спектрах гема [37], и в содержании а-спи-

рали [30]. Кроме того, исследование модифицированного миогло-

бина предполагает, что изменения в спектрах гема и уменьшение

содержания a-спирали не обязательно должны быть связаны [33].

В этом отношении уместно отметить, что связывание ионов Cu(II)

и Zn(II) с имидазолом гемового звена F

считается критической

стадией в денатурации миоглобина [33, 37].

Не решены также другие аспекты взаимодействия металлов

с миоглобином. Среди них следует назвать взаимозависимость

между очевидным максимальным числом центров связывания при

нейтральных значениях рН (приблизительно 7 как для меди, так

и для цинка) и присутствием 12 гистидиновых остатков в белке.

Таким образом, некоторые имидазольные группы, по-видимому,

недоступны для реакции с ионом металла, несмотря на то, что

белок денатурируется, или по крайней мере они очень мало реак-

19*

292

i лава 2

ционноспособны по сравнению с другими. В этом примере так<

подразделение по реакционной способности на два класса, во

можно, отражает локальную последовательность аминокислс

[38].

4.5. Комплексы ионов меди с сывороточным альбумином

Оптические свойства Cu(II) позволяют получить более точну:

картину !взаимодействия сывороточного альбумина с Cu(II), че

та, которая получена для его взаимодействия с Zn(II), включа

и явно сложную картину основного центра связывания Cu(II).

Вскоре после начала исследований взаимодействия Cu(II)

сывороточным альбумином [4, 39] стало ясно, что первые ион!

Cu(II) связываются более прочно, чем последующие [40]. Прел

положение о том, что в состав сильного центра, авязывающег

Cu(II), входит O-NH

-Tpynna, было подтверждено работой, пока

завшей, что один эквивалент Cu(II) блокирует реакцию a-NH

групп с 2,4-динитрофторбензолом [41]. Выполненные позднее тит

рометрические исследования показали, что одна координирующа

группа наиболее сильного связывающего центра имеет р/(

при

близительно 8 [35]. Кроме того, тот факт, что комплекс Cu(II

с сывороточным альбумином состава 1 : 1 имеет полосу поглоще

ния при 525 им, а также то, что первый ион Cu(II) при рН 9 вы

тесняет два протона, показывают, что наряду с a-NH

-rpynnoi

в состав сильного центра связывания входят еще два атома азот;

пептидных связей и, возможно, еще какой-то четвертый координи

рующий атом. Расположение сильного центра связывания Cu (И

среди первых 24 аминокислотных остатков и расшифровка их по

следовательности на N-конце как Asp-Thr-His-Lys позволила идеи

тифицировать четвертую лигандную группу как имидазол [42]

На этом основании предположили, что, так же как в спектральнс

идентичном комплексе Cu(II) с Gly-Gly--His, в сильном связыва

нии Cu(II) с сывороточным альбумином участвуют также имид

азольная группа His-3, a-NH

-rpynna и два расположенных межд}

ними атома пептидных связей. (Предложенная модель сильного

центра связывания Cu(II) в -сывороточном альбумине показана -на

рис. 7.6. Корректность отнесения координирующих групп, по-ви-

димому, подтверждается тем, что первый связанный ион Cu(II)

защищает при ал-килировании и a-NH

-rpynny, и His-3 [43], а так-

же тем, что комплекс Cu(II) с сывороточным альбумином состава

1 : 1 имеет такие же оптические и вращательные свойства, как

комплекс с пептидом Asp-Thr-His-Lys [43]. Нет никаких данных,

подтверждающих участие в комплексообразовании e-NH

-rpynnbi

Lys-4.

Меньше известно о связывании последующих ионов Cu(II)

с сывороточным альбумином при нейтральных значениях рН. При