Эйхгорн Г. (ред.) Неорганическая биохимия. Том 1

Подождите немного. Документ загружается.

Комплексы, металлов с белками

293

выше 10 все связанные ионы Cu(II) проявляют свойства, со-

!сующиеся с участием атомов азота нескольких пептидных свя-

I [35]. Однако титриметрические и спектральные изменения,

юциируемые с координацией второго, третьего и четвертого

юв Cu(II), подтверждая участие в координации имидазольных

'ис. 7.6. Модель связывающего центра для первого иона Cu(II) в бычьем сыво-

юточном альбумине: концевая последовательность Asp-Thr-His показана в кон-

формации, предложенной для комплекса с Cu(II), но ион металла не пока-

зан [42].

рупп, в то же время предполагают, что при рН 8—9 в координа-

ии принимают участие меньше атомов азота из пептидных свя-

ей, чем это найдено в сравнимых условиях для модельного гиети-

инсодержащего пептида [35]. Эти данные заставляют предполо-

сить, что в сывороточном альбумине либо затруднен доступ к

ентру, состоящему из атомов азота пептидной связи, либо имеют-

я вторичные хелатные центры, имеющие промежуточную устой-

ивость между устойчивостью самого сильного центра и центра

i состав которого входят гистидин и атом азота пептидной связи.

Данные, подтверждающие состав второго связывающего центра,

юлучены исследованием методом электрофореза [12].

Особенно интересные данные относительно одного из более

:лабых центров связывания Cu(II) получили Клотц и сотр. [44,

[5] в присутствии четырех или более эквивалентов Cu(II). Этот

1ентр характеризуется сильным максимумом поглощения в обла-

294

i лава 2

сти 375 нм, его интенсивность со временем уменьшается. Обра

вание этого центра блокируют реагенты, взаимодействующие

сульфгидрильными группами, а реагенты, взаимодействующие

дисульфидными связями, способствуют его исчезновению. Пред.

жена структура этого центра, в котором Cu(II) связана с еуль

гидрильной группой и находится очень близко к дисульфидн

связи.

4.6. Взаимодействие ионов металлов с рибонуклеазой

Панкреатическая рибонуклеаза (РНаза) катализирует гид]:

лиз рибонуклеиновой кислоты, расщепляя 3',5'-фосфодиэфири1

связи, соединяющие соседние нуклеотиды. Предполагают, ч

реакция протекает через образование промежуточного 2',3'-цикл

ческого нуклеозидфосфата, который затем гидролизуется .

З'-фосфата. И 2'-, и З'-пиримидиннуклеотиды являются потенц

альными ингибиторами фермента.

Структура РНазы образована одной полипептидной цепь

с молекулярной массой 13 683, в состав которой входят четы]

дисульфидные связи, способствующие стабилизации нативнс

конформации. На основании химических рентгеноструктурнь

данных было показано, что из четырех остатков гистидина два -

His-12 и His-119 — особенно пространственно сближены и необх-

димы для проявления ферментативной активности. Каталитическу

роль выполняет, по-видимому, также остаток Lys-41.

Активность РНазы ингибируется ионами и Cu(II) и Zn(I)

[46]. Росс, Матиас и Рабин [47] показали, что связывание одног

только Zn(II) оказывает ингибирующее, но все же относительн

слабое влияние. Однако в присутствии цитидин-З'-фосфат

(З'-ЦМФ) ингибирование наблюдалось при очень низкой концен'

рации Zn(II) и было приписано образованию сильного «тройного

комплекса между Zn(II), РНазой и З'-ЦМФ. Для иона Cu(II

вначале предположили, что ингибирование обусловлено хелатирс

ванием одного иона Cu(II) между His-12 и His-119 [48]. Однак

исследования последних лет показали, что Cu(II) также образуе

«тройной» комплекс с РНазой и З'-ЦМФ [49] (см. ниже) и чт

связывание Cu(II) в отсутствие нуклеотидов более сложное, че)

ранее предполагали. На основании результатов нескольких иссле

дований можно сделать следующие заключения о взаимодействи

Cu(II) с РНазой в отсутствие нуклеотидов.

1. В интервале рН 5—7 РНаза имеет пять центров с близкиi

сродством к Cu(II).

Наличие большого числа центров с близким сродством впервьт

было предположено на основании спектрофотометрического и по

тенциометрического исследований [49], которые показали, чт<

при условии практически полного связывания добавление кажды:

Комплексы, металлов с белками

295

тырех молярных эквивалентов Cu(II) к РНазе вызывает практи-

ски одинаковые изменения в спектре поглощения в видимой об-

(сти (рис. 7.7) и протонном равновесии. Методом гель-фильтра-

1и было обнаружено пять наиболее важных центров, сродство

ггорых к Cu(II) резко возрастает между рН 5,5 и 7. И при

Л 5,5, и при рН 7 сродство одного центра к свободному иону меди

Я, им

Рис. 7.7. Спектры РНазы в присутствии CuCl

[49].

Концентрация белка 3—4%; ионная сила 0,16. А — молярное отношение CuCb к РНазе рав-

но 1; Б — молярное отношение CuCl

к РНазе равно 3. Приведены молярные коэффициенты

поглощения на 1 моль РНазы.

приблизительно в 10 раз больше, чем каждого другого из четырех

[3, 52]. Исследуя скорость релаксации протонов при рН 5,1, уста-

новили, что из трех центров, связывающих Cu(II), один центр

в 11 раз сильнее, чем два оставшихся [50].

2. Три центра содержат имидазольные боковые цепи, а один из

них содержит a-NH

-Spynny; атомы азота пептидных связей входят

в состав всех четырех центров, причем степень их участия в связы-

вании увеличивается при повышении рН.

При рН 7 наиболее сильным центром является a-NH2-rpynna,

но при рН 5,5 самым активным центром становится имидазол. Нет

296

i лава 2

никаких данных, подтверждающих хелатирование одного ио

Cu(II) между His-12 и His-119.

Участие одной имидазольной группы вместе с соседними к и

пептидными атомами азота в каждом из четырех центров вперв

рН

Рис. 7.8. Вытеснение протонов Cu (И) из Р'Назы в присутствии и в отсутстви-

ЦМФ [49].

Условия: 25 °С, ионная сила 0,16. Концентрация белка 1%. Экспериментальные точки: в ирс

тоны, вытесненные (—Ah) из РНазы 1 экв Cu(II); О протоны, вытесненные из комплекс;

З'-ЦМФ—РНаза 1 экв Cu(II); • протоны, вытесненные из комплекса 2'-ЦМФ—РНаза 1 эк

Cu(II). теоретическая кривая, рассчитанная для распределения Cu(II) между че

тырьмя независимыми имидазольными центрами в предположении, что каждый содержи

по два атома азота из пептидных связей при рН ниже 8.

было предположено на основании того, что и изменения в спект

ре поглощения в видимой области комплекса Cu(II) с РНазо!

(рис. 7.8) при изменении рН, и титриметрические свойства этогс

комплекса аналогичны свойствам комплексов Cu(II) с ацетил-Gly-

Gly-GIy-His [49]. Ниже приведены факты, свидетельствующие об

участии в связывании также Ct-NH

-Tpynn, на основании которых

пришли к выводу, что данная выше интерпретация результатов

титрования нуждается в доработке. Однако методом ЯМР были

получены дополнительные доказательства взаимодействия Cu(II)

Комплексы, металлов с белками 297

мидазолом [51], согласно которым при рН 5,5 Cu(II) уширяет

налы протонов С-2 His-12, His-105 и His-119. Еще нет никаких

сазательств участия His-48 в связывании с Cu(II). Невозмож-

лъ одновременной координации одного иона Cu(II) между

3-12 и His-119 следует из данных титрования [49] и ЯМР-иссле-

заний, которые показали, что низкие концентрации Cu(II) силь-

: влияют на Hisnl2, чем на His-119 [51].

Участие а-ЫН

-групп в связывании Cu(II) было продемонстри-

зано следующими фактами: дезаминирование a-NH

-rpynn при-

бит к исчезновению самого сильного центра связывания Cu(II)

и рН 7 и к спектральным изменениям к комплексе Cu(II) —бе-

к, которые свидетельствуют об исчезновении центра, содержа-

то a-NH^-rpynny и атомы азота пептидных связей [52]. Однако

и рН 5,5 дезаминирование приводит только к незначительным

менениям в связывании Cu(II) [52], в то время как взаимодей-

зие РНазы с 2'-ЦМФ (который присоединяется к активному

нтру), по-видимому, блокирует связывание с наиболее сильным

нтром [53]. На основании того, что карбоксиметилирование

стидина также влияет на сильный центр связывания Cu(II) при

I 5,1 [50], можно предположить, что при рН 5,5 наиболее силь-

IM центром связывания Cu(II) может быть His-12.

К другим интересным аспектам связывания Cu(II) с РНазой

этсутствие нуклеотидов относятся быстрое образование комплек-

биуретового типа при рН выше 8 [отчасти это явствует из вы-

снения Cu(II) большого количества протонов при высоких зна-

ниях рН, рис. 7.8], взаимодействия между связывающими цент-

ми [49, 50, 52] и связывания РНазой как свободного иона меди,

к и моноацетатного комплекса меди [3]. Кроме того, было пока-

но, что РНаза претерпевает значительное агрегирование в при-

тствии Cu(II) при рН около 7 [54]. Условия, при которых про-

ходит агрегация, позволяют предположить, что причина ее —

>разование межмолекулярных мостиков между группами связан-

>ш белок — CuOH [54].

В присутствии З'-ЦМФ связывание Cu(II) с РНазой заметно

!меняется. Впервые это обнаружили по большим сдвигам в длин-

зволновую область полосы поглощения комплекса Cu(II) —

Наза в присутствии З'-ЦМФ [49], а также по изменениям при ти-

ювании (рис. 7.8), которые показали, что З'-ЦМФ увеличивает

му взаимодействия Cu(II) с РНазой [49]. Интересно, что влия-

ie З'-ЦМФ заключается в облегчении взаимодействия Cu (II) с дву-

я действующими кооперативно центрами связывания, как это осо-

гнно отчетливо было показано методом гель-фильтрации [53].

[рирода связывающих центров в комплексе З'-ЦМФ—РНаза не

;тановлена. Однако примечательно то, что тройной комплекс

n (II) с РНазой и З'-ЦМФ, стереохимия которого должна быть

тлична от стереохимии комплекса с Cu(II), также облегчает свя-

298

i лава 2

зывание двух ионов металла [49, 54]. Уместно также отмети

что 2'-ЦМФ не образует аналогичного тройного компле!

с Cu(II) и РНазой (рис. 7.8), а вместо этого конкурирует с Си(

[49, 53]. Различия между 2'-ЦМФ и З'-ЦМФ в этом отношен

позволяют предположить, что нуклеотидфосфат может коордш

роваться со связанным ионом металла.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из вышеизложенного ясно, что идентификация центров связ

вания металла осуществляется наиболее просто в том случ;

когда все они относятся к одному классу и (или) когда они в тс

ности совпадают со связывающим центром в известных модельш

системах. Для идентификации уникальных центров связывай

в данном конкретном белке, по-видимому, необходимы новые N

тоды. Ясно, что даже полное представление о трехмерной структ

ре белка (см. миоглобин) в настоящее время не дает возможное

предсказать детально ни природу связывающих центров, ни вли

ние связывания на свойства белка. Для того чтобы делать как!

либо предсказания в этой области, необходимо получить бол

количественные представления о влиянии потенциальных лиган

ных атомов на конформацию белка.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Vallee В. L., Williams R. J. P., Proc. Natn. Acad. Sci. U. S., 59, 498 (1968)

2. Gurd F. R. N., Goodman D. S., J. Am. Chem. Soc., 74, 670 (1952).

3. Girott A. W., Breslow E., J. Biol. Chem., 243, 216 (1968).

4. Klotz I. M., Fiess H. A., J. Phys. Coll. Chem., 55, 101 (1951).

5. Edsall J. T., Wyman J., Biophysical Chemistry, Vol. 1, Academic Press, N

York, 1958.

6. Gurd F. R. M., Wilcox P. E., Adv. Protein Chem., 11, 311 (1956).

7. Linderstrom-Lang K., Compt. rend. trav. lab. Carlsberg, 15, № 7 (1924).

8. Freeman H. C., Adv. Protein Chem., 22, 257 (1967).

9. Hartzell C. R., Gurd F. R. N.. J. Biol. Chem., 244, 147 (1969).

10. Bryce G. F., Roeske R. W., Gurd F. R. N., J. Biol. Chem., 240, 3837 (1965).

11. Rao M. S. N., Lal H., J. Am. Chem. Soc., 80, 3222 (1958).

12. Rao M. S. N., Lal H., J. Am. Chem. Soc., 80, 3226 (1958).

13. Perkins D. /., Biochem. J., 80, 668 (1961).

14. Gurd F. R. N., J. Phys. Chem., 54, 788 (1954).

15. Schlichtkrull J., Acta Chem. Scand., 10, 1455 (1956).

16. Mareker K., Acta Chem. Scand., 14, 194 (1960).

17. Cunningham L. W., Fischer R. L., Vestling C. S., J. Am. Chem. Soc., 77, 57

(1955).

18. Tanford C., Epstein J., J. Am. Chem. Soc., 76, 2170 (1954).

19. Brill A. S., Venable J. H., Jr., J. Am. Chem. Soc., 89, 3622 (1967).

20. Marcker K., Acta Chem. Scand., 14, 2071 (1960).

21. Marcker K-, Grae J., Acta Chem. Scand., 16, 41 (1962).

22. Adams M. J., Blundell T. L., Dodson E. J., Dodson G. G. et al., Nature, 224, 4

(1969).

Комплексы, металлов с белками

299

. Drey С. W. С., Fruton J. S., Biochemistry, 4, 1258 (1965).

. Breslow E., Biochim. Biophys. Acta, 53, 606 (1961).

. Campbell В. J., Chu F. S., Hubbard S., Biochemistry, 2, 764 (1963).

. Walter R., Havran R. Т., Schwartz I. L., Johnson L. F., in E. Scoffane (ed.),

Proc. IOth European Peptide Symposium, North Holland Publishing Co., Amster-

dam, in press.

. Kendrew J. C., Watson H. C., Strandberg B. E., Dickerson R. E., Phillips D. C.,

Shore V. C., Nature, 190, 666 (1961).

. Banaszak L. J., Andrews P. A., Brugner J. W., Eylar E. H., Gurd F. R. N.,

J. Biol. Chem., 238, 3307 (1963).

. Breslow E., Gurd F. R. N., J. Biol. Chem., 238, 1332 (1963).

. Hardman K- D., Ph. D. Thesis, Indiana Univ., 1965.

. Banaszak L., Watson H. C., Kendrew J. G., J. Mol. Biol., 12, 130 (1965).

. Gurd F. R. N., Falk K. E., Malmstrom B. G., Vanngard T., J. Biol. Chem., 242,

5724 (1967).

. Hartzell C. R., Hardman K- D., Gillespie J. M., Gurd F. R. N., J. Biol. Chem.,

242, 47 (1967).

. Bryce G. F., Roeske R. W., Gurd F. R. N., J. Biol. Chem., 241, 1072 (1966).

. Breslow E., J. Biol. Chem., 239, 3252 (1964).

. Shearer W. T., Brown R. K., Bryce G. F., Gurd F. R. N., J. Biol. Chem., 241,

2665 (1966).

. Cann J. R., Biochemistry, 3, 714 (1964).

i. Gurd F. R. N., Bryce G. F., in J. Peisach, P. Aisen, W. E. Blumberg (eds.), The

Biochemistry of Copper, Academic Press, New York, 1966.

I. Klotz I. M., Curme H. G., J. Am. Chem. Soc., 70, 939 (1948).

I. Kolthoff I. M., Willeford B. R., Jr., J. Am. Chem. Soc., 79, 2656 (1957).

I. Peters T., Jr., Biochim. Biophys. Acta, 39, 546 (1960).

'.. Peters T., Blumenstock F. A., J. Biol. Chem., 242, 1574 (1967).

!. Bradshaw R. A., Shearer W. T., Gurd F. R. N., J. Biol. Chem., 243, 3817

(1968).

L Klotz J. M., Urquhart J. M., Fiess H. A., J. Am. Chem. Soc., 74, 5537 (1952).

>. Klotz I. M., Urquhart J. M., Klotz T. A., Ayers J., J. Am. Chem. Soc., 77, 1919

(1955).

3. Davis F. F., Allen F. W., J. Biol. Chem., 217, 13 (1955).

7. Ross C. A., Mathias A. P., Rabin B. R., Biochem. J., 85, 145 (1962).

i. Crestfield A. M., Stein W. H., Moore S., J. Biol. Chem., 238, 2421 (1963).

). Breslow E., Girotti A. W., J. Biol. Chem., 241, 5651 (1966).

1 Joyce В. К., Cohn M., J. Biol. Chem., 244, 811 (1969).

1. Ihnat M., Bersohn R., personal communication. Similar data were cited in ref.

50 as a communication from G. Roberts and 0. Jardetzky.

2. Girotti A. W., Breslow E., J. Biol. Chem., 245, 3066 (1970).

3. Breslow E., Girotti A. W., J. Biol. Chem., 245, 1527 (1970).

4. Breslow E., Girotti A. W., unpublished observations.

5. Martell A. E., Sillen L. G., Stability Constants, Special Publication № 17, The

Chemical Society, London, 1964.

3. Dickerson R. E., in H. Neurath (ed.), The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New

York. 1964.

ЧАСТЬ HI

РОЛЬ МЕТАЛЛОПРОТЕИДОВ

В НАКОПЛЕНИИ И ТРАНСПОРТЕ

ГЛАВА 8

ФЕРРИТИН

П. М. Харрисон, Т. Г. Хой

Harrison P. Al, Ноу Т. G., Department of Biochemistry,

University of Sheffield, Sheffield, Gt. Britain

1. ФЕРРИТИН КАК СОЕДИНЕНИЕ,

НАКАПЛИВАЮЩЕЕ ЖЕЛЕЗО

Ферритин — красно-коричневый водорастворимый содержат

железо белок, который очень широко распространен в растите,

ном и животном мире. Он был найден в организмах позвоночн

[1—3] и беспозвоночных [4—8], в цветковых растениях [9—1

и даже в грибах [12, 13]. Его повсеместное распространение ci

детельствует о древнем эволюционном происхождении и по

универсальной функциональной роли, которую он играет в м

гоклеточных организмах. Впервые ферритин был выделен Jlaj

бергером [14] в 1937 г. из селезенки лошади. Его роль в организ

животных как соединения, накапливающего железо, была ус

новлена Граником [15, 16], и, по-видимому, такую же роль

играет и в растениях.

Установлено, что в организме человека большая часть нахо

щегося в крови железа непрерывно циркулирует — очень м;

железа поступает из пищи и очень мало выводится [17]. Оке

70% содержащегося в крови железа находится в гемоглоби

20—25%—в запасном депо. В нормальных условиях больп

часть запасенного железа входит в состав ферритина, а оста'

в виде богатых железом нерастворимых гранул известен как

мосидерин [16. 18]. При разрушении гемоглобина его железо в

менно может храниться в виде ферритина и в дальнейшем испо

зоваться для получения гемоглобина [17]. Некоторая часть сод

жащегося в организме железа может сохраняться в виде фер

тина или гемосидерина в течение длительного времени. Эти зап;

могут быть использованы после потери крови или если в пг

содержится мало железа, а также для роста плода при берем

ности.

Ферритин

301

Роль ферритина [16] состоит в том, чтобы сохранять Fe(III)

в нетоксичной растворимой и легко доступной форме. Fe(III) очень

мало растворимо при нейтральных значениях рН и токсично даже

в очень низких концентрациях. Ферритин накапливается главным

образом в печени, селезенке и костном мозге. При кормлении жи-

вотных пищей, богатой железом, или при введении больших доз

железа ферритин находят в слизистых оболочках желудочно-ки-

шечного тракта [19]. Первоначально полагали, что присутствие

ферритина в слизистых оболочках блокирует поглощение железа

из кишечника [16, 19]. Хотя и не очень долго существовало мне-

ние, что в слизистой оболочке есть специальный блок для погло-

щения железа, образование ферритина в слизистых оболочках

может прямо или косвенно играть роль регулятора поглощения

железа [20].

Какого типа должна быть молекула ферритина, если этим ис-

черпываются его функции? Данная глава будет посвящена в ос-

новном описанию структуры ферритина в связи с этой его функ-

цией.

Для того чтобы ферритин как соединение, накапливающеее

железо, был эффективен, отношение в нем железа к белку долж-

но быть высоким; при этом белок, окружающий железо, должен

эбеспечивать его растворимость. Если это необходимо для того,

ггобы предотвратить аккумулирование свободного железа, белок,

<оторый, как можно ожидать, играет активную роль в поглощении

келеза, нормально должен присутствовать в клетке в состоянии,

которое ненасыщенно по отношению к железу, и его синтез дол-

кен зависеть от железа. Поглощение железа должно быть обра-

тимым, если оно тратится только на кругооборот в организме.

2. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРРИТИНА

Для получения ферритина до сих пор широко используется ме-

од Гранина [21], основанный на относительной устойчивости

)ерритина к нагреванию. Водный экстракт измельченной ткани

[агревают до 80

C на водяной бане. После охлаждения и удале-

:ия денатурированных белков ферритин осаждают сульфатом ам-

юния и выделяют центрифугированием. Его можно очистить

ерекристаллизацией из 5%-ного раствора CdSO

. Добавление

IdSO

и последующий диализ при рН 4,6 иногда приводят к осаж-

ению нерастворимого продукта. Это вещество и коричневый

аточный раствор, окружающий кристаллы ферритина, иногда назы-

ают «некристаллизующимся» ферритином. Ферритин можно так-

се получить, минуя стадию нагревания [22, 23], и перекристалли-

эвать в присутствии различных ионов двухвалентных металлов

14].

302

i лава 2

Ферритин из селезенки лошади может содержать различные

количества железа, обычно 17—23% от его сухой массы [1], при

отношении Fe/N приблизительно 2,0 [24]. Ферритин, выделенный

из других органов и видов организмов, может содержать меньше

железа, обычно 12—20%. Такие отличия заставляют предположить

гетерогенность этого соединения. Показанная на рис. 8.1 шлирен-

диаграмма ферритина [25] подтвердила это предположение. На

рис. 8.1 можно видеть медленный пик частиц, не содержащих

Рис. 8.1. Шлирен-диаграмма ферритина из селезенки лошади в 0,1 н. ацетатно[

буфере при рН 4,4.

Картина снята через 20 мин после достижения скорости 33 450 об/мин. Седиментация cnpai

налево. Обратите внимание на неокрашенный пик от частиц, не содержащих железа (око.

18S), и широкий пик, относящийся к молекулам ферритина с различным содержанием ж

леза (примерно 62S).

железа (~18S), представляющий примерно 20—25% общего к(

личества препарата, и широкий (примерно 60S) пик, относящийс

к частицам с различным содержанием железа. Главная компоне!

та не содержащего железа белка, полученная после удален*

железа (см. ниже), имеет молекулярную массу около 450 000 [26

Изопикническое центрифугирование позволяет разделить феррит*

на частицы, плотности которых, измеренные поплавковым методо:

изменяются непрерывно от 1,25 до 1,81 [26]. Максимально ферр

тин содержит 4500 атомов железа на молекулу с молекулярш

массой около 900 000 [26]. Спектры поглощения ферритиг

в ультрафиолетовой и видимой областях главным образом обу

ловлены присутствием железа [16]. Так, поглощение при 280 н

обусловленное белком, составляет только около 7% от общего и

глощения, а при 310 нм — меньше 1%.

Граник [27] показал, что ферритиновое железо находит

в «мицеллах», образуемых комплексом гидратированного окси,

железа с фосфат-ионом, приблизительный состав которого выр

жается формулой (FeOOH)

(FeO : OPO

). Мицеллы, содерж