Артюхов В.Г., Ковалева Т.А., Шмелев В.П. Биофизика

Подождите немного. Документ загружается.

Мембраны подразделяются на проницаемые, полупроницаемые,

избирательно-проницаемые.

Проницаемые

мембраны

- это мембраны, одинаково хорошо про-

пускающие ионы, молекулы веществ в обоих направлениях.

Полупроницаемые

мембраны

- это мембраны, через которые про-

ходят

только одни вещества в прямом и обратном направлении, а

другие

вещества вообще не проходят.

Избирательно-проницаемые

(селективные)

мембраны

- это

мембраны, избирательно пропускающие одни соединения и не про-

пускающие близкие по

структуре

вещества. Селективность обычно

бывает относительной и выражается коэффициентом селективно-

сти: отношением коэффициентов проницаемости для

двух

ионов,

соединений.

Чтобы избежать некорректных оценок, необходимо четко разли-

чать такие понятия, как проницаемость мембраны и накопление ве-

щества в клетке.

Проницаемость

мембраны

для ионов, веществ -

понятие динамическое, определяемое количеством их молей, про-

никающих через единицу поверхности в единицу времени, т.е. ко-

эффициентом

проницаемости. Понятие

накопление

вещества

клетке эквивалентно понятию "содержание, концентрация" веще-

ства в клетке и определяется количеством химически связанного

данного соединения с веществом цитоплазмы, количеством адсор-

бированного и количеством физически растворенного вещества.

целью изучения проницаемости мембран для ионов, молекул

веществ применяют различные методы: биофизические, биохими-

ческие, физиологические. Одни из них позволяют с высокой точно-

стью проводить количественные измерения, а

другие

пригодны

только для сравнительного качественного анализа и отвечают на

вопрос: больше или меньше проникает вещества при одних и тех же

условиях. В тех

случаях,

когда проницаемость мембраны для веще-

ства незначительна, а химическое сродство к веществам, входящим

в цитоплазму, высоко, накопление вещества идет медленно, но ито-

говая внутриклеточная концентрация его может достигать высоких

величин.

Проницаемость мембран, в том числе и биологических, для раз-

личных соединений, ионов изучают разными методами, которые

должны удовлетворять следующим требованиям:

- они позволяют исследовать кинетику поступления анализируе-

мого вещества в клетку;

дают

возможность работать с таким минимальным количеством

вещества, которое не изменяет проницаемость мембран;

201

- они позволяют трактовать однозначно полученные результаты.

Наиболее полно этим требованиям удовлетворяет метод радиоак-

тивных изотопов, при использовании которого были получены ос-

новные

результаты по определению ионных потоков при развитии

потенциала действия, измерены скорости поступления и вовлече-

ния

в обменные процессы клетки биологически важных веществ -

углеводов, в том числе глюкозы, аминокислот, белков, липидов,

нуклеиновых кислот.

Метод радиоактивных изотопов используют для контроля ре-

зультатов, полученных другими методами: химическими, индика-

торными,

осмотическими, физиологическими и измерения электро-

проводности. Это наиболее информативный, надежный, высокочув-

ствительный метод, но требующий специально оборудованной ла-

боратории и использования радиоактивно-меченых препаратов. По-

этому довольно часто применяют метод измерения электропровод-

ности,

который относительно прост, позволяет исследовать динами-

ку поступления и выведения веществ из клетки, регистрировать

суммарные ионные потоки через мембрану, однако он пригоден для

изучения проницаемости мембран только для ионов.

Химический

метод

сводится к определению убыли химического

соединения

из инкубируемой среды или поступления молекул ве-

щества непосредственно в клетку. По

существу

это метод химиче-

ского микроанализа. Однако для обнаружения факта поступления

вещества в клетку необходимо иметь объект крупных размеров, что

сразу же ограничивает выбор объектов исследования, позволяет ра-

ботать с несколькими организмами, имеющими гигантские клетки.

Метод определения проницаемости мембран по убыли химического

соединения

из среды всегда встречает возражение, поскольку убыль

вещества может происходить за счет адсорбционных процессов без

проникновения

через мембрану.

Индикаторный

метод

является разновидностью химического

метода. Он основывается на использовании диссоциирующего веще-

ства, ионы или молекулы которого имеют определенный цвет. Зона

перехода (зона виража), в которой происходит изменение цвета,

зависит от степени диссоциации молекул:

КА

^ГГ К

А'.

Индикаторами

служат

органические кислоты, основания, соли.

Для растительных клеток используют природные индикаторы,

находящиеся непосредственно в них (антоцианы). Когда клетки по-

мещают в

среду,

содержащую кислоты или основания, по мере их

202

проникновения

через мембраны

будет

меняться рН внутриклеточ-

ной

среды, что приведет к изменению окраски.

Для введения индикатора в клетку в значительных количествах

клетки

и ткани предварительно помещают на несколько часов в

раствор красителя, приготовленного на физиологическом растворе.

Как

правило, сильные кислоты и щелочи проникают в клетку

только после повреждения биомембран. Скорость изменения вели-

чины

рН внутриклеточной среды сильно отстает от кинетики про-

ницаемости

из-за значительной буферной емкости внутриклеточ-

ного содержимого.

Индикаторный

метод является качественным методом, позволя-

ющим ответить на вопрос, проникает ли данное вещество в клетку и

с какой первоначальной скоростью. Его можно использовать для

сравнительной оценки проницаемости веществ гомологического ря-

да, когда известно отличие в

структуре

вещества.

Группа осмотических методов включает измерения объема кле-

ток

и тканей по мере проникновения молекул вещества в клетку за

счет изменения осмотического давления в них и за счет разности в

скоростях проникновения молекул веществ, в том числе и воды.

Скорость проникновения воды через мембрану значительно выше

скоростей проникновения молекул

других

веществ. Поэтому при

изменении

осмотического давления внутри клетки этот процесс бу-

дет сопровождаться входом или выходом воды из клетки, что приво-

дит к изменению ее объема. Так, если поместить клетки в слабый

гипертонический раствор, содержащий исследуемое вещество, то

первоначально за счет выхода воды из клеток суммарный объем бу-

дет уменьшаться, но по мере проникновения исследуемого вещества

клетки суммарный объем их

будет

возвращаться к исходным ве-

личинам.

По скорости нормализации объема клеток можно судить о

скорости проникновения различных веществ через биомембрану.

Из

анализа данных, приведенных на рис. 4.22, можно сделать за-

ключение о том, что вещество А не проникает в клетки (кривая 1),

вещество Б (кривая 2) проникает через мембрану значительно мед-

леннее,

чем вещество В, которое для мембран клеток в данных ус-

ловиях имеет максимальную проницаемость (кривая 3).

Исторически

осмотические методы были раньше

других

методов

использованы для изучения проницаемости биологических мембран

как

на растительных (по скорости плазмолиза и деплазмолиза), так

на животных клетках. Удобной моделью для исследования прони-

цаемости биомембран животной клетки оказались эритроциты. Оп-

ределив их гематокрит (процентный объем, занимаемый эритроци-

203

100

Рис. 4.22.

Определение

скорости

(v)

проникнове-

ния веществ

А, Б, В по из-

менению объема эритроци-

тов после помещения

их в

слабые гипертонические

растворы: 1,2,3

соответст-

i i i i . i • • i . i венно для веществ А,Б,В

10 20 30 40 GO 60 70 80 ВО

100 110

1»

мин

тами

по

отношению

общему объему

тонких калиброванных

тру-

бочках), можно было судить

скорости возврата эритроцитарных

клеток

исходному объему после помещения

их в

слабогипертони-

ческий

раствор. Измерения гематокрита проводят через каждые

пять

минут.

Это по

существу

качественный метод анализа

для про-

ведения сравнительных исследований.

А.И.Терсковым

И.И.Гительзоном

(1957)

был

предложен метод

эритрограмм, позволивший исследовать кинетику поступления

эта-

лонного вещества (соляной кислоты) через мембрану эритроцитов

(метод кислотных эритрограмм). Сущность

их

метода состоит

том,

что по

мере проникновения соляной кислоты

эритроцит

про-

исходит распад молекулы гемоглобина: тетрамер распадается

на ди-

меры

мономеры,

что

увеличивает осмотическое давление внутри

клетки.

Вода

входит

эритроцит, растягивает мембрану

до

крити-

ческой величины,

результате

чего происходит разрушение мемб-

раны

выход

гемоглобина

раствор. Исследуя светопропускание

взвеси эритроцитов, можно записать кинетику изменений объема

эритроцитов.

Данный метод оказался весьма информативным

для

модифицированных

естественным

или

искусственным путем мемб-

ран

эритроцитов: стали регистрировать интегральные, дифферен-

циальные

разностные эритрограммы. Анализ последних позволя-

ет характеризовать составные части пула эритроцитов здоровых

больных людей

по

их

гемолитической стойкости.

качестве гемо-

литиков

используют, кроме кислот, щелочи, гипотонические

рас-

творы,

другие

вещества.

Таким

образом,

для

исследования проницаемости биологических

мембран

существует

ряд

информативных методов;

зависимости

от

цели экспериментов необходимо применять адекватные методы

объекты исследования.

204

7а. Пути проникновения веществ

через биологическую мембрану

Из

вышеизложенного

следует,

что биологическая мембрана име-

ет высокоорганизованную

структуру,

которая содержит специали-

зированные

образования как для прохождения ионов по градиенту

(каналы),

так и для транспорта их против электрохимического гра-

диента ("насосы"), функционирующие с затратой энергии АТФ, ре-

цепторы, энергопреобразующие механизмы и структуры, обеспечи-

вающие биоэлектрогенез, а также

другие

образования и молекуляр-

ные

машины. Через биомембрану проникают вещества, необходи-

мые для обеспечения жизнедеятельности клетки, и выводятся про-

дукты обмена - газы, водорастворимые и жирорастворимые вещест-

ва. Биомебрана в состоянии перенести соединения, имеющие моле-

кулярную массу от нескольких дальтонов до нескольких сотен ки-

лодальтонов (за счет пиноцитоза и фагоцитоза).

Для понимания механизма переноса веществ через мембрану

проанализируем пути проникновения, движущие силы и механиз-

мы их транспорта. Очевидно, что для переноса различных веществ

через мембрану

существуют

многие пути и механизмы в одной и

той же клетке. В то же время у разных клеток одного и того же ор-

ганизма и организмов, стоящих на различных эволюционных сту-

пеньках, имеются сходные пути, движущие силы и механизмы

транспорта.

Пути переноса веществ через биомембраны разнообразны для

различных транспортируемых молекул и ионов. Однако переноси-

мые соединения и ионы можно объединить в родственные группы по

определенным характеристикам: молекулярной массе, электриче-

скому заряду, количеству полярных групп или наличию ярко выра-

женной

гидрофобности и т.д.

Ионы,

молекулы веществ

могут

про-

никать

через мембрану по всей ее поверхности, через

кинки

структуре

липидного бирядного слоя, через каналы, "насосы", с по-

мощью переносчиков (пермеаз). Крупные молекулы белков, ДНК,

РНК,

их комплексы

могут

проникать путем структурной пере-

стройки

биомембраны в виде фагоцитозных пузырьков. Ясно, что

преобладающие пути проникновения для нейтральных молекул га-

зов

будут

одни, для воды - другие, для ионов - третьи.

По

всей поверхности мембраны проникают вещества, хорошо

растворяющиеся в липидах. С уменьшением полярности молекул в

гомологическом

раду

класса веществ проницаемость их возрастает.

Было

выявлено, что наркотическое действие некоторых веществ

пропорционально

их растворимости в липидах. Молекула воды про-

205

никает

через водосодержащие участки мембраны: каналы,

кинки,

заполненные

водой поры, дефекты в жидкокристаллической струк-

туре

мембраны, через каналы эндоплазматической сети, открываю-

щиеся

на поверхности клеток при

пино-

и фагоцитозе.

Молекулы диссоциирующих веществ (кислот, солей, оснований)

нераспавшемся состоянии

могут

транспортироваться через веще-

ство мембраны, а ионы - через каналы, водосодержащие участки по

электрохимическому градиенту. Известно, что уменьшение степе-

ни

диссоциации молекул приводит в большинстве случаев к увели-

чению их проницаемости через мембраны.

Силы,

определяющие величину пассивной проницаемости ве-

ществ через мембрану, выражаются величинами градиентов.

Под

градиентом понимают разность величин, приходящуюся на

единицу длины (см.

главу

2). В клетке обычно выделяют следую-

щие

градиенты: концентрационный, электрический, температур-

ный,

градиент концентрации ионов водорода:

Ce-Ci/Al;

<р\-<р

/&1;

или dC/dl; a>/dl.

Если

учесть, что толщина биомембраны колеблется в пределах 8-

12 нм, то градиенты достигают огромных величин. Так, электриче-

ский

градиент при трансмембранной разности в 100 мВ составит

100000

В/см; при разности температур

между

клеткой и межкле-

точной жидкостью в 0,1 °С температурный градиент составит

100000

°С/см. Сопоставимы с этими величинами и концентрацион-

ные

градиенты. Это большие движущие силы, обеспечивающие зна-

чительную проницаемость веществ. На мембране при проникнове-

нии

ионов концентрационный и электрический градиенты

могут

действовать в одном и том же направлении или в противоположных

направлениях. Поэтому в данном

случае

говорят о наложении, су-

перпозиции

градиентов, или об электрохимическом градиенте, ког-

да активной силой

будет

определяющая, результирующая составля-

ющая.

Переносчиками

мембраны являются специальные молекулы,

способные вступать в непрочные соединения с транспортируемым

веществом и в виде комплекса проникать через мембрану, а на про-

тивоположной ее стороне распадаться вновь на молекулу перенос-

чика

и на ион или молекулу транспортируемого вещества. Транс-

порт веществ осуществляется за счет разности физико-химических

условий внутри клетки и в межклеточной жидкости или во внешней

среде. Энергия АТФ в самом акте переноса веществ не расходуется,

она

требуется для поддержания постоянства физико-химических

показателей в цитоплазме и на наружной поверхности клеток.

206

Было

высказано мнение о том, что многие вещества имеют свои

специфические

переносчики, на роль которых стали претендовать

фолиевые кислоты, пермеазы - ферменты-переносчики; были пред-

ложены схемы, объясняющие транспорт веществ через мембрану с

участием переносчиков.

Подчеркнем,

что за счет переносчиков может идти противогради-

ентный

перенос без затраты энергии фосфорных связей.

Одновременно с падением интереса к изучению транспорта ве-

ществ за счет переносчиков возрастало количество исследований по

каналообразователям и механизмам активного транспорта веществ,

первую очередь ионов. Противоградиентный перенос ионов мог

быть объяснен использованием энергии АТФ в элементарном

трансмембранном ионном транспорте. На эту роль претендовали

крупные молекулы биополимеров, способные гидролизовать моле-

кулу

АТФ и использовать освобождаемую энергию для конформа-

ционных

собственных перестроек, приводящих к трансмембранно-

му транспорту определенного вида ионов. Такими молекулами,

"насосами"

мембран клеток оказались АТФазы: Na

-, К

-, Са

- и

-насосы.

Механизмы функционирования "насосов" клетки

будут

рассмот-

рены

ниже, а сейчас отметим признаки активного транспорта:

- возможность противоградиентного трансмембранного переноса

ионов;

- использование для переноса энергию гидролиза АТФ;

- наличие специализированных крупных молекул-ферментов,

осуществляющих гидролиз АТФ, соединение с переносимым ионом,

использование энергии гидролиза для ряда конформационных пере-

строек молекулы.

При

вторично-активном, или сопряженном, транспорте энергия

АТФ расходуется на создание различных градиентов (концентра-

ционного,

электрического), а уже за счет уменьшения величины

ранее созданных градиентов идет противоградиентный транспорт

данного иона или молекулы вещества. В ряде случаев перенос ионов

молекул одного вещества происходит в зависимости от ионов и

молекул

другого

соединения с использованием энергии АТФ (рис.

4.23).

% 7б. Движущие силы мембранного транспорта

Движущими силами пассивного переноса веществ через мембра-

ну

служат

градиенты:

1) концентрационный - для нейтральных молекул;

2) электрохимический - для ионов;

207

Сопряжение

на переносчике

Сопряжение

через

Л рН

Сопряжение

через

Л Ф

Рис. 4.23.

Сопряженный

транспорт

ионов

веществ

через

мембраны:

а -

апикаль-

ная

мембрана

клеток

эпителия;

б -

внутренняя

мембрана

митохондрий;

е~ -

поток

электронов

по

дыхательной

цепи

3) осмотический и градиент гидростатического давления - для во-

ды;

4) градиент парциальных давлений - для газов.

Часто наблюдается суперпозиция градиентов. В этом

случае

дви-

жение ионов зависит от результирующей силы, что было зарегист-

рировано

при развитии потенциала действия нерва и мышцы. При

изменении

проницаемости мембраны для ионов их направленное

движение по каналам идет по концентрационному градиенту.

Разница

в величинах гидростатического и осмотического давле-

ний

в артериальном и венозном концах капилляра направляет вы-

ход воды из капилляра в артериальной его части и обратный пере-

нос

из тканей в венозный участок капилляра. Для направленного

движения молекул газов в биомембране определяющим является

градиент парциальных давлений (напряженность), существующий

на

мембране. Во

всех

перечисленных случаях движение нейтраль-

ных молекул и ионов идет по градиенту, "под

гору",

в соответствии

со вторым началом термодинамики с возрастанием величины энт-

ропии,

уменьшением локальной свободной энергии.

При

сопряженном транспорте движение ионов или молекул одно-

го вещества происходит против концентрационного градиента этого

соединения

или за счет движения

других

ионов по градиенту кон-

центрации.

7в. Механизмы пассивного мембранного транспорта

Пассивный

транспорт через мембрану происходит за счет кон-

центрационного

градиента для молекул неэлектролитов и за счет

электрохимического градиента для ионов. Этот вид переноса ве-

ществ осуществляется путем простой и облегченной диффузии. Для

ряда ионов облегченная диффузия реализуется в водных каналах,

образуемых крупными молекулами белка. Облегченная диффузия

может осуществляться подвижными переносчиками, которые пере-

208

водят комплекс после взаимодействия с переносимыми молекулами

или

ионами в жирорастворимое состояние. Образовавшееся соеди-

нение

проходит по градиенту концентрации на противоположную

сторону мембраны, где происходит отщепление переносимой моле-

кулы от переносчика и переход ее из липидной фазы в водную сре-

ду. Изменение свободной энергии AG системы равно:

AG = RTlny =

2,3RTl^-,

где R - универсальная газовая постоянная; Т - абсолютная темпера-

тура;

ci и С2 - концентрации веществ по обе стороны мембраны.

Если

транспортируется заряженная частица, то изменение сво-

бодной энергии переноса вычисляют по формуле:

AG-2,3RTlg—+

z¥A<p,

где

2,3RTlgC2/ci

определяет изменение концентрационного гради-

ента, a zFA ф - электрического градиента; z - заряд иона, F - число

Фарадея,

А<р

- трансмембранная разность электрических потенциа-

лов.

Если

изменения локальной свободной энергии имеют отрица-

тельную величину, т. е. процесс идет "под

гору"

с уменьшением

концентрационного

и электрического градиентов, то это означает,

что транспорт веществ совершается пассивно. Если же величина AG

имеет положительное значение, т.е. локальная свободная энергия

возрастает, то это служит признаком активного транспорта.

В соответствии со вторым началом термодинамики самопроиз-

вольно процесс совершается в сторону уменьшения градиентов, их

выравнивания,

что связано с возрастанием энтропии, уменьшением

свободной энергии системы и переходом ее в наиболее вероятное со-

стояние.

Если

через мембрану перенесено dmA вещества А, то значение

определяется из уравнения:

dG- (/<IIA-/<IA) dmA.

уменьшением разницы электрохимических градиентов /гцл и

f*iA

скорость диффузии вещества А уменьшается и диффузия пре-

кращается,

если/iiiA-

/НА

Количественно процесс диффузии описывается формулой Тео-

релла для потоков вещества:

т-йП I

dt ' S '

где J - количество молей переносимого вещества А через площадку,

равную 1см за единицу времени (с) в перпендикулярном направ-

209

лении

к поверхности мембраны (размерность потока - моль/ (см

•с));

dm/dt - число молей вещества, переносимого за единицу вре-

мени;

S - площадь, через которую идет диффузия.

Для простой диффузии движение через мембрану идет за счет

концентрационного

градиента. Формулу Теорелла в этом

случае

можно записать

dt\ S dl,

где u - подвижность молекулы (см • с"

• Дж" моль); с - концен-

трация

вещества А в точке

в момент времени t.

Учитывая уравнение

ft -/*o

RTlgc,

тд,е/л

- концентрационный химический потенциал

„мо

- стандартный

химический потенциал, можно получить выражение для первого

закона

Фика:

dm 1 _

dt S~ dx'

В условиях стационарного устойчивого состояния вместо произ-

водной от концентрации dc/dx используют разность концентрации

вещества вне и внутри клетки, деленную на толщину мембраны:

где Се и Cj - соответственно концентрации вещества снаружи и внут-

ри

клетки; 1 - толщина мембраны.

учетом

же коэффициента распределения вещества в воде и

мембране)? получают

где Р -коэффициент проницаемости вещества, определяемый по

формуле:

--£

Величина проницаемости мембраны для веществ при простой

диффузии зависит от коэффициента диффузии в мембране (D) и

коэффициента

распределения ф ) их

между

водным раствором и

липидной

фазой биомембраны.

Зная

разность концентраций Се и ci и измерив величину потока J,

можно вычислить значение коэффициента проницаемости по фор-

муле

J-P(Ce-G).

Проницаемость

мембраны для воды определяется аналогичным

210