Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

СН3СН2СН2

+ CH3CH2CH2 - CH3CH2CH3 +

CH=CH

(в)

С.Хиншелвуд

и Н.Н.Семенов показали, что механизм цепных

реакций включает и эти типы реакций.

Продолжительность (время) жизни

долгоживущих

свободных ра-

дикалов зависит от условий (наличие или

отсутствие

влаги и кисло-

рода

воздуха)

и составляет от нескольких минут до нескольких ме-

сяцев и

даже

лет. Более высокая устойчивость этих свободных ра-

дикалов связана с : 1) частичной потерей активности неспаренного

электрона в

результате

взаимодействия его со многими атомами мо-

лекулы (делокализация неспаренного электрона); 2) малой

доступ-

ностью атома, несущего неспаренный электрон, вследствие

экрани-

рования его соседними атомами.

Примерами

долгоживущих

свободных радикалов являются три-

фенилметил (СбН5)зС, тетраметилпипсридиноксил (I), бис-триф-

торметилнитроксил (II) и др.:

I И

Свободные радикалы I и II называются иминоксильными.

Последние широко применяют в биофизических и биохимических

исследованиях для выяснения конформации белковых молекул и

функциональных свойств биологических мембран.

При

окислении или восстановлении нейтральных молекул обра-

зуются

заряженные свободные радикалы - катион-радикалы

или анион-радикалы; например, катион-радикал тирозина:

"но-

<J5^—

сиг

сн

соо*,

а нейтральный радикал тирозина имеет

такую

структуру:

6- /pSN - CH2 - СН - СОО"

анион-радикалам относят супероксид-анион-радикал кислоро-

да (ниже

будет

подробно рассмотрен), семихиноны, в частности

бензосемихинон:

-о-<0>-

Семихиноны являются продуктами одноэлсктронного восстанов-

261

ления

хинонов. Свободные радикалы, которые содержат два не вза-

имодействующих

друг

другом

неспаренных электрона, называют-

ся

бирадикалами (молекула кислорода О-О). Полирадикалы

содержат более

двух

неспаренных электронов.

Изучение катион-радикалов и анион-радикалов

дает

ценную ин-

формацию

о характере взаимодействия ионов в растворе. Свобод-

ные

радикалы играют большую роль в окислительно-восстанови-

тельных, фотохимических и каталитических процессах, а также в

важнейших промышленных процессах (полимеризация, пиролиз,

крекинг,

горение, взрыв и т.д.).

Многие

биохимические реакции протекают с участием свобод-

ных радикалов в качестве активных промежуточных продуктов. С

помощью метода электронного парамагнитного резонанса (см. ни-

же) показано, что все активно метаболизирующие клетки растений

животных содержат свободные радикалы в концентрации 10" -10

моль на 1 г ткани. В реакциях биологического окисления свободные

радикалы

участвуют

в образовании переносчиков электронов типа

хинонов и флавинов, входящих в мембранные структуры. Свобод-

ные

радикалы образуются также при перекисном окислении липи-

дов в биологических мембранах.

В организме свободные радикалы, как выше отмечалось,

могут

генерироваться и при действии на него различных физических и хи-

мических агентов. Так, влияние ионизирующей радиации на живые

организмы связывают с возникновением свободных радикалов как

при

радиолизе воды, так и при воздействии излучений на биомоле-

кулы (аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, азотистые ос-

нования,

полисахариды и др.) клетки (см. гл. 7, 8).

2. Методы изучения свободных радикалов

Для изучения свободных радикалов применяют различные

физи-

ко-химические методы: электронную спектроскопию, масс-спект-

роскопию,

метод ядерного магнитного резонанса

(ЯМР),

метод

электронного

парамагнитного резонанса

(ЭПР),

метод хемилюми-

несценции

и др. Из названных методов наибольшее распростране-

ние

получил метод ЭПР, который

дает

возможность идентифициро-

вать свободные радикалы и определять их концентрацию, а также

получать информацию о физической природе неспаренного элект-

рона

и характере его поведения в молекуле. Однако по чувствитель-

ности

метод ЭПР

уступает

другому

физическому

методу

- хемилю-

минесценции,

основанному на регистрации свечения, сопровожда-

ющего химические реакции, и обсужденного нами в предыдущих

262

главах.

В последующем мы более подробно рассмотрим такие мето-

ды обнаружения свободных радикалов, как ЭПР, ЯМР, импульс-

ный

фотолиз, лазерная спектроскопия.

Сейчас остановимся на характеристике

супероксид-радикала

кис-

лорода,

одной из активных форм кислорода, обозначаемой Of- По-

нимание

роли супероксид-анионного радикала кислорода в биоло-

гии

сильно продвинулось с открытием фермента супероксиддисму-

тазы. Функция этого широко распространенного фермента заклю-

чается в катализе дисмутации потенциально токсичных суперок-

сид-анион-радикалов,

возникающих как в процессе функциониро-

вания

живых систем, так и в

результате

воздействия на их компо-

ненты

различных агентов, в том числе ионизирующего и ультрафи-

олетового излучений. Например, Of можно легко получить при

импульсном радиолизе, в частности, при гамма-облучении окис-

ленного водного формиата:

ОН

+ НСОО' -*СО2~ + Н

О;

СОг

02 -• СОг

Of.

Гидроксид-радикал ОН - первичный продукт радиолиза воды -

довольно сильный окислитель.

Кислород,

играющий важнейшую роль в биологических систе-

мах, является эффективным акцептором первичных восстанови-

тельных радикалов реакций радиолиза воды:

eaq

Ог -О2*;

Н*+02

-Н02,

где e

q - гидратированный электрон (стабилизированная форма

электрона);

Н - радикал водорода; НОг - гидроперекисный радикал,

выступает

и к^ак окислитель, и как восстановитель.

Радикал 02 имеет максимум поглощения при 245 нм, а радикал

Н0'2 - при 225 нм. Супероксид-радикал кислорода, как и радикал

Н05,

может наносить очень серьезные повреждения биологически

важным молекулам. С помощью

метода

импульсного радиолиза в

присутствии формиата натрия и кислорода показано, что анион-ра-

дикалы Of восстанавливают феррицитохром с до ферроцитохрома

со 100%-ным выходом, но значительно медленнее, чем e

q или Н*

причем скорость восстановления молекул гембелка сильно зависит

от величины рН среды.

Супероксид-радикалы кислорода принимают

участие

в свободно-

радикальных процессах перекисного окисления липидов. Ненасы-

щенные

жирные кислоты (линолевая, линоленовая, арахидоновая)

263

взаимодействуют с активными формами кислорода с образованием

нейтрального радикала липида в соответствии с реакцией

+ (Of, O

)-R + НОГ, i

- молекула

углеводорода

(жирнокислотный остаток ее); О_2 -

синглетный кислород; R - алкильный свободный радикал; HOi" -

протонированный супероксидный радикал кислорода.

Метод ЭПР

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) - резонансное по-

глощение энергии электромагнитных колебаний в сантиметровом

или миллиметровом диапазоне длин волн веществами, содержащи-

ми

парамагнитные частицы (молекулы, атомы, ионы, свободные

радикалы, слабо связанные с атомом электроны). Явление ЭПР бы-

ло открыто Е.К.Завойским в 1944 г. На основе этого явления был

разработан один из методов радиоспектроскопии -

метод

ЭПР. Ус-

ловие резонанса записывают в виде уравнения:

hv -ДЕ - g/3H,

где h - постоянная Планка; v - частота переменного электромагнит-

ного поля; ДЕ - разность энергий

между

магнитными (зееманов-

скими) подуровнями, которые образуются в

результате

расщепления уровней энергии парамагнитной частицы в постоян-

ном

магнитном поле Н; g - фактор расщепления: отношение маг-

нитного момента парамагнитной частицы к ее механическому

моменту (спину); /J - магнетон Бора. При соблюдении условия резо-

нанса

образец поглощает электромагнитную энергию.

Для измерения поглощения используют радиоспектрометры

(спектрометры ЭПР), в которых при постоянной

частоте

электро-

магнитного поля порядка

9000

МГц и медленном изменении напря-

женности магнитного поля регистрируют изменение поглощаемой в

образце мощности СВЧ-поля. Записываемый с помощью регистри-

рующего

устройства (осциллограф или самописец) сигнал имеет

форму производной от кривой поглощения. Спектры ЭПР

дают

важнейшую информацию об электронном строении изучаемой сис-

темы. Метод ЭПР эффективно применяется для решения ряда про-

блем биологии, химии,

физики,

медицины, в частности для опреде-

ления

наличия и концентрации свободных радикалов в

веществах,

их трансформации и взаимодействий

между

ними.

Выделяют

следующие

главные направления применения

ЭПР-спсктроскопии

в исследованиях биологически важных струк-

тур и процессов:

264

1. Изучение механизмов окислительно-восстановительных фер-

ментативных реакций (появление свободных радикалов различной

природы в

ходе

биохимических процессов как в изолированных

ферментных системах, так и в целых клетках и тканях); исследова-

ние

процессов транспорта электронов в митохондриях, строения и

механизмов окисления и восстановления хинонов, флавинов, ди-

ну клеотидов, порфиринов, хлорофиллов, гемопротсидов и др.

2. Радиобиологические исследования: идентифицированы свобод-

ные радикалы и ион-радикалы, возникающие в целых клетках и

тканях и в многочисленных образцах аминокислот, пептидов, бел-

ков,

нуклеиновых кислот, липидов,

углеводов

под влиянием

иони-

зирующего излучения в условиях различного микроокружения.

3. Фотобиология и фотосинтез. Фотохимические процессы в био-

системах сопровождаются образованием свободных радикалов в ка-

честве

промежуточных продуктов. Свободные радикалы появляют-

ся

и при реализации первичных актов фотосинтеза.

Метод ЯМР

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) - резонансное поглощение

электромагнитной энергии веществом, обусловленное переориента-

цией

системы магнитных моментов атомных ядер в постоянном

магнитном поле. ЯМР, как и ЭПР, - один из методов радиоспектро-

скопии,

был открыт и объяснен Ф.Блохом и Э.Псрселлом в 1946 г.

Этот процесс избирательного поглощения электромагнитной

энер-

гии наблюдается в сильном постоянном магнитном поле, на которое

накладывается слабое радиочастотное магнитное поле (с частотой

порядка 40 МГц), перпендикулярное постоянному. Частота радио-

волн в

методе

ЯМР зависит как от типа изотопа, так и от напряжен-

ности магнитного поля.

Условие резонанса записывают аналогично электронно-парамаг-

нитному резонансу.

Так

как протоны

обладают

спином и зарядом, то они имеют маг-

нитный

момент, который у атомных ядер примерно в

2000

раз мень-

ше,

чем у электронов.

Для создания постоянного магнитного поля напряженностью 1-

10 Т используют электромагниты массой 10 - 10

кг со стабильно-

стью, превышающей 0,1%. Для изменения магнитного поля в пре-

делах

10" Т применяют дополнительные электромагниты (свип-

электромагниты).

Для расшифровки сложных спектров регистрируют

10-1000

спек-

тров одного и

того

же образца и вводят экспериментальные данные

265

в ЭВМ для получения среднего спектра или спектра, получаемого

путем

накопления. ЭВМ-приставки используют при исследовании

слабопоглощающих биологических образцов.

Положение спектральной линии ЯМР относительно некоторой

эталонной линии называется

химическим

сдвигом.

В качестве эта-

лона для протонного резонанса органических соединений использу-

ют тетраметилсилан (CH3>4Si, а для водных растворов биополиме-

ров - ДСС (2,2-диметил-2-силанпентан-5-сульфоновая кислота).

Химический сдвиг (<5) представляет собой отношение сдвига час-

тоты поля (Дси) к эталонному значению

(а>о).

умноженное на 10 :

(Дш/wo)

•

1О

=ДН/Но-

где Но - напряженность постоянного магнитного поля.

Величина д для алифатических протонов биополимеров варьиру-

ет от -0,5 до -2,0, ароматических протонов - от -6,0 до -8,5.

При

высоком разрешении наблюдается сверхтонкая (мульти-

плетная)

структура

линий ЯМР, возникающая вследствие магнит-

ного взаимодействия

между

ядрами, передаваемого через электро-

ны

связи (непрямое спин-спиновое взаимодействие).

Изучение химических сдвигов и сверхтонкой

структуры

прово-

дится с целью получения количественной информации о располо-

жении и взаимодействии атомных ядер жидкостей и

твердых

тел.

ЯМР

высокого разрешения представляет собой стандартный ме-

тод определения строения органических молекул, используемый

также для исследования механизма и кинетики химических и био-

химических реакций.

Спектроскопия ЯМР находит все более широкое применение в

биологии (биофизике) и в медицине. Так, методы ЯМР были эф-

фективно использованы при анализе конформационных свойств

биополимеров, взаимодействий белков с фармакологическими ве-

ществами, взаимодействий фермент - лиганд (гемопротеиды), био-

полимеры - вода, антиген - антитело. Очень часто методы ЯМР ис-

пользуют

для определения природы химических групп,

участвую-

щих в образовании специфических комплексов (сывороточный аль-

бумин - пенициллин, сывороточный альбумин - стрептомицин, ал-

когольдегидрогеназа - НАД), а также природы вновь образующихся

связей (например, водородной). ЯМР на Р и С успешно приме-

няется и для изучения живых клеток и тканей (изменение концент-

рации

АТФ и креатин-фосфата при сокращении мышцы).

Метод импульсного фотолиза

Импульсный фотолиз (флеш-фотолиз) - один из спектральных

266

методов исследования биосистем, который наряду с методами элек-

тронного парамагнитного резонанса и ядерного магнитного резо-

нанса

дает

непосредственную информацию о сущности первичных

быстропротекающих фотопроцессов. Этот метод был предложен

Р.Норришем

и Г.Портером в 1949 г. В разработке его приняли уча-

стие Н.Дэвидсон и сотр. (1951), Г.Герцберг и Д.Рамсей (1952).

Сущность метода импульсного фотолиза заключается в том, что

при

освещении объекта кратковременной мощной вспышкой света

поглощающие энергию света молекулы, переходя в возбужденное

состояние,

могут

накапливаться в избыточной концентрации. При

этом образуются и промежуточные короткоживущие фотопродук-

ты, для идентификации которых используют спектральную аппара-

туру.

Таким образом изучают реакции, в которых принимают уча-

стие первичные фотопродукты.

помощью метода импульсного фотолиза впервые были получе-

ны

спектры поглощения некоторых свободных радикалов (NH2,

НСО

и др.), а также триплетных возбужденных молекул (в частно-

сти,

ароматических аминокислот).

Очень высокие интенсивности света (одно из главных достоинств

импульсного фотолиза) можно получить только в том случае, если

использовать все полихроматическое излучение импульсной лам-

пы,

но

тогда

практически невозможно точно оценивать квантовые

выходы фотохимической реакции. Поэтому в дальнейшем были

разработаны способы получения импульса света большой интенсив-

ности

и после фильтрации фотолизирующсго света. Это дало воз-

можность определять величины квантовых выходов фотопродуктов

с достаточной степенью точности.

Рассмотрим блок-схему установки для флеш-фотолиза. На рис.

6.1 представлена схема импульсного спектрофотометра, сконструи-

рованного на кафедре биофизики биологического факультета МГУ

для биологических исследований. Измеряющий свет от источника 1

фокусируется линзой 2 на

входную

щель монохроматора 3. Моно-

хроматический луч света с помощью линзы 4 фокусируется на кю-

вету

с образцом. Проходя кювету, луч света падает на стеклянную

пластинку 19, расположенную под

углом

45 °, которая отражает

около

12% падающего на нее света. Таким образом, часть света че-

рез стеклянную пластинку и светофильтр 20 попадает на фотокатод

первого фотоумножителя 21, а часть, отражаясь и поворачиваясь

зеркалом 14, через светофильтр 15 - на фотокатод второго фотоум-

ножителя 16. Импульсное возбуждение производится двумя лампа-

ми

10, 13, расположенными параллельно оптической оси, от кото-

267

14 15 16 17 18

1 2

// И* Ьз

Рис.

6.1. Схема импульсного дифференциального спектрометра

рых

свет

через светофильтры 11,12 попадает на

кювету

с образцом.

Энергия вспышки для большинства измерений

30-40

Дж, длитель-

ность 5-

10"

с.

Для возбуждения молекул вещества постоянным светом исполь-

зуют

лампу накаливания 5, от которой луч через систему линз 6, 8,

тепловой 7 и стеклянный 9 светофильтры попадает на образец.

Интенсивность измерительного света составляет около 10~

Вт/см

, а постоянного

возбуждающего

света - около 10" . Импульс-

ное возбуждение производится однократными или последователь-

ными

двумя

вспышками через

регулируемые

интервалы времени от

•

10 с до нескольких минут. Электрический сигнал от первого

фотоумножителя поступает на эмиттерный повторитель 22, затем

на

широкополосный усилитель 23 и регистрирующий прибор (ос-

циллограф) 24. Со второго фотоумножителя сигнал усиливается

электрометрическим усилителем постоянного тока 17 и поступает

на

самопишущий потенциометр 18. Схема регистрации обеспечива-

ет чувствительность порядка 0,2% AD (изменение оптической

плотности образца). Сигнал с экрана осциоллографа можно сфотог-

рафировать.

Длительность вспышки ("фотоимпульса") может варьировать от

нескольких миллисекунд до пикосекунд в зависимости от индук-

тивности цепи импульсная лампа - конденсатор (батарея конденса-

торов), приложенного напряжения, размеров импульсной лампы,

природы и давления газа в импульсной лампе.

Для непосредственного определения времени жизни флуоресцен-

ции

биообъектов (от 10 до 10 с) по зависимости интенсивности

флуоресценции от времени необходимо иметь импульсные лампы с

длительностью вспышки наносекундного диапазона. Дж.Малмберг

(1957)

описал лампу с очень короткой вспышкой, пригодной для та-

ких измерений.

Методике импульсного фотолиза присущи

следующие

экспери-

ментальные трудности:

1. Очень высокие напряжения (30 кВ) и большие количества

энергии,

накапливаемой в конденсаторах, являются опасными для

жизни.

В связи с этим необходимо, чтобы зарядкой и разрядкой

конденсаторов управляли на некотором расстоянии от источника

высокого напряжения. В ряде лабораторий конденсаторы располо-

жены в соседней комнате, причем сделано специальное устройство,

которое автоматически выключает высокое напряжение, когда от-

крывают дверь в комнату с источниками высокого напряжения.

2. Зависимость интенсивности вспышки от времени не одинакова

269

для различных длин волн. При количественных исследованиях тре-

буется точное знание зависимости интенсивности от времени. Поэ-

тому необходимо определить эту зависимость для той области длин

волн,

где наиболее сильно поглощает исследуемое вещество.

3. В процессе эксплуатации импульсная лампа часто начинает

"газить", в

результате

чего

ухудщаются

ее рабочие характеристики.

Импульсную лампу в этом

случае

следует

заменить.

4. Температуру фотохимической реакции часто невозможно оп-

ределить, так как поглощается большое количество энергии за

очень короткий промежуток времени. Это может повышать темпе-

ратуру

поглощающей системы до 1000 °С и, следовательно, вызы-

вать термическое разложение исходного вещества и продуктов фо-

тохимической реакции, если не принять необходимых мер предо-

сторожности. Чтобы избежать теплового нагрева, в изучаемую сис-

тему

вводят большое количество газа, не поглощающего свет

вспышки,

или используют жидкий растворитель. Самый распрост-

раненный

и удобный способ предотвращения термического разло-

жения

биообъекта - проведение экспериментов при низких темпе-

ратурах

(жидкий азот).

Метод импульсного фотолиза применяется для анализа фотофи-

зических и фотохимических процессов, протекающих в биосисте-

мах: тетрапиррольные пигменты (хлорофиллы, порфирины, связан-

ные

с биосинтезом гема, пигменты желчи, гемоглобин и миогло-

бин),

полиены (С40 - каротиноиды и их аналоги, С20 - полиены),

белки и их компоненты, нуклеиновые кислоты и их компоненты,

компоненты

цепи переноса электрона (НАД, флавины, убихинон,

пластохинон, цитохром с).

Исследование сложных белков - гемопротеидов методом флеш-

фотолиза

дает

ценную информацию об электронно-конформацион-

ных взаимодействиях в этих белках. Применение указанного мето-

да для изучения гембелков основано на том, что комплекс гемопро-

теид - лиганд фоточувствителен и под действием света обратимо

распадается на свободный белок и лиганд. Наблюдая затем реком-

бинацию,

можно исследовать кинетические характеристики этого

процесса и судить по ним о конформации молекул белка,

участвую-

щих в рекомбинации.

Лазерная спектроскопия

Лазерная спектроскопия - раздел оптической спектроскопии, ме-

тоды которой основаны на использовании лазерного излучения.

Применение

монохроматического излучения оптических кванто-

270