Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

образом, только вместо разности концентраций используют раз-

ность осмотических давлений наружного раствора л

и внутреннего

содержимого клетки л \:

Иногда

проницаемость воды определяется по скорости изменения

объема клетки в гипотонических и гипертонических растворах. В

данном

случае

под коэффициентом проницаемости понимают коли-

чество воды, проникающей в единицу времени через единицу по-

верхности при разности осмотических давлений в одну атмосферу.

Для многих неэлектролитов проницаемость биологических мемб-

ран

хорошо коррелировала с их способностью к растворению в

оливковом масле (рис. 4.24 и 4.25).

Анализ приведенных результатов свидетельствует о том, что мо-

Высокая

проницаемость

Гидрофобные

»j

-v-'-'l

молекулы

Бензол

Небольшие

и О

полярные

Глицерол

молекулы

СО

Большие

^^^Ч

незаряженные

i™^ X)

полярные

сахароза

молекулы

Ионы

Н,0

Мочевина

Глицерол

Триптофан

Глюкоза

CI"

Искусственный

липидный

бислой

Рис.

4.24. Относительная проницаемость

искусственного липидного бислоя для различ-

ных классов

молекул

10"'

10"

10 '

10'

Низкая

проницаемость

Рис.

4.25. Коэффициенты про-

ницаемости искусственного липид-

ного бислоя для различных моле-

кул и ионов

211

лекулы, имеющие примерно одинаковую массу

размер, поступа-

ют через мембрану

тем

легче,

чем

выше

их

растворимость

липи-

дах.

Так,

молекулы пропиленгликоля диффундируют через мемб-

рану примерно

в 20

раз быстрее мочевины.

Однако проницаемость ряда неэлектролитов

не

подчиняется этой

закономерности.

Высокой проницаемостью обладают метанол, фор-

мамид, вода. Р.Колландер объяснил этот факт наличием

мембране

неспециализированных

каналов

(пор),

которые заполнены водой

легко пропускают молекулы малых размеров.

Для

растворенных

воде крупных молекул неэлектролитов остается путь проникнове-

ния

через предварительное растворение

липидной фазе мембран,

это

возможно только после разрушения

всех

водородных связей,

образованных полярными группами молекулы

молекулами воды.

В ряде случаев скорость диффузии некоторых водорастворимых

веществ

во

много

раз

выше,

чем

скорость диффузии этих веществ

липидной

фазе. Такое явление получило название облегченной

диффузии.

Облегченную диффузию

биомембранах осуществляют специ-

фические

молекулы (чаще всего белки), образующие каналы

или

связывающие транспортируемую частицу

на

одной стороне мембра-

ны,

переносящие

ее в

виде комплекса

отдающие

водную

среду

на

противоположной стороне,

без

потребления энергии непосредст-

венно

этом процессе. После отщепления транспортируемого иона

молекулы переносчика возвращаются

исходное положение

(рис.

4.26).

Обнаружены белки-каналообразователи

подвижные белки-пе-

Транслортируемое

вещает

"Понг

Пинг"

Транспортный

белок,

осуществляющий

облегченную

диффузию

Рис.

4.26. Схема, показывающая как конформационные изменения в белке-пере-

носчике могли обеспечить облегченную диффузию незаряженного расворенного ве-

щества

А. Белок может существовать в двух различных конформациях, что приводит

транспорту вещества А по градиенту концентрации

212

ренрсчики.

Для

изучения механизма облегченной диффузии

экс-

периментах

искусственными мембранами широко применяют

ан-

тибиотики. Примером подвижного мембранного переносчика может

служить

валиномицин, транспортирующий ион калия,

каналооб-

разователя

грамицидин, осуществляющий трансмембранный

пе-

ренос ионов натрия

по

градиенту концентрации. Зависимость

ско-

рости транспорта переносимых частиц

от

концентрации ионов

по-

казана

на

рис.

4.27.

Диффузия

помощью

белка-переносчика

Рис.

4.27. Кинетика

облегченной диффу-

зии

через

мембраны

при участии белка-

переносчика и кана-

лообразующего белка

Концентрация транспортируемых

молекул

Валиномицин, выделенный

в 1955 г.

Г.Брокманом,

неполярных

растворителях легко связывается

устойчивые комплексы

ионами

калия,

рубидия, цезия,

но

почти

не

образует

комплексов

ионами

натрия.

Отношение селективности

по

калию по сравнению

ионами

натрия составляет

- 10

раз.

В неполярных

средах

конформация валиномицина

сходна

брас-

летом

шестью внутримолекулярными связями,

а в

воде

она

пере-

ходит

открытую форму. Ион калия проникает

во

внутреннюю по-

лость антибиотика, почти точно

соответствующую

негидратирован-

ному иону калия

(г - 0,133

нм)

рубидия

(г - 0,149

нм). Но

эта

по-

лость велика

для

иона натрия

(г -

0,098

нм)

мала

для

иона цезия

(г-0,165нм).

Молекулярное окружение иона калия

валиномицине заменяет

гидратную

оболочку

за

счет

комплексообразования шести ион-ди-

польных взаимодействий иона

переносчиком.

Внешняя

сфера комплекса

за

счет

молекулы валиномицина оста-

ется гидрофобной

легко проницаемой

для

бирядного слоя липидов

мембраны. Валиномицин снижает энергетический барьер проница-

213

емости липидных слоев, он активен при концентрациях 10" - 10"

моль/л, которые не изменяются в процессе переноса ионов. Четко

выражен феномен насыщения при увеличении концентрации ионов

калия

("субстрата"),

что описывается уравнением Михаэлиса-Мен-

тен для ферментов. Валиномицин во многих отношениях к транс-

порту ионов калия и рубидия подобен ферменту. К

тому

же валино-

мицин,

проявляя биологическую активность,

служит

высокоэффек-

тивным антимикробным средством.

Подобное действие проявляют антибиотики энниатиновой

груп-

пы,

но их меньший эффект переноса объясняют более открытой

структурой

комплекса и более выраженным контактом гидрофиль-

ной

части иона с гидрофобным слоем мембраны.

Особый интерес исследователей привлекли антибиотики с незам-

кнутой полиэфирной цепью - моненсин, нигерицин, кальцимицин

др. как переносчики ионов кальция. Ион Са

удерживается за

счет

ион-дипольных взаимодействий

между

двумя

молекулами ан-

тибиотика

("модель

сандвича").

На

основе принципов функционирования ионофоров в фармако-

логии, химической и медицинской технологии используют синтети-

ческие молекулярные "ловушки" для ионов и полярных соедине-

ний,

например, полиэфиры или "краун-эфиры". Они избирательно

взаимодействуют с ионами ряда металлов и аминокислотами. Необ-

ходимо подчеркнуть, что ионофоры до настоящего времени досто-

верно не обнаружены в биологических мембранах. Многочисленные

исследования ионной проводимости биологических мембран неос-

поримо доказали функционирование неподвижных переносчиков,

осуществляющих облегченную диффузию

путем

образования ион-

ных каналов.

Впервые идею о функционировании мембранных каналов выска-

зали в

40-50-х

гг. XX в. А.Ходжкин и Э.Хаксли для объяснения воз-

никновения

и распространения нервного (электрического) импуль-

са. Каналы должны обладать селективностью и обратимо менять

ионную проницаемость биологических мембран в доли секунды. На

роль ионных каналов были выдвинуты белки-каналообразователи,

что хорошо согласовывалось с теорией и экспериментальными ре-

зультатами

по изучению кинетики мембранной проницаемости для

ионов

во время развития возбуждения в нервной и мышечной тка-

нях и клетках.

Сущность белков-каналообразователей была раскрыта благодаря

усилиям ряда

ученых,

использовавших такие антибиотики, как

грамицидин А, амфотерицин В, аламетицин и др.

214

Грамицидин был выделен Р.Дюбо (1939). Молекулярная струк-

тура

его была исследована в 1965 г. Р.Сарджером и Б.Виткопом.

Ими

было установлено, что грамицидин - линейный пентадекапеп-

тид с чередующимися L- и D-конфигурациями аминокислотных ос-

татков. К -1976 г. С.Хладки и Д.Хейдон окончательно обосновали

положение о том, что грамицидин формирует мембранный канал.

Согласно модели Д.Урри (США) и Г.Рамачандра

(Индия),

пред-

ложенной

в 1971-1972 гг., две молекулы грамицидина образуют по-

лый цилиндр, в котором полярные группы находятся внутри. По

модели Э.Блоутера и Б.Витчема (1974), две молекулы грамицидина

образуют двойную спираль с осевой полостью около 0,3 нм. За одну

секунду по каналу может проходить до 10 ионов, что примерно в

1(граз превышает производительность действия белков-переносчи-

ков.

Такой

антибиотик, как амфотерицин В, образует агрегаты из 8-

16 молекул, обращенных к водной среде и составляющих полупору;

две полупоры формируют канал.

Особый интерес как модель потенциалзависимого ионного кана-

ла представляет пора, состоящая из 6-10 молекул амфотерицина с

внутренним диаметром до 1,5 нм. Такие каналы увеличивают про-

ницаемость липидных мембран для одновалентных ионов при при-

ложении электрического поля.

В отсутствие электрического поля ион-проводящие каналы не

формируются. При приложении разности потенциалов к мембране

происходит ее конформационная перестройка, заканчивающаяся

появлением

ион-проводящих форм. По гипотезе Р.Мюллера, моле-

кулы аламетицина, сконцентрированные на поверхности мембра-

ны,

под действием электрического поля ориентируются перпенди-

кулярно к поверхности мембраны за счет взаимодействия поля с по-

лярной

С-концевой частью молекулы,

тогда

как гидрофобная

а-спиральная часть остается погруженной в липидную фазу. Карбо-

нильная

группа а—спирали с высоким дипольным моментом смеща-

ется в противоположную сторону, формирует ионный канал. Эту

модель можно использовать как простейшую электровозбудимую

структуру.

Белки-каналообразователи были обнаружены в биомембранах.

Ионные

каналы

биомембран - это специализированные, селек-

тивные поры, образованные белковыми молекулами, предназна-

ченные для облегченной диффузии определенных ионов (Na

, K

Са

,СГ). Ионные каналы расположены в наружной клеточной

мембране и мембранах ряда органелл (митохондрии, эндоплазма-

215

тическая сеть, саркоплазматический

ретикулум

и др.).

Выделяют

три самостоятельные транспортные системы в

возбудимых

мембра-

нах - Na

-, K

-, Са

-каналы, сходные по своим функциям, но от-

личающиеся избирательностью (селективностью), что позволяет

говорить об общности происхождения этих образований в процессе

эволюции.

Для исследования

структуры

и функций ионных мембранных ка-

налов используют ряд методов. Высокоинформативным оказалось

использование селективных блокаторов ионных каналов. Тетродо-

токсин,

сакситоксин, батрахотоксин избирательно блокируют на-

триеые и тетраэтиламмоний-калиевые каналы, изоптин, лантан -

кальциевые каналы. Метод измерения воротных токов (флуктуа-

ции

ионных токов) позволил изучить функционирование одиноч-

ных каналов.

возбудимых

мембранах число ионных каналов на 1 мкм по-

верхности мембраны

достигает

нескольких сотен. Пропускная спо-

собность одиночного натриевого канала составляет 10 ионов/с,

проводимость составляет от 1-2 до 10 пСм.

Модель ионного канала включает ряд функциональных образо-

ваний.

С внешней стороны мембраны у

входа

в канал расположен

селективный центр (центр узнавания), в основе функционирования

которого лежит принцип стерического соответствия. Его назначе-

ние

- не пропускать в канал или из канала ионы большего и мень-

шего размеров, а со стороны цитоплазмы располагаются так назы-

ваемые "ворота", которые управляются трансмембранным электри-

ческим полем при помощи конформационно-лабильного электриче-

ского сенсора. По каналу ионы проходят по эстафетному принципу,

друг

за

другом.

Ворота

могут

находиться в

двух

состояниях: "откры-

то 3ft: закрыто".

Решающую роль в функционировании канала играет электроста-

тический заряд его внутренней поверхности, что

делает

ее гидро-

фильной,

проницаемой для ионов. Определенную роль при этом вы-

полняет подвижность липидного окружения.

Модель ионного канала объясняет многие экспериментальные

данные и

обладает

предсказуемостью.

Б.Хилле считает, что механизм проведения ионов связан со спо-

собностью отрицательно заряженного атома кислорода селективно-

го центра взаимодействовать с молекулой воды катиона или иона-

ми,

имеющими - ОН-и - NHj-группы,

путем

образования водо-

родных связей, что обеспечивает скольжение иона по каналу. Гид-

рофобные группы молекул (-СНз) не в состоянии этого сделать. Вот

216

почему, по его мнению, гидроксиламин

НзМ

-ОН

и гидразин H3N -

NH2

проходят по натриевому каналу, а метиламин

Нз-СНз

не

проходит.

Селективность ионного канала не абсолютна. Натриевый

канал пропускает ионы Na

, Ii

, К

, Rb

, Cs

в разной степени.

Приняв проницаемость ионов натрия за единицу, получают ряд

проницаемости

этих

ионов:

1:1,1:0,083:0,025:0,016.

Ряд

малых органических катионов проходит по натриевому кана-

лу. Б.Хилле

(1984)

указывает на такую последовательность: на-

трий>гидроксиламин>гидразин>аммоний « формамидин » гуани-

дин гидроксигуанидин >аминогуанидин»метиламмоний.

Металь-

ная

группа

в отличие от гидроксильной и

аминогруппы

не образует

водородных связей. Замена в органическом ионе -ОН" и -NHJ

групп

на метальную затрудняет его прохождение по каналу.

Размеры

входа в натриевый канал по модели Б.Хилле 0,3 х

хО,5

нм. И он имеет прямоугольную форму. Селективный фильтр ка-

нала включает 8 атомов кислорода, которые взаимодействуют пу-

тем

образования водородных связей с молекулой воды проникаю-

щего иона натрия, который был частично дегидратирован при

вход-

жении

в канал.

Для

установления структуры и выяснения механизма функцио-

нирования ионных каналов много информации дал метод ингиби-

торного анализа. Одна молекула тетродотоксина и сакситоксина

блокирует один натриевый канал, что позволило определить их ко-

личество на единицу поверхности мембраны и изучить воротные

токи.

Деполяризация мембраны смещает ионы кальция, находящиеся

в ионном канале, что приводит к изменению положения частиц ка-

нала и переводит канал в состояние "открыто-закрыто". Теоретиче-

ские расчеты хорошо согласуются с полученными эксперименталь-

ными

данными.

Установлена экспоненциальная зависимость между

начальным

изменением мембранного потенциала и

пиковым

значением ионной

проводимости для натрия: деполяризация мембраны на 4-6 мВ при-

водит к е-кратному повышению проводимости

gNa

ои

8Ыа

тах

8Na

1+bexpi-zaF/RT)

где b - множитель, не зависящий от

<р\

г - валентность гипотетиче-

ского иона; а - число, выражающее долю напряжения, действующе-

го на ион.

Если

каждый ионный канал может находиться только в одном со-

стоянии "открыто-закрыто", то количество активированных кана-

217

лов обеспечивает разную степень деполяризации при действии

раз-

личных факторов

на

возбудимую мембрану,

что

может привести

возникновению

потенциала действия.

Механизмы

активного

мембранного

транспорта

Выше было показано,

что

активный транспорт

- это

трансмемб-

ранный

перенос ионов против электрохимического градиента

за

счет энергии гидролиза

АТФ

специальными транспортными АТФа-

зами.

Принцип

работы АТФаз-насосов основан

на

конформационных

перестройках белковой макромолекулы

при

взаимодействии

транспортируемым ионом. Кальциевый насос представлен АТФа-

зой

полипептидной цепью

молекулярной массой около

100 000

Да.

В.Б.Ритов

Ю.А.Владимиров выделяют четыре этапа процесса

переноса кальция (рис.

4.28).

мембрана

Ф-( ( Са" Са"

—•*•

Рис.

4.28. Основные

этапы сопряженного с

гидролизом АТФ перено-

са

ионов

кальция

через

биологическую мембрану.

Конформационные изме-

нения фермента

обеспе-

чивают

активный

транс-

порт ионов (пояснения в

тексте)

Первый

этап работы

Са

-АТФазы

связывание компонен-

тов: иона

Са

комплексом Mg-АТФ. Присоединение ионов Mg

-2+

Са

идет

на

наружной поверхности саркоплазматичсской мембра-

218

•J

ны

к разным участкам переносчика. При связывании иона Са ос-

вобождается энергия в 37,4 кДж/моль:

Са

АТФаза + (Mg

-ATO) - Ca

-ATOa3a-Mg

-ATO.

Константа связывания иона Са

составляет 10 л/моль.

Второй

этап работы насоса - гидролиз АТФ с образованием

фермент-фосфатного комплекса (Е ^Ф). Константа связывания -

около 5- 10

л/моль.

Переход комплекса Е-АТФ в

Е-АДФ

происхо-

дит с малым перепадом энергии. Свободная энергия гидролиза АТФ

израсходовалась на синтез Е 'уф.

Третий этап работы фермента - транслокация: переход центра

связывания кальция на противоположную (внутреннюю) сторону

мембраны. Для отрыва прочно связанных ионов кальция необходи-

ма энергия, которая доставляется за счет гидролиза макроэрга

АТФ. Транслокация идет с затратой энергии около 19,6 кДж/моль

или около 17,8 кДж/моль расходуется на переход связанного в ком-

плексе иона кальция в растворимое состояние. Суммарная затрата

энергии на перенос через мембрану и освобождение иона Са

на

внутренней поверхности мембраны

требует

затрат 19,6 + 17,8 - 37,4

(кДж/моль). При гидролизе одного моля АТФ освобождается около

40 кДж, что достаточно для переноса

двух

молей ионов Са

через

мембрану из цитоплазмы, где концентрация их (1+ 4)- 10

моль/л, внутрь саркоплазматического ретикулума, где концентра-

ция

Са равна (1 + 10)

•

10'

моль/л.

Четвертый этап функционирования кальциевого насоса со-

стоит в конформационных перестройках, приводящих к транслока-

ции

кальцийсвязывающих центров на наружную сторону мембраны

(в

исходное положение). Таким путем завершается цикл переноса

иона

кальция против концентрационного градиента за счет исполь-

зования

энергии гидролиза АТФ.

Более сложную

структуру

и механизм функционирования имеет

-К -насос, осуществляющий в обычных условиях противогради-

ентный перенос через мембрану

трех

ионов натрия из клетки и на-

качивающий два иона калия внутрь клетки. Условно в работе Na

-насоса выделяют шесть этапов (рис.

4.29):

1. Связывание

трех

ионов Na

и фосфорилирование АТФазы на

внутренней поверхности мембраны:

3Na

+ М§

-АТФ + Е

-•

-АДФ

+ (ЗЫа

)-Е~Ф.

2. Транслокация комплекса со связанными ионами натрия на на-

ружную

поверхность мембраны.

3. Перевод ионов натрия в межклеточную жидкость и присоеди-

нение

из нее

двух

ионов калия:

219

Внеклеточное

пространство

Цитоплазма

Рис.

4.29.

Схема

функционирования

Na+,

K+АТФазы

O(3Na

) + 2К

-•

ф(2К

) + 3Na

4. Гидролиз АТФ

отщеплением молекулы фосфорной кислоты:

Е~Ф(2К

)

-Е(2К

)+Ф.

5. Вторая транслокация: перенос связанных ионов

через мемб-

рану

наружной поверхности

на

внутреннюю:

Е(2К

)

(2К

)

Е .

6. Завершение цикла: отсоединение

двух

ионов калия, присоеди-

нение

трех

ионов натрия

фосфорилирование молекулы АТФазы:

3Na

+ Mg

-ATФ + (2К

)

- Е -

2К

Mg^-АДФ

+ Ша

)-Е~Ф.

При

обычном режиме функционирования Na

-K

-Hacoca внутрь

клетки переносится

2К

выводится 3Na

что

приводит

наруше-

нию электронейтральности

появлению разности потенциалов

между

внешней средой

цитоплазмой. Внутренняя сторона мемб-

раны заряжается отрицательно

по

отношению

наружной. Следо-

вательно,

Na -К

-насос функционирует

как

электрогенный

меха-

низм.

При

изменении соотношений концентраций ионов натрия

калия,

величины потенциала покоя

других

условий перенос ионов

натрия

калия может происходить

соотношениях

1:1, 2:1, 3:1.

220