Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

вращением,

а осциллятор связанный с колебанием групп или мо-

лекул вещества. Наиболее важным типом взаимодействия является

взаимодействие электрического поля световых колебаний Е и ди-

польного момента молекулы Р.

Чтобы осциллятор (хромофорная группа:

>С=С<,

>О0, >OS,

-ОН,

-SO3H, -NH2, -СООН, -NH) поглощал энергию, электриче-

ское поле падающего света должно иметь составляющую, парал-

лельную его дипольному моменту. Аналогичное условие ротатора

состоит в том, чтобы падающий свет имел составляющую, перпен-

дикулярную оси вращения молекулы.

Ниже

показаны возможные случаи взаимодействия составляю-

щих электрического поля падающей световой волны (Е

и Е

) с ди-

польным

моментом ротатора и осциллятора.

х А Б

^Z р н. ttt

'Е

ЕРР

Пусть свет распространяется в направлении Z.

Компоненты,

взаимодействующие с вращением:

А Б

Ех и Е

с колебанием: - Е

А - диполи ориентированы по направлению распространения света,

- диполи ориентированы перпендикулярно к направлению рас-

пространения

света.

3. Необходимость

учета

правил отбора. Вероятность поглощения

кванта зависит, кроме рассмотренных условий, и от разрешенное™

перехода: правилами отбора разрешены не все переходы. Наиболее

вероятны (интенсивны) только те, которые происходят

между

со-

стояниями

одинаковой мультиплетности, т.е. синглет-синглетные

или

триплет-триплетные переходы. Поглощение атомами энергии

фотона

характеризуется отдельными линиями в спектре, отражаю-

щими

чисто электронные переходы. Каждый электрон в молекуле

находится на определенной орбитали (а, п

п-орбитали) и обладает

определенной энергией, поэтому в молекуле

существует

система

электронных энергетических уровней. Электронные уровни в моле-

кулах

представлены семейством колебательных подуровней, а каж-

дый колебательный подуровень - семейством вращательных (рис.

5.1).

231

Рис.

5.1. Схема энергетических

уровней молекул. Линии обозначают

энергетические уровни молекулы; рас-

стояния

между линиями соответствуют

дискретным значениям изменения

энергии молекулы. Э1 - совокупность

линий, обозначающих один электрон-

ный уровень, распадающийся на коле-

бательные и вращательные подуровни;

Э2

- другой электронный уровень; Kl,

К2,

КЗ - колебательные подуровни,

распадающиеся

на вращательные под-

1 уровни, Bl, B2, ВЗ - вращательные

подуровни

Полная

(общая) энергия молекулы равна: Еобщ

Еэл + Екол

Ецращ.

Для

упрощения вклад вращательных переходов

Еобщ

обычно

не

рассматривается.

Частота изменения каждого

из

видов энергии молекулы Еэл, Екол

Евращ имеет значения порядка

10,10 и 10 с"

соответствен-

но.

При

поглощении кванта света молекулой электрон переходит

нижнего электронно-колебательного основного уровня

на

электрон-

но-колебательный возбужденный уровень.

Так как при

возбужде-

нии

(светопоглощении) электрон переходит

нулевого колебатель-

ного подуровня основного состояния (связывающая орбиталь)

на

различные колебательные подуровни возбужденного состояния

(разрыхляющая орбиталь),

то

спектр поглощения молекулы описы-

вается

не

линией,

как в

атомах,

полосой (слепком колебательных

подуровней возбужденного состояния). Из сопоставления частот из-

менения

Еэл, Екол

Евращ

следует,

что за

время электронного пере-

хода

положение колеблющихся ядер

не

изменится.

Из

принципа

(правила) Франка-Кондона вытекает,

что

наиболее вероятными

(интенсивными)

будут

переходы

между

теми колебательными

под-

уровнями электронных состояний молекул,

которых ядерные кон-

фигурации одинаковы (точнее

практически совпадают).

Возбуждение молекулы вещества М (поглощение

ею

энергии фо-

тона) описывается выражением: М

+ hv -» М*, где М* -

возбужден-

ное

состояние молекулы. Поглощение света внешне проявляется

ослаблении светового потока после прохождения через исследуе-

мый

объект.

помощью приемника излучения (фотоумножитель,

фотоэлемент) можно определить,

во

сколько

раз

интенсивность

све-

та перед образцом

1о

(например, кюветой

раствором белка, нукле-

232

иновой

кислоты и т.д.) окажется больше интенсивности света, про-

шедшего через раствор (I).

Измеренная

спектрофотометром величина светопропускания

T-1/Io не зависит от интенсивности света, но зависит от длины вол-

ны

и может

служить

характеристикой данного образца. Величина

1-Т носит название светопоглощения. Однако ни величина свето-

пропускания,

ни величина светопоглощения не пропорциональны

концентрации

раствора, а связаны с концентрацией (с) и толщиной

кюветы (1) более сложной (экспоненциальной) зависимостью. Поэ-

тому

для характеристики поглощения вещества и определения его

концентрации

используют

другую

величину - оптическую плот-

ность образца (D).

Поглощение

света в бесконечно тонком слое dl пропорционально

толщине слоя и концентрации вещества: dl = к- с • dl. При интегри-

ровании

этого выражения с

учетом

конечной толщины кюветы 1

(образца) получается уравнение Бугера-Ламберта-Бера: lg

Io/I

- -lg Т - е cl или lg I/Io " -е cl, где е - молярный коэффициент экс-

тинкции

(поглощения).

Раствор с концентрацией 1 моль/л в кювете толщиной 1 см имеет

оптическую плотность D, равную е. (В английской

литературе

вме-

сто D чаще используют обозначение А от слова absorbance - погло-

щаемость.)

Молярный

коэффициент поглощения не зависит от условий из-

мерения

(с, 1 и др.) и

характеризует

способность молекул данного

вещества поглощать

свет

той или иной длины волны. Размерность

е - л • моль" см" .

е -1/с1 • lg

(Io/I)

или D/cl.

Измерив

оптическую плотность раствора в кювете толщиной

см, по значению молярного коэффициента экстинкции можно оп-

ределить концентрацию раствора (моль/л):

c-D/e.

Если

толщина кюветы 1 (точнее - длина оптического пути) не

равна 1 см, то

c-D/el.

Значения

с многих веществ определены и внесены в

соответству-

ющие справочные издания. Величины е и D зависят от длины вол-

ны

измеряемого света. Кривую зависимости величин оптической

плотности раствора (образца) от длины волны измерения (Я ) назы-

вают

спектром

поглощения,

а кривую зависимости светопропуска-

ния

(Т) от длины волны измерения -

спектром

пропускания.

233

Спектр

поглощения является индивидуальной характеристикой

вещества, поэтому структурные особенности его находят отражение

на

спектрах поглощения. На основании изучения и интерпретации

спектров поглощения можно проводить качественный и количест-

венный

анализ веществ. В дальнейшем нами

будут

обсуждены спек-

тры поглощения функционально важных биологических соедине-

ний

и некоторых биообъектов.

Ниже

приводятся типы электронных переходов, обусловливаю-

щих спектр поглощения в видимой и ультрафиолетовой (УФ) обла-

стях, причем учитывается, что молекулярные орбитали а ил мо-

гут быть связывающими и разрыхляющими (антисвязывающими).

Из

схемы электронных переходов (рис. 5.2)

следует,

что наи-

большей энергии

требует

а -» ст*-переход. Такие переходы харак-

терны для молекул насыщенных углеводородов (метана и этана) и

соответствуют поглощению в области длин волн меньше 200 нм.

Переходы

л-*л*

происходят в молекулах ненасыщенных соедине-

ний

и связаны с поглощением энергии света в видимой или близкой

УФ-области (Я >200 нм). Хромофорные группы таких соединений

всегда содержат ненасыщенные связи (ароматические соединения).

Переходы

п-*о*,

п-»?г»

совершают несвязывающие электроны,

например,

электроны неподеленных пар. Такие электроны удержи-

ваются в молекуле наименее прочно. Переходы этого типа происхо-

дят в молекулах, содержащих такие гетероатомы, как азот, кисло-

род, сера,галогены.

п -*а' " п -> я'

к-» я'

о-» о'

о'

(разрыхляющаяо)

х'

(раэрыхлякхцаял)

(носаязыоающая,

непо

деленная)

(связывающая

л)

Вис. 5.2. Схема электронных пе-

(связывающая о) Реходов, обусловливающих

спектр

поглощения в видимой и УФ-обла-

3. Спектральные свойства некоторых биомолекул

Рассмотрим спектры поглощения важных в функциональном от-

ношении

биологических соединений: белков, нуклеиновых кислот,

липидов,

хлорофилла, родопсина, ароматических аминокислот.

234

Для проведения

глубокого

анализа биомолекул (биосистем) необхо-

димо располагать надежным отнесением их полос поглощения. Од-

нако

вопрос об отнесении некоторых полос поглощения биологиче-

ских веществ, в частности гема, не решен окончательно. Все порфи-

ринсодержащие соединения имеют систему сопряженных двойных

связей, играющую роль хромофора и

обусловливающую

интенсив-

ные полосы поглощения в видимой и близкой ультрафиолетовой об-

ластях спектра. л-Электроны двойных связей включены в

общую

сопряженную систему порфиринового кольца. В сопряженную сис-

тему

не

входят

двойные связи

двух

пиррольных колец, которые на-

званы "полуизолированными". Волновые функции лг-электронов

последних только перекрываются волновыми функциями лг-элект-

ронов кольца.

Характерными для оксигенированной формы гемоглобина -

двух-

компонентного транспортного белка - полосами поглощения в види-

мой области спектра являются полосы с

Дшах

при 412, 542 и 576 нм

(рис.

5.3). Первая полоса называется полосой Соре в честь исследо-

вателя спектральных характеристик порфиринсодержащих соеди-

нений.

Указанные полосы поглощения принадлежат

гему.

Счита-

ют, что полоса Соре

соответствует

отдельному электронному пере-

ходу,

остальные полосы обусловлены колебательными переходами

другого

электронного уровня. Спектр поглощения оксигемоглобина

характеризуется также полосой сДшах ~ 342 нм, обусловленной осо-

бенностями железопорфирина (неидентифицированная полоса по-

глощения гема). Полоса поглощения с

Дтах

~ 275 нм обусловлена

поглощением энергии квантов л-электронами ароматических ами-

200 250 300 350 400 450 500 550 600 нм

Рис.

5.3. Спектр поглощения водного раствора (рН5,8)оксигемоглобина мышей в

ультрафиолетовой и видимой областях

235

нокислот

(триптофан, тирозин, фенилаланин) белковой части мо-

лекулы гемоглобина.

Однокомпонентные

неокрашенные белки (сывороточный и яич-

ный

альбумины, гамма-глобулин, пепсин, трипсин, рибонуклеаза,

лизоцим,

альдолаза и др.) в отличие от двухкомпонентных окра-

шенных белков (гемоглобин, миоглобин, катал

аза,

пероксидаза,

цитохром с) не поглощают в видимой области спектра. Их спектры

поглощения

располагаются в интервале длин волн от 180 до 290 нм.

Особый интерес представляют две полосы поглощения: с Яшах

V28O

нм

и с

Яшах

~ 190 нм. Полоса при 280 нм объясняется светопогло-

щением

сопряженными ядрами триптофана, тирозина и фенилала-

нина

(рис. 5.4). Интенсивность полосы поглощения каждого данно-

го белка вблизи

275-280

нм зависит от количества в нем хромофор-

ных групп, содержащих л>электроны. Эта полоса поглощения бел-

ковых молекул объясняется возбуждением л>электрона, т.е. пере-

ходом

-л -*л*.

Кроме

остатков ароматических аминокислот в общий спектр по-

глощения

белка определенный вклад (иногда весьма малый) вносят

другие

хромофорные группы. В области

240-300

нм главный вклад

спектр

дают

триптофан, тирозин и фенилаланин. При этом трип-

тофан

даже

при относительно невысоком содержании в белке в зна-

Рис.

5.4. Спектр поглощения

водного раствора сывороточного

альбумина человека

240 260 280 300 320 нм

236

чительной степени определяет характер его спектра, так как моляр-

ный

коэффициент экстинкции (е) его индольного ядра в 4 раза пре-

вышает е тирозина и почти в 30 раз - е фенилаланина.

В области спектра

220-255

нм поглощают серосодержащие ами-

нокислоты

- цистин, цистеин, метионин. В самой коротковолновой

области спектра (190 нм) имеет место светопоглощение хромофора

пептидной

группы белковой молекулы. Пептидная группа -C-N-

ОН

это

важнейший элемент первичной

структуры

белка. Полоса по-

глощения

полипептидов и белков за

счет

пептидной связи с

Дшах

при

190 нм возникает вследствие электронного

перехода

л\ -*л»(рис.

5.5). Уровень л

отвечает

связывающей, уровень л* - несвязываю-

щей

орбите СО-группы, уровень л\ - нссвязывающей орбите азота,

а уровень п -состоянию неподеленнои пары электронов кислорода.

Переход п

-*а*

- ридберговский атомный

переход

в кислороде. Циф-

ры на рис. 5.5 указывают длину волны света (нм), инициирующего

тот или иной электронный переход.

Интенсивность

полосы поглощения вблизи 190 нм зависит от

структурного

состояния белковой молекулы (спирализованная мо-

лекула

или она - в состоянии статистического клубка). Если нагреть

раствор белка и таким способом разрушить спирали Полинга-Кори,

то интенсивность максимума при 190 нм заметно возрастет, а мес-

тоположение полосы поглощения существенно не изменится. Об-

ратный процесс - создание регулярной пространственной

структу-

ры - сопровождается уменьшением интенсивности светопоглощения

полосе пептидной группы белковой молекулы. Это явление назы-

вается

гипохромным

эффектом,

который используется для оценки

степени спиральности (упорядоченности) белков. Измерение гипо-

хромного эффекта пептидных связей имеет то преимущество, что

150 нм

К,

190

165

220

Рис.

5.5. Электронные пе-

реходы в пептидной (амнд-

иой)

группе

237

белок исследуется в растворе, т.е. изучается вторичная

структура

изолированных макромолекул. Напомним, что при рентгенострук-

турном анализе требуется перевод белковых молекул в кристалли-

ческое состояние, что определенным образом их модифицирует.

Полосы поглощения белков, и особенно полоса при 280 нм, чув-

ствительны к разнообразным влияниям, которые

действуют

на л-

электроны ароматических аминокислот. Это - различные типы ком-

плексообразования, ионные и дипольные взаимодействия, образо-

вание водородных и иных связей функциональными группами, при-

соединенными к ароматическим (бензольным, индольным) ядрам.

Анализ спектральных характеристик- белковых образцов

дает

возможность получить надежную информацию о состоянии белко-

вых молекул в норме, в условиях различного их микроокружения,

при

действии физико-химических агентов, при развитии в организ-

ме патологических процессов и др.

Спектры поглощения нуклеиновых кислот, формирующиеся из

спектров поглощения входящих в их состав азотистых оснований,

характеризуются полосой поглощения с максимумом в диапазоне

255-270

нм, что зависит от нуклеотидного состава молекулы биопо-

лимера (рис. 5.6). Основными хромофорами нуклеиновых кислот

являются пуриновые и пиримидиновые основания нуклеотидов. В

состав ДНК

входят

адснин, гуанин (пуриновые), цитозин и тимин

(пиримидиновые азотистые основания); в РНК вместо тимина при-

сутствует

урацил. За светопоглощение ответственна главным обра-

зом л-электронная система

пуриновых и пиримидиновых

колец (л -» л -переходы). По-

лосы поглощения азотистых

оснований с максимумами

около 260 нм отличаются вы-

2 \ \ сокой интенсивностью.

Неко-

торый вклад в общее поглоще-

ние,

особенно в длинноволно-

вой части спектра, вносят

0,5-

0,4

0,3

0,2

0,1

Рис.

5.6. Спектры поглощения на-

тнипон

диухцепочечной ДНК (1), де-

натурированной теплом ДНК (2) и

моиомериых нуклеотидои (3)

220

240 260 280 300 нм

238

л-*л*-переходы с

участием

неподеленной пары электронов

гетероа-

томов азота и кислорода.

Участие

л-»л -переходов проявляется в спектрах поглощения в

виде "плеч" в интервале

280-320

нм. Положение спектров поглоще-

ния

оснований сильно зависит от величины рН раствора из-за обра-

зования

различных ионных форм. Изменение полярности раствори-

теля также оказывает влияние на спектры поглощения оснований

вследствие межмолекулярных взаимодействий. При денатурации

ДНК

наблюдается сдвиг полосы поглощения ее образцов в более

длинноволновую часть спектра с одновременным увеличением экс-

тинкции.

Регистрация и анализ спектров поглощения нуклеиновых кис-

лот, а также нуклеотидов позволили получить весьма полезную ин-

формацию

о радиационно- и фотохимических превращениях их мо-

лекул, о термостабильности, об устойчивости ДНК и РНК по отно-

шению

к различным денатурирующим (модифицирующим) факто-

рам.

Фотосинтез

начинается с поглощения кванта света специализи-

рованными

хромофорами, которые подразделяются на три основ-

ные

группы: хлорофиллы, каротиноиды и фикобилины. Наиболь-

шее значение в фотосинтезе имеют хлорофиллы, и в

первую

оче-

редь хлорофилл а. Вес хлорофиллы (а, Ь, с, d, бактериовидин, бак-

териохлорофилл а, бактсриохлорофилл Ь) интенсивно поглощают

видимый свет. В спектрах поглощения хлорофиллов обнаружива-

ются четыре полосы: три в красно-желтой и одна в синей области

(рис.

5.7). Положения максимумов в спектрах поглощения хлоро-

филлов

в клетке и органических растворителях не совпадают. Так,

например,

для хлорофилла а в органических растворителях харак-

терны наиболее интенсивные полосы поглощения при 430 (полоса

Соре) и 660 нм, а в клетке зеленых растений - полосы поглощения

при

435 (полоса Соре) и

661-710

нм (несколько форм пигмента). В

органических растворителях в спектре поглощения хлорофилла b

наблюдаются полосы при 453 и 643 нм, а в клетке - полосы погло-

щения

при 480 и 650 нм. Для бактериохлорофилла а в органических

растворителях характерны полосы поглощения при 365, 605 и 770

нм,

а в клетке - красные полосы (800, 870, 890 нм). Максимумы по-

глощения

в красно-желтой области спектра формируются сложной

комбинацией

двух

электронно-колебательных л

-»л*-переходов.

Два электронных л -»

л»-перехода

ответственны также за появле-

ние

полосы Соре. Тот факт, что спектры поглощения фотосинтети-

ческих пигментов в клетках зеленых растений сдвинуты в длинно-

239

D/c

0,2-

0,0

Рис.

5.7. Спектры

поглощения

хлоро-

филлов

в (1) и в (2) в

эфире.We - удельный

коэффициент

погло-

щения

(с - концентра-

ция,

г/л)

380 420 460 500 540 580 620 660 700

НМ

волновую область по сравнению с таковыми для растворов в органи-

ческих растворителях, указывает на интенсивный характер взаимо-

действия пигмент-микроокружение. Особо

важную

роль при этом,

вероятно,

играют пигмент-белковые, пигмент-липидные и пигмент-

пигментные слабые физико-химические взаимодействия.

Следует

отметить, что благодаря

глубокому

изучению и интерпретации

спектров поглощения фотосинтетических пигментов были выявле-

ны

фотофизические стадии такого уникального фотобиологического

процесса, как фотосинтез.

Зрительный

пигмент родопсин - сложный белок, молекулы кото-

рого пронизывают липидный бислой мембран зрительных дисков.

Родопсин

состоит из гликопротеидной части - опсина и хромофор-

ной

группы - ретинальдегида (ретиналя). Последний может иметь

несколько

пространственных изомеров, например, 9-цис-ретиналь,

11-цис-ретиналь, полностью-транс-ретиналь и др. Только 11-цис-

ретиналь структурно

соответствует

центру связывания ретиналя на

белке (опсине) и

образует

с ним прочный комплекс.

Спектральные свойства родопсина обусловлены взаимодействием

хромофора с опсином. Максимум спектра поглощения изолирован-

ного ретиналя лежит около

370-380

нм, а максимум поглощения оп-

сина

- при 278 нм. Взаимодействие 11-цис-ретиналя с опсином со-

240